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방법 논문

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

647 조회수

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DOI:

10.3791/70464

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2026년 5월 26일

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1State Key Laboratory of Swine and Poultry Breeding Industry, College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, 2Faculty of Pharmacy, Paris Cité University, 3Chengdu DosSense Biotech Co., LTD, 4TCM Prevention and Treatment of Metabolic and Chronic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Pig Production, Chongqing Academy of Animal Science, 6College of Animal Science and Technology, Southwest University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 처리 시간이 >90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

초록

지방 유래 줄기세포(ADSC)는 풍부한 공급원, 최소 침습적 채취, 다계통 분화 가능성, 면역조절 특성 덕분에 재생의학에서 이상적인 씨앗 세포로 부상했습니다. 이들의 응용 분야는 조직 수리, 질병 모델링, 세포 치료에 걸쳐 있습니다; 그러나 고생존율 ADSC의 효율적인 분리는 연구와 임상 번역의 발전을 위해 여전히 매우 중요합니다. 효소 소화와 피펫팅을 통한 기계적 해리를 결합한 기존의 격리 방법은 긴 처리 시간(1–3시간), 낮은 세포 생존율(종종 <70%), 배치별 상당한 변동성으로 인해 후속 실험에 영향을 미칩니다.

여기서는 이러한 도전 과제를 해결하기 위해 기계파와 효소 소화를 결합한 SoniConvert 시스템(기계파 기반 세포 분리 시스템)을 소개합니다. 이 시스템은 디지털 피드백을 통해 기계적 파동 매개 해리를 조절하는 마이크로프로세서 기반 제어 장치와, 지방 조직에 최적화된 조직 특이적 이완 시약(5–15분 배양)을 통합합니다. 이 방법은 조직을 단일 세포 현탁으로 빠르게 전환할 수 있게 하며, 기계적 해리를 3–9초 내에 완료할 수 있습니다.

이 시스템은 세 가지 장점을 제공합니다: (1) 효소 분해부터 초기 세포 분획 분리까지 핵심 분리 과정을 약 30분 만에 완료하는 초고속 처리(기존 방법 대비 >90% 감소); (2) 높은 생존율 보존, 트리판 블루 염색으로 세포 생존율이 80–95%로 확인되어 기존 프로토콜을 초과함; 그리고 (3) 단일 세포 현탁액이 1차 세포 배양, 유세포 분석, 세포독성 분석, 지방 유기체 생성 등의 요구사항을 충족하는 광범위한 호환성. 처리 시간을 단축하고, 세포의 무결성을 높이며, 변동성을 제한함으로써 이 시스템은 지방 관련 연구를 위한 실용적인 플랫폼을 제공합니다.

서론

지방 조직에서 분리된 간엽 줄기세포(MSC)의 중요한 하위 집합인 지방유래 줄기세포(ADSC)는 접근성, 최소 침습 채취, 강력한 증식 능력, 다중 계통 분화 잠재력, 강력한 파라크린 및 면역조절 특성 등으로 상당한 치료 잠재력을 보입니다 1,2,3,4 . 이러한 특성들은 ADSC를 재생 의학, 조직 공학, 면역치료 분야의 유망한 후보로 자리매김하게 했습니다. 그러나 ADSC의 번역적 유용성은 기능적으로 온전하고 순도가 높은 집단을 분리하는 능력에 달려 있는데, 이 과정은 여전히 기술적으로 도전적입니다. 지방 조직의 독특한 생물학적 특성은 두 가지 주요 장애물을 도입합니다: (1) 지방세포의 높은 지질 함량은 기계적 가공 중 파열에 취약하며, 이를 통해 기질 혈관 분획(SVF)을 오염시키고 세포 생존력을 저해하며 생성하는 자유 지질이 방출됩니다 5,6; 그리고 (2) 조직의 구조적 복잡성, 즉 근막, 내피세포, 면역세포,혈액 구성 요소로 구성되어 지방 유래 세포 분리를 복잡하게 만듭니다. 이러한 한계는 대사 질환 모델링과 세포 기반 치료와 같은 후속 응용에 똑같이 중요한 고품질 ADSC와 지방세포를 분리하기 위한 효율적이고 신속하며 생존성 보존 방법의 긴급한 필요성을 강조합니다.

