여기서는 한천 희석법을 이용해 세프트리악손, 메로펜넴, 겐타미신과 함께 포스포마이신과 함께 카바페넴 내성 대장 균 분리주에 대해 시너지 효과를 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 메로펜넴과 겐타미신에서는 시너지가 관찰되었으나, 세프트리악손과는 그렇지 않았습니다.
리뷰 논문
카바페넴 내성 대장균에 대한 포스포마이신 기반 항생제 조합의 한천 희석 체커보드 분석 프로토콜
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이 논문에서
요약
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초록
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카바페넴 내성 장관박균에 대한 치료 옵션이 제한적으로 작용함에 따라, 복합 요법의 중요성이 점점 커지고 있습니다. 본 연구는 포스포마이신 내성률을 조사하고, 포스포마이신과 메로펜넴, 겐타미신, 세프트리악손을 병용하여 카바페넴 내성 대 장 균에 대해 상호작용하는 시험관 내 상호작용을 평가하는 것을 목표로 했습니다. Dicle 대학교 의과대학 병원 임상 병동 및 중환자실에서 다양한 임상 샘플(소변, 혈액, 흡인액, 상처, 뇌척수액, 기관내흡인액)에서 분리한 60개의 카바페넴 내성 대장균 이 연구에 포함되었습니다. 종 식별은 자동화된 미생물 식별 시스템을 사용해 수행되었습니다. 항생제 감수성 검사와 카바페넴 내성 확인은 에르타펜넴, 이미페넴, 메로펜넴을 이용한 디스크 확산을 통해 수행되었습니다. 포스포마이신 내성과 항생제 간 상호작용은 한천 희석으로 평가하였다. 또한, 한천 희석 기반 프로토콜을 사용하여 연속 2배 농도 구배에서 항생제 조합을 평가하고, 시너지, 무관심 또는 길항을 판단하기 위해 분수 억제 농도 지수(FICI)를 계산하였습니다. 내성률은 포스포마이신 76.6%, 메로펜넴 61.6%, 겐타미신 85.0%, 세프트리악손 98.3%였습니다. 포스포마이신–메르로펜넴 조합의 분리주 중 35%, 포스포마이신–젠타미신 조합의 33.4%, 포스포마이신–세프트리악손 조합의 1.7%에서 시너지 상호작용이 관찰되었습니다. 길항작용은 포스포마이신-메로펜엠 조합에서 단 한 가지 분리주에서만 검출되었습니다. 포스포마이신과 메로펜넴 및 겐타미신의 조합은 카바페넴 내성 대장균에 대해 시험관 내 시너지 효과를 보였습니다. 이러한 결과를 확인하기 위해서는 추가적인 시험관 내 연구가 필요합니다.
서론
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엔테로박터랄레스 계열은 매우 다양한 그람음성 박테리아 그룹으로 구성되며, 이들 중 다수는 임상적으로 중요한 존재입니다1. 그중 대장균 은 임상 미생물학 실험실에서 가장 자주 분리되는 종이며, 요로 감염, 상처 감염, 면역저하 환자의 폐렴, 위장염, 신생아 수막염 등 거의 모든 장기 시스템에 관련된 감염과 널리 연관되어 있습니다. 또한 그람 음성 패혈증과 내독소 매개 패혈성 쇼크의 주요 원인이기도 합니다. 인간 의학을 넘어, 대장균 은 중요한 수의 병원체로서, 말을 포함한 다양한 동물 종에서 호흡기 및 전신 감염을 일으키며, 인간과 동물 숙주에 걸친 대 장균 발병기전의 숙주 범위 관점을 확장합니다2,3,4.
확장 스펙트럼 베타락타마제(ESBL) 생성 장세균, 특히 대장균과 클렙시엘라 폐렴균은 사망률 증가, 장기 입원, 의료비 증가와 연관되어 있습니다. 항생제의 광범위한 사용은 이들 미생물에서 다중약물 내성(MDR)의 주요 원인입니다1. 내성 기전에는 카바페네마제 생성, ESBL, 아미노글리코사이드 변형 효소(AME), 퀴놀론 내성을 부여하는 돌연변이, 그리고 포린 및 배출 시스템의 변화가 포함됩니다. 대장균과 클렙시엘라 폐렴에서는 내성이 주로 플라스미드 매개에 의해 이루어져 수평 유전자 전달을 촉진합니다. 이러한 저항성 특성은 소 분리주를 포함한 동물 기원의 대장균에서도 점점 더 보고되고 있어 원 헬스 개념을 지지하고 잠재적 인수공통전염병 전파 위험을 시사합니다 2,3.
