전신 자기 자극은 섭식 장애 마우스 모델에서 폭식과 유사한 섭식을 감소시킵니다

요약

전신 자기 자극(WB-MS)은 간헐적으로 맛있는 식단에 접근하는 폭식 급식 모델에 사용되었습니다. WB-MS는 시뮬레이션 중 일시적으로 섭취량을 줄였으나, 식사 섭취량은 변경하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 효과는 지속되지 않았으며, 치료 후 폭식과 유사한 행동이 다시 나타나 체중, 비밀도, 크로스포스 발현에 변화가 없었습니다.

초록

전신 자기 자극(WB-MS)은 간헐적으로 맛있는 식단에 접근하는 폭식 급식 모델에 사용되었습니다. WB-MS는 시뮬레이션 중 일시적으로 섭취량을 줄였으나, 식사 섭취량은 변경하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 효과는 지속되지 않았으며, 치료 후 폭식과 유사한 행동이 다시 나타나 체중, 비밀도, 크로스포스 발현에 변화가 없었습니다.

서론

폭식 섭취는 생리적 배고픔이 없는 상태에서 매우 맛있는 음식을 대량으로 빠르게 섭취하는 것이 특징인 조절 불균형 섭식 패턴입니다. 이는 폭식 장애(BED)의 핵심 특징으로, 비만과 대사 기능 장애와 강하게 연관된 상태입니다 ^1,2. 점점 더 많은 증거가 중변연계 보상 회로가 섭식 행동 통제 상실에 역할을 한다는 점을 강조하고 있습니다 ^3,4. BED는 점점 더 피질선충 신호 전달 장애로 개념화되고 있는데, 보상 관련 시스템과 집행 통제 시스템 간의 소통 조절 장애가 강박적인 음식 섭취를 촉진하는 현상입니다. 신경생물학적 수준에서, 중변연계 경로 내 도파민성 신호전달과 글루타메이트 입력은 인센티브 주목성 변화와 과도한 음식 욕구 증가에 기여합니다 ^5,6. 또한 GLP-1, 인슐린, 그렐린과 같은 말초 대사 신호가 이러한 회로와 상호작용하여 보상 가치와 섭식 행동을 조절합니다⁷. 최근 증거는 폭식과 유사한 행동이 NAc 내 신경 역학 변화와 연관되어 있으며, 여기에는 델타 및 쎄타 범위(2–8 Hz)의 저주파 진동이 포함되며^{, 이는 통제} 상실 이전의 보상 기대 및 갈망 상태와 연관되어 있음을 보여줍니다.

NAc는 변연계, 피질계, 운동계를 연결하는 통합 허브 역할을 하며, 동기 신호를 목표 지향 행동으로 번역합니다. 특히 반복적으로 맛있는 음식에 노출된 상태에서 이 시스템이 교란되면, 강박적이고 습관^{적인 섭취 패턴}이 촉진^됩니다. 간헐적으로 맛있는 음식에 접근하는 실험 모델이 폭식과 유사한 폭식을 안정적으로 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 NAc의 활성화 증가와 연관되어 강박적 섭식 행동에서 NAc의 역할을 뒷받침합니다(^11–14). 비침습적 신경조절은 수술 없이 뇌 활동을 변화시키는 기법을 의미하며, 경두개골 자기 자극과 같은 자기장 기반 접근법을 포함합니다^. 이러한 전략들은 신경정신질환에서 신경 흥분성과 네트워크 활동을 조절하는 능력으로 임상적으로 중요해졌습니다^16,17. 인간에서는 신경조절이 폭식 증상을 줄이고 행동 조절을 개선하며, 대사 조절에도 영향을 미치는 것으로 나타났습니다^18,19.

이 근거에 근거해 전신 자기 자극(WB-MS)은 강박적 섭식에 관여하는 회로를 조절할 수 있는 비침습적 치료법일 수 있습니다. 국포 기법과 달리, 저주파 자기장은 신경 흥분성과 분포된 뇌 네트워크에 영향을 줄 수 있어 NAc⁸과 같은 피질하 구조에 영향을 미칠 가능성을 시사합니다. 실험 연구에 따르면 이러한 장은 도파민성 및 글루타 마트성 신경전달 ^6,7,8,19를 조절하며, 보상 관련 회로에 영향을 미치는 그럴듯한 메커니즘을 제공한다. 하지만 폭식 행동에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 본 연구는 간헐적 섭취에 의해 유발된 폭식 유사 식사 마우스 모델에서 저주파 WM-MS의 효과를 평가하였으며, 음식 섭취량, 체중, 비지방 증가, 그리고 NAc에서의 c-Fos 발현을 평가하였다.