지방 유래 세포를 분리하는 데 현재 효소 소화, 외부 배양, 기계적 분리 8,9,10 등 여러 확립된 방법이 있습니다. 가장 널리 채택된 접근법인 효소 소화는 콜라게나제를 이용해 세포외기질(ECM) 성분을 분해하여 캡슐화된 줄기세포를 방출합니다. 이 방법은 일반적으로 조직 다짐, 콜라겐제 소화(37 °C, 1–2시간), 원심분리를 통한 SVF 분리, 그리고 부착 배양 정제를 포함합니다. ECM 분해에는 효과적이지만, 효소 소화는 처리 시간이 길어(총 3–4시간), 대량의 샘플 의존, 그리고 동물 유래 콜라겐아제로 인한 효소 세포독성 또는 배치별 변이 위험 등 임상 번역을 방해하는 단점이 있습니다. 조직 조각에서 줄기세포를 이동시키는 엑스플랜트 배양은 생존력이 보존된 세포를 얻지만, 낮은 처리량과 7–10일간의 세포 회복 지연이 있습니다. 기계적 해리(기계적 해리)는 물리적 교란(예: 진동, 전단)에 의존하여 처리 시간을 줄이지만, 종종 세포 무결성을 저해하여 생존 능력 저하와 불순한 개체군을 초래합니다. 이 방법들은 모두 효율성, 순도, 생존 가능성을 조화시키지 못하는데, 이는 임상용 세포 분리의 핵심 기준입니다. 따라서 우리는 효소 소화와 기계적 파동 매개 해리를 결합한 지방유래 세포(지방세포 및 ADSCs)를 분리하는 새로운 방법을 제안한다11. 이 접근법은 두 가지 주요 진보를 달성합니다: (1) 시간 효율성: 사전 최적화된 동물성 없는 효소 칵테일과 저주파 기계파를 결합하여 총 처리 시간을 3–4시간에서 ~30분으로 단축합니다(그림 1); (2) 생존성 보존: 부드러운 기계적 분산으로 지방세포 파열과 지질 방출을 최소화합니다. 중요한 점은, 30분 시간대는 핵 분리 작업 흐름(소화, 기계적 해리, 여과, 초기 원심분리)을 의미하며, 이는 조잡한 지방세포와 SVF 분획을 얻는 과정입니다; 적혈구(RBC) 용해와 같은 선택적 하위 정제 단계는 추가 처리 시간이 필요합니다.

우리의 최적화된 지방세포 분리 방법은 여러 연구 및 임상 분야에 적용될 상당한 잠재력을 보여줍니다. 기초 연구에서 얻어진 고생존성 세포는 지방 생성 및 골 생성 분화 연구에서 뛰어난 성능을 보여 조직 공학 응용에 신뢰할 수 있는 세포원을 제공합니다. 중개 의학 분야에서는 골관절염12, 심혈관 질환13, 다발성 경화증14, 염증성 장질환(IBD)/크론병15 등 질환 치료에서 ADSC의 치료 잠재력이 입증되었습니다. 빠르게 분리된 ADSC는 지방 조직 오가노이드 구축과 세포 치료 응용에 이상적인 구성 요소로, 약물 스크리닝과 질병 모델링 연구를 크게 발전시킵니다. 또한, 고품질 단일 세포 현탁액은 단일 세포 RNA 시퀀싱에 적합합니다. 결론적으로, 이 통합 접근법은 지방 조직을 위한 견고한 기술 플랫폼을 구축하여 재생 의학 분야의 기초 연구와 임상 번역을 지원합니다.

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프로토콜

모든 동물 연구는 중국 과학기술부 산하 실험 동물 관리 규정 (2017년 3월 개정)에 따라 수행되었으며, 쓰촨 농업대학교 동물윤리복지위원회(허가번호: 20230089)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 기계적 파동 보조 조직 해리를 위한 상업적으로 이용 가능한 장치인 SoniConvert 시스템의 사용을 요구합니다(이하 기계적 해리 시스템이라고 함). 이 프로토콜은 돼지 지방 조직에 최적화되어 있으며, 이 특수 장비에 의존하는 점이 주요 한계입니다.