카르바페넴은 중증 다중제제 내성 감염의 마지막 단계로 간주됩니다. 그러나 카바페넴 내성 엔테로박테랄레(CRE)는 주요 전 세계 보건 문제로 부상했습니다. 이 내성은 주로 클래스 B 메탈로-베타-락타마제를 포함한 카바페네마제에 의해 매개되며, 광범위한 약물 내성 및 판 내성 표현형에 기여합니다.
MDR 대장균은 치료 옵션을 크게 제한하고 감염 관리를 복잡하게 만듭니다. 이는 임상 결과를 개선하기 위해 복합 요법과 같은 대체 치료 전략의 필요성을 강조합니다. 더불어, 이러한 내성 균주는 임상 환경뿐만 아니라 유제품과 같은 식품원에서도 점점 더 보고되고 있습니다. 이는 항생제 내성 확산의 역학적 맥락을 넓히고, 그 확산과 임상적 영향을 완화하기 위한 잠재적 전략으로서 병용 요법을 지지합니다 6,7. 아미노글리코사이드, 티게사이클린, 폴리미크신은 MDR 감염에서 일반적으로 사용되는 치료제입니다8. 포스포마이신은 특히 요로 감염에서 ESBL을 생성하는 대장균에 대해 활성을 보이기도 했습니다9.
1969년에 처음 발견된 포스포마이신은 초기 박테리아 세포벽 합성을 억제하며, 병용 요법에서 유망한 약물로 다시 부상했다10. 포스포마이신과 아미노글리코사이드 또는 β-락탐 간의 시너지 효과가 MDR 생물에서 보고된 바 있습니다11,12. 또한, 포스포마이신은 대규모 임상 코호트에서 단독 또는 병용 요법으로 중증 감염에 효과가 있음을 입증한 바 있습니다13. 그러나 대부분의 이전 연구들은 이질적인 박테리아 집단을 포함하고 있으며, 카바페넴 내성 대장균을 구체적으로 다룬 데이터는 여전히 제한적입니다.
표준 항생제 감수성 검사 방법에는 한천 희석, 육수 희석, 디스크 확산 등이 포함됩니다. 한천 희석 기반 결합 검사는 MICs를 결정하고 FICI를 계산하여 항균 상호작용을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다. 타임킬 및 그라디언트 확산과 같은 대체 방법은 동적 또는 단순화된 상호작용 데이터를 제공하지만, 재현성과 표준화에서는 다를 수 있습니다13,14. 이 프로토콜은 정의된 항생제 조합의 시험관 내 통제 평가에 가장 적합합니다. 그러나 이는 생체 내 약동학 조건을 완전히 반영하지는 않는다. 이 중 한천 희석은 MIC 결정의 기준 방법으로 간주되며; 그러나 카바페넴 내성 대장균에 대한 포스포마이신 복합 작용 평가에 대한 사용은 제한적입니다.
본 연구는 임상적으로 확인된 카바페넴 내성 대 장 균 분리주에 대한 포스포마이신 기반 조합의 체계적 평가를 제공합니다. 표준화된 한천 희석 체커보드 접근법을 사용하여 통제된 시험관 내 조건에서 직접 비교 상호작용 데이터를 생성하였습니다.
따라서 본 연구는 포스포마이신이 메로펜넴, 겐타미신 또는 세프트리악손과 병용하여 CRE 대장균 분리주에 대해 시험관 내 시너지 효과를 보인다는 가설을 검증합니다.
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리뷰 및 관점
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이 연구의 승인은 Dicle 대학교 의과대학 비중재적 임상 연구 윤리 위원회(결정 번호: 100, 날짜: 2021년 1월 1일)로부터 받았습니다.