프로토콜

모든 절차는 멕시코 공식 실험동물 관리 및 사용 기준(NOM-062-ZOO-199)에 따라 수행되었으며, 국립 자치대학교(UNAM) 실험동물 관리 및 이용 기관 위원회(CICUAL)의 승인을 받았으며, 프로토콜 번호는 035-CIC-2023입니다. 연구에 사용된 모든 자료는 재료표에 명시되어 있습니다.

인구 정의 및 획득

출생 후 30일차(P30) 기준으로 총 30마리의 C57BL/6 마우스(암컷 9마리, 수컷 21마리)를 사용했으며, 초기 체중은 15–18g이었습니다. 쥐들은 각각 집 우리에 개별 수용되었는데, 통제된 환경 조건 하에 12시간 12분의 밝고 어두운 주기(오전 6시에 불 켜짐), 주변 온도는 23± 2°C, 상대습도는 70± 10%였습니다.

습관

P30에서는 동물들이 개별적으로 집 우리에 들어가 자유 롭 게 물과 일반 음식을 사용할 수 있게 되었습니다. 모든 우리에는 종이관으로 환경을 보충했고, 침구로는 나무 조각을 사용했습니다. 7일간의 습화 기간 동안 체중, 음식 섭취, 물 섭취량이 24시간마다 기록되었습니다.

폭식식 흡입

이 연구에서 사용된 실험 모델은 연구자들이 설명한 간헐적 폭식-섭취 패러다임을 기반으로 합니다^. 그룹 배정 전에는 모든 동물이 기준 변동성을 줄이기 위해 평균 체중(17g)으로 조정되었습니다. 동물들(N = 30)은 디지털 '스핀 더 휠' 도구를 사용해 무작위로 실험 그룹에 배정되었으며, 개별 피험자가 나열되어 순차적으로 세 그룹 중 하나에 배정되었습니다. 표준 그룹에는 여성(표준 여성 그룹, SFG; n = 3)과 남성(표준 남성 그룹, SMG; n = 7)이 포함되었으며, 이들은 표준 음식과 물을 지속적으로 이용할 수 있었습니다. 연속 접근군에는 여성(연속 여성 그룹, CFG; n = 3)과 남성(연속 남성 그룹, CMG; n =7)이 포함되었으며, 표준 음식, 물, 먹을 수 있는 음식(M&M)에 지속적으로 자유롭 게 접근할 수 있었습니다. 간헐적 접근군에는 여성(간헐적 여성 그룹, IFG; n =3)과 남성(간헐적 남성 그룹, IMG; n = 7)이 포함되었으며, 이들은 표준 음식과 물을 자유 롭게 이용할 수 있었고, 주 3회(월요일, 수요일, 금요일) 2시간(오후 4시부터 6시까지) 맛있는 음식을 제공받았다. 이러한 먹이 조건은 35일간 유지되었습니다.

전신 자기 자극(WB-MS)

이 자극 패러다임은 유사한 실험 조건에서 C57BL/6 마우스에서 저주파 전자기장(50 Hz, 1 mT)을 사용한 이전 연구를 바탕으로 선택되었습니다^20,21. WB-MS는 펄스 자기치료장치(Dhan 1000, 자기치료유닛)를 사용하여 50Hz에서 10가우스(1mT)의 사인파 교대 자기장을 생성하여 수행되었습니다. 자극 세션 시에는 쥐들이 각자의 홈 케이지에 개별적으로 보관되었으며, 케이지는 각 케이지의 양쪽에 있는 두 개의 전자기 판 사이에 배치되었습니다. 자기장 간섭을 피하기 위해 금속 부품인 와이어 케이지, 그리드, 물병 등이 자극 시 임시로 제거되었습니다. 이 구조 덕분에 동물들은 절차 내내 제약이나 추가 스트레스 없이 자유롭게 움직일 수 있었습니다.