1. 지방 조직 채취 및 준비

  1. 수술 전 소독 및 제모
    1. 펜토바르비탈 나트륨(체중 100mg/kg)을 정맥 과다 투여하여 돼지를 안락사시키세요. 조직 채취 전에 사망 확인.
    2. 돼지 등쪽을 중앙선에서 15cm 뻗은 나선형 소독을 위해 2% 요오도포르에 적신 멸균 거즈를 적용하세요. 30초 정도 건조하세요.
    3. 멸균 면도기를 사용해 16cm× 8cm 부위의 털을 면도하세요. 수술 부위의 모든 털을 제거하세요.
    4. 뒤쪽을 멸균 거즈로 75% 에탄올로 2번 닦으세요.
  2. 지방 조직 수집
    1. 멸균 메스로 등쪽 중앙선을 따라 20cm 횡방향 절개를 하세요.
    2. 멸균 겸자로 절개 가장자리를 들어 올려. 지방 조직과 진피 사이의 자연 평면을 따라 해부하여 약 2–3 mm 두께의 완전한 후피하 지방 조직(ULB) 상층을 얻습니다.
    3. ULB를 얼음처럼 차가운 멸균 식염수에 한 번 씻은 후 멸균 배양 접시에 넣으세요(그림 2).

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그림 2: 세포 분리를 위한 돼지 ULB 채집. (A) 피그백 지방 조직 구조 일러스트; (B) 바마 미니피그 절단 부위; (C) 후방 지방 조직의 전소, 피하 지방은 상층(ULB)과 내층(ILB) 두 층으로 이루어져 있습니다; (D) 수거된 ULB. 약어: ULB = 등의 상층; ILB = 등의 내층. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

정지 지점: 채취된 지방 조직은 4°C의 얼음처럼 차갑고 멸균된 식염수 또는 D-행크스 용액에 잠시 보관한 후 추가 해부를 할 수 있습니다.
참고: 목표는 ULB를 수집하는 것입니다. 해리 시 등 뒤 피하 지방 조직(ILB)의 하층을 포함하지 마세요.

  1. 지방 조직 해리 및 세척
    1. 접시에 1.8g의 조직마다 얼음처럼 차가운 D-Hanks 버퍼 10mL를 추가하고, 조직이 완전히 잠기도록 하세요.
    2. 멸균 수술용 가위를 사용해 조직에서 보이는 모든 혈관을 식별하고 절제하세요. 결합 조직과 섬유화 조직을 모두 제거하세요. 제거된 물질은 지정된 생물학적 위험 용기에 버려.
      참고: 날카로운 도구를 다룰 때는 극도의 주의를 기울이세요; 항상 몸에서 잘라내고, 사용한 칼날과 가위는 사용 후 즉시 날카로운 용기에 담아 버리세요.
    3. D-행크스 버퍼 안의 조직을 헹구어 잔여 혈액과 이물질을 제거하세요.
      참고: 과도한 혈종이 있는 샘플의 경우, 시각적 선명도를 위해 필요에 따라 완충액을 1–3번 교체하십시오. 모든 해부 과정을 얼음 위에 올려 조직 생존력을 유지하세요.
  2. 지방 조직의 기계적 해리
    1. 세척된 조직 조각 1.8g을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 튜브에 800 μL A형 조직 해리 버퍼(A-Buffer)를 추가합니다.
    2. 멸균 안과 가위를 사용해 튜브 안의 조직을 약 1–2 mm3 크기의 작은 조각으로 잘게 만듭니다.
      참고: 다진 중이나 후에 상당한 지질 누출이 관찰되면, 분해된 지방세포에서 지질을 제거하기 위해 효소 소화를 진행하기 전에 1mL의 미리 냉각된 D-Hanks 용액으로 조직을 다시 세척하세요. 이 단계는 지방세포의 무결성을 보존하여 후속 분석을 위해 합니다.

2. 세포 분리 및 균질화

  1. 효소 처리
    1. 새로운 미세원심분리관에 200 μL A형 조직 해리제(A형 용액)를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 회전시키고 손으로 3번 흔들어 내용물을 섞고, 지방 조각이 해리 용액에 완전히 잠기도록 하세요.
    2. 튜브 캡이 꽉 닫혔는지 확인하세요. 튜브를 37°C 금속 욕조에 넣고 5–10분간 배양합니다.
      참고: 용액이 탁해지고 조직 조각이 부분적으로 소화된 것처럼 보일 때까지 관찰하세요. A-타입 용액에는 콜라게나제와 중성 프로테아제가 포함되어 있습니다. 다룰 때는 니트릴 장갑, 실험실 코트, 안전 고글을 착용하세요. 피부 접촉을 피하세요; 노출이 발생하면 즉시 충분한 물로 15분간 헹구세요. A-Buffer는 A-타입 솔루션이 추가된 후 버려지지 않습니다.
  2. 초음파 보조 기계적 해리
    1. 부분적으로 소화된 지방 조직 조각과 주변 완충제를 마이크로 원심분리관에서 기계적 해리 시스템용으로 지정된 무균 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    2. 기계적 해리 시스템에서 지방 조직 사전 설정 프로그램을 실행하여 200 Hz 사인파를 사용해 기계적 해리를 수행하세요.