아래 프로토콜은 카바페넴 내성 대장균 분리주에 대한 포스포마이신 조합 시너지를 평가하기 위한 표준화된 한천 희석 체커보드 방법을 설명합니다.
분리 식물 수집
2021년 2월 15일부터 12월 15일까지, Dicle 대학교 의과대학 병원 입원 환자들로부터 채취한 다양한 임상 표본(소변, 혈액, 흡인액, 상처, 뇌척수액, 기관내흡인액)에서 분리된 총 60건의 카바페넴 내성 대장균이 포함되었습니다. 식별은 MALDI-TOF 질량분석법 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 동일한 환자로부터 여러 분리주를 회수했을 때는 첫 번째 분리주만 포함되었습니다. 외래 클리닉 및 입원 48시간 미만 환자 샘플은 제외하였습니다. 연구 기간 동안 사전 정의된 포함 기준을 충족한 모든 카바페넴 내성 대장균 분리주가 연속적으로 포함되었으며; 따라서 표본 크기는 이용 가능한 적격 분리주 총수에 의해 결정되었으며, 사전 표본 크기 계산은 수행되지 않았습니다. 대장균 ATCC 13846과 대장균 ATCC 25922가 품질 관리 균주로 사용되었습니다. 품질 관리 균주는 동일한 한천 희석 조건에서 임상 분리주와 병행하여 시험되었습니다. 모든 런은 두 명의 독립 관찰자에 의해 평가되었습니다. 품질 관리 균주 결과는 모든 실험에서 예상되는 성장 억제 패턴을 보여주었으며, 범위를 벗어나거나 무효한 결과는 관찰되지 않았습니다.
임상 분리균을 포함한 모든 절차는 생물안전성 수준 2(BSL-2) 조건 하에 시행되었습니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑, 눈 보호구)를 착용했으며, 모든 조작은 인증된 생물학적 안전 캐비닛에서 진행되었습니다.
종 식별 및 항생제 감수성 검사
카르바페넴 내성 및 항생제 감수성 검사는 자동화된 미생물 식별 및 감수성 검사 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 시스템에서 검출된 카바페넴 저항성은 에르타펜넴, 이미페넴, 메로펜넴 디스크를 이용한 디스크 확산 시험을 통해 확인되었습니다. 구역 직경은 EUCAST 브레이크포인트16,17(표 1)에 따라 해석되었습니다. 모든 분리주는 20% 글리세롤이 포함된 트립티스 두유 육수에 보존되어 −20 °C에서 보관되었습니다.
표 1: 디스크 확산 시험(DDT)을 통해 E . coli 에 대해 결정된 카바페넴의 영역 직경 분쇄점. 카바페넴 감수성 검사에 사용되는 디스크 확산 해석 기준. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
소아 및 호기성 샘플에 적합한 혈액 배양 병은 자동 혈액 배양 시스템에서 배양되었습니다. 양성 병은 EMB 한천, 5% 양 혈액 한천, 사부로 금도당 한천에 아브리키하여 배양하였습니다.
소변 및 기관내 흡인액 샘플은 정량적 방법으로 배양되었고, 나머지 샘플은 반정량적 방법으로 처리되었습니다. 기관내 흡인 샘플은 그람 염색을 사용해 평가되었으며, 바틀렛 점수가 0>, 머레이 점수가 3인 샘플만이 유의한 것으로 간주되어18> 포함되었습니다.
상처 샘플의 경우 Q 점수 시스템에 따라 그람 염색 평가가 수행되었으며; Q 점수가 0 이상인 표본은19명을 포함하였습니다.
박테리아 분리주는 매트릭스 보조 레이저 탈착/비행 시간 질량분석법(Matrix-assisted laser desorption/이온화 시간 비행 질량분석법)을 통해 확인되었습니다. 속 및 종 수준 식별은 신뢰할 수 있는 점수로 간주된 점수는 ≥2.0이었고, 1.7에서 2.0 사이의 점수는 신뢰할 수 있는 속 수준 식별을 나타냅니다20,21. 점수 ≥2.0인 분리주 만 포함되었습니다.