실험의 일관성을 보장하기 위해 자극 세션과 비자극 세션 모두에서 동일한 취급 및 환경 조건을 유지했습니다. 통제 세션(15일차부터 21일까지)에는 자기 판을 동일하게 위치시키지만 비활성 상태로 유지하여 조작, 우리 조작, 환경 소음, 전자기 판 배치 등의 잠재적 영향을 제어했습니다.

WB-MS는 폭식 평가 기간(오후 4시부터 6시까지) 직전인 7일간 오후 3시 40분부터 4시까지 매일 20분 노출을 포함했습니다(실험 프로토콜 22일째부터 28일째). 29일부터 35일까지는 다시 자극 없이 세션을 진행한 후 먹이 섭취량을 평가했다.

지방 조직 수집

실험 프로토콜 종료(36일차 오전 8시)에 모든 실험 그룹에서 지방 조직을 수집하였습니다. SG는 암컷 3마리와 수컷 2마리(n = 5), CG는 암컷 3마리와 수컷 3마리(n = 6명), IG는 암컷 3마리와 수컷 4마리(n = 7)로 구성되었습니다. 모든 동물은 케타민(60 mg/kg)과 자일라진(5 mg/^kg)으로 마취되었으며, 발가락 꼬집기 자극에 대한 통각 반응이 없음으로 충분한 마취 깊이가 확인되었다. 그 후 No. 3 메스 칼날을 사용해 복부 하부, 서혜부, 중앙선 복부 부위를 관통하는 복측 중앙선 절개를 시행한 후, 피부를 부드럽게 측면으로 후퇴시켜 복강을 노출시켰습니다.

고나달, 후복막, 피하 지방 조직 저장소를 표준화된 조건에서 신중하게 식별, 해부, 절제하여 샘플 간 변동성을 최소화하였습니다. 해부 직후, 조직은 제조사 사양²³에 따라 검증된 보정 분석 저울(최대 용량 220g, 가독성 0.1 mg)을 사용해 무게를 측정했습니다. 모든 샘플은 실험적 일관성을 보장하기 위해 그룹 간 동일한 조건에서 처리되었습니다.

뇌 조직 준비 및 면역형광

쥐는 마지막 음식 섭취 후 90분 후에 안락사되었습니다²⁴. 뇌는 4% 파라포름알데히드로 심장 내 관류 후 채취되어 조직학적 분석을 위해 처리되었습니다. 코로나 뇌 절편(30 μm)은 −18 °C에서 유지된 냉동체를 사용해 아지드나트륨이 포함된 PBS에 보관하여 처리할 때까지 얻었습니다. 각 실험군의 수컷 동물 일부는 면역형광 분석을 위한 뇌 조직 준비에 할당되었습니다(SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), 나머지 동물들은 지방 조직 채취에 사용되었습니다. 이 차별 할당은 방법론적 요구사항에 따라 사전에 결정되었으며, 파라포름알데히드를 이용한 심장 내 관류는 지방 조직의 완전성 손상으로 인해 이후 지방 조직 채취와 양립할 수 없는 조직 고정을 초래합니다. 따라서 표본 분포는 전적으로 기술적 제약에 의해 결정되었으며, 실험 그룹 배정이나 생물학적 결과와는 무관했습니다.

c-Fos 면역형광을 위해 0.25% 돼지 가죽 젤라틴과 0.5% Triton X-100이 포함된 PBS에 희석된 마우스 단클론 항-c-Fos 항체(1:1000, sc-166940)와 72시간 동안 절편을 인큐베이션하여 차단 및 투과화 용액으로 사용했습니다. 1차 항체 배양은 실온에서 24시간, 이어서 4 °C에서 48시간 배양하였습니다. 인큐베이션 후, 절편을 PBS에 완전히 세척한 후, 동일한 용액에 희석된 당나귀 다클론 항생쥐 2차 항체(Alexa Fluor 488-접합, 1:500, AB_2338840)와 함께 2시간 배양했습니다. 마지막으로, 단편들은 마운팅 매체를 이용한 유리 슬라이드에 장착되었습니다.