3. 단일 셀 현탁을 얻기 위한 여과

  1. 여과 및 원심분리
    1. 세포 현탁액을 수집하여 200 μm 세포 체를 통과시켜 새로운 50 mL 원심분리관에 넣어 큰 이물질과 소화되지 않은 조직 덩어리를 제거합니다.
    2. 프레셔너에 4 °C의 D-행크스 용액 5mL를 추가합니다. 셀 수율을 극대화하려면 D-Hanks 용액으로 체를 2번 헹군 것입니다.
    3. 여과된 셀 현탁액을 500 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
      일시정지: 원심분리 후 세포 현탁액은 즉시 처리하거나 층 분리 전에 잠시 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
    4. 지방세포 채취: 지방세포를 채취하기 위해 멸균 저스퇴르 피펫으로 상청액 지질층을 흡인하여 폐기하고, 지방세포층을 보호하기 위해 1mL의 완충제를 남깁니다. 지방세포의 후속 분석을 위해 두 번째 층을 수집합니다. 세 번째와 네 번째 층을 건드리지 마세요.
    5. 기질 혈관 분획(SVF) 채취: 상층을 제거한 후, 기질 혈관 분획(SVF)이 포함된 하단 펠릿을 1 mL의 D-Hanks/PBS에 부드럽게 재현탁합니다. 세포 펠릿을 1 mL의 D-Hanks/PBS에 부드럽게 재현탁하여 세포 농도를 2–5 × 106 cells/mL로 만듭니다.
      참고: 이상적으로는 원심분리 후 네 개의 층을 관찰할 수 있습니다: 상단의 지질층; 두 번째 층에는 지방 세포가 포함되어 있습니다; 세 번째는 친수성 완충층이며; 그리고 가장 아래층은 줄기세포를 포함하는 SVF(그림 1)입니다.
  2. 적혈구 용해
    1. 참고: 세포 펠릿에 뚜렷한 붉은색이 나타나 적혈구 오염을 나타내면 적혈구 용해를 시행하십시오.
      P1000 피펫과 넓은 팁을 사용해 세포 펠릿을 1–3 mL 적혈구(RBC) 용해 완충제에 재현탁합니다. 얼음 위에 15분간 부화시키고 가끔씩 섞어 주세요.
    2. 처리 중 대사 활동을 최소화하기 위해 모든 용액과 원심분리기 로터를 4°C로 예냉각하세요.
    3. 원심분리기로 500× g, 4°C에서 10 분간 돌 립니다. 상정액을 완전히 흡인하세요.
    4. 세포를 다시 세척하여 5mL 예냉된 D-Hanks 용액에 다시 부유시키고, 500 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요.
  3. 최종 정지
    1. 최종 셀 펠릿을 D-Hanks/PBS에 재현탁하여 후속 응용을 수행합니다.

4. 후속 응용 및 분석

  1. SVF 세포 생존 가능성 및 세포 수율 평가
    1. 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 얻은 SVF 세포 현탁액을 준비합니다. 사용 전까지는 서스펜션을 얼음 위에 보관하세요.
    2. 멸균 0.5mL 마이크로 원심분리관에서 10 μL SVF 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루 용액 10 μL을 혼합합니다. 균일하게 섞이도록 피펫을 위아래로 3번 부드럽게 움직입니다.
      참고: 혼합물 내 Trypan Blue의 최종 농도는 0.2%입니다. 혼합 시 공기 방울을 도입하지 마세요. 자동 셀 계수에 방해가 될 수 있습니다.
      착색된 세포 혼합물 10 μL을 자동 셀 카운터에 적합한 카운팅 슬라이드에 옮깁니다. 샘플이 챔버를 넘치지 않고 완전히 채우도록 하세요.
    3. 셀 카운터에 카운팅 슬라이드를 넣으세요. Trypan Blue 분석법을 선택하고 필요하다면 세포 농도 범위를 조정하세요.
    4. 자동 셀 카운팅을 시작하려면 카운트 버튼을 누르세요. 이 기기는 카운팅 챔버의 이미지를 촬영하고 자동으로 생세포와 죽은 세포를 구분합니다.
    5. 세포 생존 가능 비율을 기록하고 기기 화면에 표시된 생존 가능한 세포 총 수를 세세요. 각 샘플에 대해 세 번의 독립적인 측정을 수행하여 평균 생존력과 지방 조직 1g당 세포 수율을 계산합니다.
      참고: 샘플 간 교차 오염을 방지하기 위해 사용 후 카운팅 슬라이드와 기기 로딩 포트를 70% 에탄올로 청소하세요.
  2. 지방세포 형태 관찰
    1. 분리된 지방세포를 핵에 대해 5 μg/mL Hoechst, 지질에 대해 1 μM BODIPY를 D-Hanks/PBS에서 37 °C에서 15분간 염색합니다.
      일시정지: 염색 후 샘플을 신속하게 이미징해야 하며; 필요하다면 현미경 검사 전 4 °C 온도에서 잠시 빛으로부터 보호할 수 있습니다.
    2. 세포 압축을 피하기 위해 지방세포 친화적인 슬라이드 커버 유리 시스템을 직접 만들어 준비하세요.
    3. 핵(호에스트로 염색)과 지질 방울(BODIPY로 염색)을 형광 현미경으로 관찰합니다.
      참고: 크기가 크고(20–300 μm), 지질 함량이 높기 때문에 지방세포는 연약하고 떠 있으며 여러 층으로 쌓이기 때문에 기존의 마운팅 방식은 선명한 현미경 관찰에 적합하지 않습니다(그림 3A). 이를 해결하기 위해 표준 슬라이드와 커버슬립을 사용하는 지방세포 친화적 자작 장착 시스템이 개발되었습니다(그림 3B).
  3. 기질 혈관 구성 요소의 정제 및 ADSCs의 형태학적 관찰
    1. 갓 분리된 SVF를 5mL DMEM과 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 T25 세포 배양 플라스크에 씨앗을 뿌립니다. 37°C에서 5% CO₂로 배양하세요.
    2. 48시간 후에는 예열된 PBS로 플라스크를 2번 부드럽게 세척하여 비부착 세포를 제거합니다. 신선한 배양지를 추가하고 계속 배양하세요.
    3. 배양지는 2-3일마다 교체하세요. 거꾸로 현미경으로 세포 형태와 합류를 관찰하세요.
    4. 세포가 80–90% 합류(보통 7–10일 후)에 도달하면, 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA를 3–5분간 세포를 분리합니다. 배양액으로 중화시키고 세포 부탁액을 수집하세요.
    5. FACS 검출 및 분류 전에 트리판 블루 염색을 수행하여 세포의 생존 가능성을 확인하세요.
    6. 정제된 배양된 ADSC의 형태를 광학 현미경으로 관찰합니다.
    7. 수집된 세포 현탁액을 70μm 셀 체로 여과하여 남은 집합체를 제거합니다. 세포를 2% FBS가 포함된 PBS에 재현탁하여 FACS 분석합니다.