이미지 획득 및 정량화

공초점 영상은 488 nm 레이저와 20배 대물렌즈가 장착된 현미경을 사용하여 수행되었습니다. Z-스택 이미지는 NIS-Elements C 소프트웨어를 사용해 수집되었으며, 블라인드 분석을 위해 부호화된 식별자 아래에 저장되었습니다. c-Fos-양성 핵의 정량화는 ImageJ(ImageJ 2.9.0 / 1.53t)를 사용하여 수행되었습니다. 완전히 포함된 핵만 포함되었으며, 개별 세포의 중복 세기를 방지하기 위해 사분면 기반 접근법이 적용되었습니다. 각 동물에 대해 모든 실험군에서 동일한 획득 매개변수를 사용하여 세 개의 독립적인 면역염색 절편 각각에서 한 장씩의 이미지를 획득했습니다. c-Fos-양성 핵의 수는 각 이미지별로 개별적으로 정량화되었고, 동일한 동물에 해당하는 세 구간에서 얻은 값을 합산했습니다. 이 총 값은 이후 전체 분석된 면적과 정규화되어 c-Fos 밀도(양의 핵/mm²)로 표현되었습니다. 사용된 실험 절차의 전체 회로도는 그림 1A–H에 나와 있습니다.

그림 1: 폭식 유사 식사 프로토콜 및 WB-MS 중재의 실험 설계 및 타임라인. (A)는 초기 서거 환경을 나타내는 마우스의 대표적 이미지를 보여준다. 총 30마리(암컷 9마리, 수컷 21마리)가 P30부터 개별적으로 가정 우리에 방어되어 1주일간의 익숙화 기간을 거쳤습니다. (B) 실험 1일째부터 35일차까지 폭식과 유사한 프로토콜 전반에 걸쳐 적용된 식이 조건을 보여줍니다. 대조군은 표준 식사와 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 연속 접근 그룹은 표준 식량, 물, 먹을 수 있는 음식에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 간헐적 접근 그룹은 표준 식사와 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 동시에 맛있는 음식은 월요일, 수요일, 금요일 오후 4시부터 6시까지만 제공되었는데(C), 이는 15일부터 21일까지는 동물들이 동일한 식이 조건 하에 계속 먹었고, 자기 자극판이 케이지 아래에 놓여 자극을 주지 않았음을 나타냅니다(가짜 노출). (D)는 22일부터 28일째까지, 각 그룹의 식이 조건을 유지하면서 먹을 수 있는 음식 노출 20분 전에 WB-MS를 투여했음을 보여줍니다. (E)는 29일부터 35일째까지 WB-MS가 중단되었으나, 식이 상태는 변하지 않았음을 나타냅니다. (F)는 출생 후 72일(P72)에 뇌가 채취되었고, 이후 출생 후 73일(P73)에 지방 조직이 채취되었음을 보여줍니다. (G) 냉동조절기와 면역조직화학적 절차를 이용한 뇌 절절 시술을 보여줍니다. 마지막으로, (H)는 c-Fos 면역반응성에 대한 공초점 현미경 분석을 보여줍니다. 이미지는 저자들이 Biorender를 사용해 제작했으며, 적절한 라이선스를 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

통계 분석

통계 분석은 SPSS 버전 25를 사용하여 수행되었습니다. 정규 분포를 가정할 수 없었기 때문에, 연구 전반에 걸쳐 비모수 검정이 사용되었습니다. SG, CG, IG 간의 차이는 Kruskal–Wallis 검정을 사용하여 평가되었습니다. 각 실험군 내에서 반복 비교를 프리드먼 검정으로 분석한 후, 적절할 경우 다중 비교 검정을 시행하였습니다. 특정 실험 평가변수, 특히 암컷의 경우 표본 크기가 제한적(n=3개) 때문에, 수컷과 암컷 C57BL/6 마우스의 데이터를 통합 분석하여 그림 2, 그림 3, 그림 4 에 제시된 분석에 통계적 견고성을 높이고 실험 결과의 탐색적 평가를 지원하였습니다. 또한, 수컷과 암컷 C57BL/6 마우스의 폭식 유사 섭취 데이터를 양측 ANOVA와 다중 비교 검사를 통해 실험군과 WB-MS 자극 주간 동안 수유 프로토콜 전반에 걸친 효과를 평가하였습니다. 통계적 유의성은 p ≤ 0.05로 정의되었습니다.