    8. CD73, CD90, CD11b, CD45에 대한 플루오로크롬 결합 항체로 세포를 4°C에서 어두운 환경에서 30분간 염색합니다.
    9. 세포를 염색 완충제로 2번 세척한 후 2% FBS가 포함된 PBS에 재현탁하세요.
    10. 70 μm 노즐, 20 psi, 유량 3.0 이하로 유동 세포 분석을 수행합니다.
    11. 전방 산란 영역(FSC-A)과 측면 산란 영역(SSC-A) 매개변수를 사용하여 주요 집단에 게이트하여 세포 잔해를 배제합니다.
    12. FSC-A 게이팅과 FSC-H 게이팅을 통해 이중항을 제거하고, 후속 분석을 위해 적합한 단글렛 집단을 선택합니다.
    13. 표면 마커 발현을 기반으로 게이트 세포를 분석합니다. ADSC 표현형을 검증하기 위해 CD73과 CD90을 양성 마커로, CD11b와 CD45를 음성 마커로 사용하세요.
    14. 광학 현미경으로 증축되고 배양된 ADSC의 형태를 관찰합니다. 특징적인 방추 모양의 섬유아세포 유사 형태는 성공적인 ADSC 농축을 나타냅니다.
  4. ADSC 지방생성 분화
    1. 3세대 ADSC를 1 ×10 4 cells/cm 2의 밀도로 씨앗을 종식합니다. 세포 합류율이 약 90%에 도달하면 지방 생성 유도를 시작한다.
    2. 고포도당 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)을 사용하여 지방생성 유도 배지를 준비하는데, 이 배지는 10% 태아 소 혈청(FBS), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 1 μM 덱사메타손, 10 μg/mL 인슐린, 1 μM 로시글리타존을 포함합니다.
    3. 유도 3일 후에는 유지용 배양지를 교체하고 용액은 2일마다 교체하세요.
    4. 유도 14일 후 세포를 오일 레드 O로 염색하고 역현미경으로 지질 방울을 관찰합니다.
  5. ADSC 골형성 분화
    1. 세포 합류율이 80–90%에 도달하면 골 유도를 시작한다. 10% FBS, 10 mM β-글리세로인산, 50 μg/mL 아스코르브산, 10 μM 칼시트리올, 1 μM 덱사메타손을 포함하는 고포도당 DMEM으로 골생성 유도 배지를 조제합니다.
    2. 매체를 2-3일마다 교체하고 약 14일간 유도 과정을 계속하세요.
    3. 세포를 2% 알리자린 레드 S(pH 5.2)로 염색한 후 거꾸로 현미경으로 관찰합니다.
  6. 오르가노이드 구성 및 식별
    1. 완전 배양 배지에 ADSCs의 단일 세포 현탁액을 준비하고 세포 농도를 2× 104 세포/20 μL로 조절합니다.
    2. 100mm 배양 접시의 뚜껑을 뒤집어 세포 현탁액 20μL 방울을 뚜껑 안쪽 표면에 투여합니다.
    3. 접시 바닥에 멸균 PBS를 넣어 습도를 유지하고, 뚜껑을 조심스럽게 덮은 후 매달린 방울을 표준 배양 조건에서 배양하세요.
    4. 매일 점검을 관찰하고 세포가 모여 구형 형태를 형성하도록 6일 동안 기다려 두세요.
    5. 피펫으로 구체를 부드럽게 채취한 후 얼음에 미리 차가운 마트리젤에 옮기세요.
    6. 구체를 마트리젤에 박고 배양판에 배양한 후 표준 배양 조건에서 배양합니다.
    7. 배지를 정기적으로 교체하고 18일에서 28일까지 오가노이드 성장을 관찰하여 구조가 조밀하고 성숙해집니다.
    8. 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 투과시키며, 5% BSA로 비특이적 결합을 차단합니다.
    9. CD73, CD90, CD11b, CD45에 대한 1차 항체로 샘플을 배양한 후, 해당 형광 2차 항체와 함께 배양합니다.
    10. 오가노이드에 Hoechst와 BODIPY를 염색하여 각각 핵과 지질 방울을 시각화하고, 염색된 샘플을 형광 현미경으로 관찰합니다.
      참고: 엄격한 무균 조건 하에 생물안전 캐비닛 내에서 세포 분류 및 개방 배양과 관련된 모든 조작(씨뿌리기, 먹이, 염색 준비 포함)을 수행하십시오.

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결과

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그림 1: 지방 유래 세포 분리 과정의 도식 . 도표는 전통적인 방법과 현재의 방법을 설명하는 워크플로우로 보여줍니다. 지방유래 세포를 분리하는 데는 세 가지 주요 단계가 있습니다: 첫 번째는 전처리; 두 번째는 지방 조직을 해리시켜 세포를 방출하는 것입니다; 마지막 방법은 여과와 원심분리로 세포를 분리하는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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토론

본 연구는 기존 방법의 중요한 한계를 해결한 지방유래 세포(주로 지방세포와 ADSC)를 분리하는 새로운 통합 접근법을 제시합니다. 조직 특이적 효소 이완과 정밀 기계적 파동 해리를 결합함으로써, 이 시스템은 빠르게(총 처리 시간 ~30분), 높은 생존율(80–95%), 그리고 재현 가능한 세포 분리를 달성합니다.

기존의 효소 소화는 널리 사용되지만, 콜라겐제 배양 기간(1–3시간)과 강한 기계적 피펫팅에 의존하며, 이로 인해 파열된 지방세포에서 지질 방출, 산화 스트레스, 그리고 이후의 생존 능력 상실(종종 <70%)이 발생합니다16,17. 반면, 저희 접근법은 이중 작용 메커니즘을 사용합니다: (1) 세포막을 손상시키지 않으면서 ECM 가교를 부드럽게 교란시키는 5–15분 짧은 배큐베이션, 그리고 (2) 정밀하고 ...