결과

폭식 기간 내내 간헐적 접근군(남성 IMG, 여성 IFG) 대상 대상자들은 15일, 17일, 19일차에 표준군(SFG 및 SMG) 및 연속군(CFG 및 CMG)보다 유의미하게 높은 칼로리 섭취를 보였습니다(Kruskal-Wallis test; p < 0.05; 그림 2A–B). WB-MS는 1 mT의 강도와 50 Hz 주파수로 7일 연속 하루 20분씩 투여되었으며, 회색 밴드로 표시되었습니다. 이 자극 단계 동안, 자극 후 26일째에 칼로리 섭취량이 눈에 띄게 감소하는 경향이 관찰되었습니다(Kruskal-Wallis 검정: IFG, p = 0.5510; IMG, p = 0.1683)에서 이 효과가 지속되지 않았음을 보여줍니다. 중요하게도, 두 그룹 모두 29일, 31일, 33일에 폭식과 유사한 섭취가 다시 나타났으며(Kruskal-Wall...

토론

본 연구 결과는 WB-MS가 간헐적으로 맛있는 음식에 접근함으로써 유도된 쥐 모델에서 폭식과 유사한 행동을 일시적으로 조절할 수 있음을 시사합니다. NAc에서 신경 활동에 유의미한 변화는 관찰되지 않았으나, 자극 기간 동안 간헐적 접근 세션 동안 맛있는 음식 섭취량이 점차 감소했으며, 최종 폭식 세션에서는 유의미한 감소로 절정에 이르렀다. 이러한 관찰은 자기 자극이 강박적 섭식 행동의 근본적인 강화 또는 동기 부여 과정에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 그러나 본 연구는 이러한 효과의 신경 기전을 직접적으로 특성화하기 위해 설계된 것이 아니라, 폭식 관련 질환에 대한 보완적 신경조절 접근법으로서 WB-MS를 실험적 탐구를 확장하는 데 목적이 있습니다.

이러한 관찰은 비침습적 뇌 자극 접근법이 비만 및 섭식 관련 장애에서 맛있는 음식 관련 신호에 대한 반응성을 감소시킬 수 있다는 이전 보고서와 일치합니다(

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ImageJ	imagej.net	Public Domain, BSD-2	소프트웨어. Java 기반 이미지 처리 프로그램. 국립 보건원 및 광학 및 계산 기기 연구소(LOCI, 위스콘신 대학교)에서 개발
Coverslips	Corning	2935	커버 글라스 24 x 50 mm (두께 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	마우스 항체의 돈키 폴리클로날 2차 항체
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	표준 사료. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	일상 조직학을 위한 냉동 절편기.
M&Ms 43.8g (Brown packaging)	M&M´s	NA	식감이 좋은 식품. 영양 성분 100g당 : 480 kcal, 지방 19g, 탄수화물 70g, 단백질 5.1g, 소금 0.13g 성분: 설탕, 코코아 덩어리, 탈지 우유 분말, 코코아 버터, 락토스, 전분, 우유 지방, 팜 지방, 글루코오스 시럽, 쉐아 지방, 안정제 (아라비아 고무), 덱스트린, 광택제 (밀랍, 카나바 왁스), 색소 (E100, 카민, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), 비트 뿌리 농축액, 유화제 (대두 레시틴, E445), 소금, 향료, 팜 커널 오일, 산화 방지제 (E306). (땅콩, 헤이즐넛, 아몬드 함유될 수 있음). 밀크 초콜릿은 최소 14%의 우유 고형분을 함유. 밀크 초콜릿은 코코아 버터 외에 식물성 지방을 함유.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	펄스 자기 치료 장치
PBS	MEYER	Monobasic 2415. Dibasic 2410.  NaCl S3014	나트륨 인산염 일수화물. 나트륨 인산염 헵타 수화물. 분자 생물학 등급의 결정질 나트륨 염화물.
Nikon Microscope	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	공초점 현미경
Polycarbonate mice cage	Orchid Scientific	EM01	WB-MS 노출용 비 강자성 폴리카보네이트 케이지, 완전히 투명하고 오토클레이브 (373 x 190 x 138 mm).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	케타민 주사용 용액
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	자일라진 주사용 용액
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	마우스 단일클론 항 c-Fos 항체
Laboratory balance	Sartorius		분석용 저울
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	면역 형광 (IF) 현미경에서 형광 신호를 보존하기 위해 형광 소실을 최소화하는 특수 제작된 안티페이드 장착 매체.
Glass slides	VELAB	VE-P30	한쪽에 프로스트 처리된 현미경 유리 슬라이드 26 x 76 mm (두께 0.8–1.1 mm)
Sodium azide		K 6048.0100	99% 나트륨 아자이드

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