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공개 사항

저자 자오 자이와 지아잉 위는 SoniConvert 시스템(SC-L1W)과 이 프로토콜에 사용되는 지방 조직 해리 키트(TM008)를 제조하는 청두 도센스 바이오텍 유한회사와 소속되어 있습니다. 다른 저자들은 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학기금(Li M: 32421005 및 32225046, Lu L: 32472857)의 보조금으로 지원받았다. 중국 시장자치구(XZ202501ZY0147에서 M.L.까지) 과학기술프로젝트; 중국박사후 과학기금(Lu L: 2024M763881); 충칭 박사후 특별 자금 지원(Lu L: 2023CQBSHTB3098); 국가/성급 혁신 및 기업가 정신 학부 교육 프로그램(Lu L: 202510626001); 그리고 농업과학기술 주요 프로젝트가 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
타입 조직 해리 키트닥센스TM001유형 조직 해리 작용제(A형 용액)와 유형 조직 해리 버퍼(A-버퍼)를 포함하고 있습니다.
지방생성 분화 배지 키트오리셀GUXMD-90031지방생성 분화에 사용되며, 고포도당 돌벡코 변형 이글스 매체(변형되지 않음) 및 유지 매개체 포함
알리자린 레드 S오리셀A5533ALIR-10001골생성 분화를 위한 광물화 염색(pH 5.2)
아스코르브산시그마-올드리치A4544L-아스코르브산, 골 유도를 위한 세포 배양 검사
바마 미니피그청두 도시 실험동물 유한회사1살 된 수컷, SPF 등급 동물이 표준화된 예방접종, 구충, 청소 절차를 거치고 관리됩니다. https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863
04.html
바이오래드 TC20 자동 세포 계수기바이오-래드 연구소1450011생존 가능성 및 수확량 평가를 위한 자동 세포 계수기
몸써모피셔 사이언티브D3922중성 지질 염색
BSA (5%)시그마-올드리치A9418소 혈청 알부민, 동염 분말, 차단
칼시트리올시그마-올드리치C97561α,25-디하이드록시비타민 D3, 골 유도 목적
셀 체(70 & MU; m)코닝352350팔콘 70 & 뮤; FACS 샘플 준비를 위한 멸균 M 세포 체감
셀 스트레이너 (200 & MU; m)플루리 셀렉트43-50200-03pluriStrainer, PET 메쉬, 50mL 튜브에 맞고, 멸균 및 nbsp;
원심분리관 (50 mL)코닝352098팔콘 50 mL 고투명도 원뿔 튜브, 멸균, 폴리프로필렌
카운팅 슬라이드 (바이오-래드 TC20용)바이오-래드 연구소1450011TC20 자동 셀 카운터용 이중 챔버 카운팅 슬라이드;
배양 접시 (100 mm)코닝430167무균 폴리스티렌 접시, 매달린 방울 오가노이드 형성을 위한
덱사메타손시그마-올드리치D4902≥ 지방 생성 및 골 유도 98%
D-행크스 균형 소금 용액(PBS)깁코100100154도 및 4도까지 미리 냉각; C, pH 7.4.
DMEM깁코11965084이는 신선한 고리 SVF 배양에 사용됩니다
DNase I비요타임D7073선택 사항이며, 뭉치는 현상이 관찰되면 권장됩니다.
에탄올시그마-올드리치459836표면 소독은 75%입니다.
태아 소 혈청 (FBS)깁코A4736201테트 시스템 승인, 미국산, 멸균 및 nbsp;
플로우 사이토미터BD 생명과학BD FACS칸토 II3개의 레이저(405 nm, 488 nm, 633 nm), 8개의 형광 채널, 표면 마커 분석용(CD73, CD90, CD11b, CD45), 70 figure-materials-1m 노즐 요구량, 20 psi
형광 현미경올림포스FITC 및 DAPI 필터 세트를 사용할 수 있는 역방향 또는 직립형 모델.
형광 2차 항체써모피셔 사이언티브A-11001 (대쥐), A-11008 (대토끼)알렉사 플루오 접합, 면역형광
플루오로크롬 결합 항체 (CD73, CD90, CD11b, CD45)BD 생명과학561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)ADSC 표현형의 유세포분석
호에스트(Hoechst)써모피셔 사이언티브H3570생전/죽음 세포 평가를 위한 핵 염색.
IBMX시그마-올드리치I5879≥ 99% (HPLC), 지방 유도 배양액
얼음처럼 차갑고 멸균된 식리식염수백스터2F71240.9% 염화나트륨 주입, USP, 조직 세척
인슐린시그마-올드리치I9278효모 내에서 발현된 재조합, 지방생성 유도
요오포르시그마-올드리치251042% 소독제.
마트리젤코닝354230성장인자 감소, 페놀 적색 없음, 구형 내비를 위한 nbsp;
메탈 배스서비스바이오SMB-H37도 C에서 부화 용도로 사용.
오일 레드 O오리셀오일러-10001지방세포 분화를 위한 지질 염색
광학 현미경올림포스표준 밝시야 현미경(10x&ndash); 40배 목표.
골생성 분화 배지 키트오리셀GUXMD-90021골형성 분화에 사용되며, 고포도당 Dulbecco's modified Eagle's medium(변형되지 않음) 및 유지 배지를 포함합니다
넓은 보어 팁이 있는 P1000 피펫벡먼 쿨터B01113바이오멕 P1000 스팬-8 와이드 보어 팁, 멸균
파라포름알데히드 (4%)써모피셔 사이언티브J61899오가노이드 고정을 위한 수용액;
파스퇴르 피펫코닝7095S-5C멸균되고 일회용.
페니실린-스트렙토마이신깁코1507006310,000 U/mL 페니실린, 10,000 & mu; g/mL 스트렙토마이신, 멸균  
펜토바르비탈 나트륨히크마 제약스 USA 주식회사24201-010-20안락사를 위한 주사(체중 100mg/kg, 정맥 주사). 안다 203619 
1차 항체 (CD73, CD90, CD11b, CD45)BD 생명과학561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)오가노이드 면역염색을 위해
적혈구(RBC) 용해 버퍼솔라비오R1010필요하다면 후속 응용에 적합합니다.
냉장 원심분리기에펜도르프5702R원심분리 단계에 4 & 도C에서 사용됩니다.
로지글리타존케이맨 케미컬71740≥ 98%, PPAR와 감마; 지방 유도 작용제 작용제
샤프스 용기벡턴 디킨슨305270중고 칼날과 가위용 구멍 방지 용기
SoniConvert 단일 전지 현탁 준비 시스템닥센스SC-L1W조직의 기계적 해리에 사용됩니다.
염색 버퍼(유동 세포 염색 버퍼)eBioscience (Thermo Fisher Scientific)00-4222-57200mL는 즉시 사용 가능하며, 항체 및 세포 희석, 표면 염색 및 유동 세포 세척 단계에 사용되는 방부제로 FBS와 0.09% 아지드 나트륨을 함유하고 있습니다;
멸균 1.5 mL 에펜도르프 튜브에펜도르프30121.517세이프락 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균, 조직 다짐용.
멸균 배양 배양 배열코닝430167100 mm x 20 mm 멸균 배양 접시, 조직 채취용입니다
멸균 겸자스클라96-1719멸균 엄지 겸자, 톱니 모양, 조직 취급용.nbsp;
멸균 거즈두칼 코퍼레이션7060033소독과 닦기 위한 멸균 거즈 패드
멸균 안과 가위스클라10023-5801-2mm 두께로 조직을 다지는 데 사용하는 Vannas 스타일의 스프링 가위; 작품
멸균 면도기3M9681수술 부위 제모용 외과용 준비 면도기
멸균 메스인테그라 밀텍스4-415절개를 위한 멸균 일회용 메스
멸균 수술용 가위스클라10022-580혈관 및 결합조직 해리용 Merit 멸균 홍채 가위;
T25 세포 배양 플라스크코닝430639팔콘 T25 세포 배양 플라스크, 통풍 캡, 멸균
트라이톤 X-100 (0.1%)시그마-올드리치T8787실험실 등급, 투과화용;
트리판 블루깁코, 써모피셔 사이언티브15250061세포 생존성 계산에 대한 0.4% 해법.
트립신-EDTA (0.25%)깁코252000560.25% 트립신, 1 mM EDTA, ADSC 분리 시
&β;-글리세로인산시그마-올드리치G9422이나트륨 오하이드레이트, 골 유도

참고문헌

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돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리
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