한천 희석법에 의한 포스포마이신 감수성 결정
유럽 항생제 감수성 검사 위원회(EUCAST)에 따르면, 한천 희석법은 장내박터레아레스 계열 구성원의 포스포마이신 감수성을 판단하는 데 권장됩니다16.
포스포마이신 및 기타 항생제 작용액 제조
한천 희석법에는 분말 포스포마이신 디나트륨 염 하이드레이트가 사용되었고, 멸균 증류수를 사용해 희석을 만들었다. 각 항생제별로 EUCAST가 정한 MIC 한도보다 4배 낮거나 3배 높은 8가지 희석 용량이 계획되었습니다.
포스포마이신 스톡 용액(2560 μg/mL 포함)은 부피/무게/효능 공식(부피 (mL) = 무게 (mg) × 효능(μg/mg) 농도(μg/mL))로 계산하고 멸균 조건에서 무균 조건에서 무게를 측정하여 멸균 상태로 51.2 mg의 포스포마이신 디나트륨을 용해하여 제조했습니다. 최종 농도는 MHA를 첨가할 때 스톡 용액을 10배 희석하여 256 μg/mL로 계획되었습니다.
이에 따라 포스포마이신(2-256 μg/mL), 메로펜넴 및 젠타미신(0.125–16 μg/mL), 세프트리악손(0.0625–8 μg/mL)에 대한 희석 범위가 결정되었다.
희석은 멸균 원뿔형 튜브에서 10mL의 멸균 증류수를 포함한 연속 2배 희석으로 준비되었습니다. 총 7회의 연속 2배 희석이 튜브 내에서 수행되어 2 μg/mL 농도에 도달했습니다. 마지막 튜브에 남아 있던 10mL는 버려졌다. 이로 인해 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2 μg/mL의 8가지 다른 항생제 농도가 나왔습니다.
포스포마이신에 사용된 동일한 방법이 초기 스톡 용액을 준비하는 다른 항생제에도 사용되었습니다. 세프트리악손은 1.6mg, 메로펜넴과 겐타미신은 3.2mg을 정밀 저울로 측정하였다. 각 항생제마다 7번의 희석이 이루어졌습니다. 따라서 메로펜, 겐타미신, 세프트리악손에 대해 8가지 농도의 항생제 희석 농도를 얻었습니다(그림 1).
그림 1: 포스포마이신 희석액의 준비 단계. 작업 농도를 얻기 위해 연속 희석 단계를 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
한천 배지 제조
양이온 조정 뮐러-힌턴 아가(CAMHA)는 제조사의 지시에 따라 준비되었습니다. 121°C, 1기압에서 오토클레이브를 사용해 15–20분간 멸균한 후, 45–55°C에서 물욕탕에 보관했습니다.
모든 생물학적 재료는 폐기 전에 121°C에서 15–20분간 오토클레이빙으로 멸균되었습니다. 항생제 함유 폐기물은 기관의 생명안전 및 화학 폐기물 프로토콜에 따라 처리되었습니다.
중요한 단계: 항생제 첨가 전에 한천 온도를 45–55 °C 사이로 유지하세요. 과도한 열은 포스포마이신 활성을 감소시키고 MIC 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
G6P 추가
포스포마이신 감수성을 판단하기 위해 EUCAST는 한천과 육수 배지에 25 μg/mL의 포도당-6-인산(G6P)을 첨가할 것을 권장합니다. 한천 1리터당 25mg의 G6P를 20mL의 MHA에 용해한 후 여과하여 멸균한 후 주요 한천 배치에 혼합했습니다.
한천 희석 플레이트의 준비
포스포마이신, 메로펜넴, 겐타미신, 세프트리악손의 단독 MIC 값을 결정하기 위해 희석당 페트리 플레이트 1개(예: 포스포마이신은 2–256 μg/mL 범위의 8회 희석)를 사용했습니다. 항생제 농도는 판에 기록되어 있었다.
병용 연구에서는 포스포마이신과 다른 항생제 농도가 플레이트에 표시되었습니다(예: 포스포마이신 256 μg/mL, 메로펜넴 32 μg/mL). 따라서 각 조합별로 64개의 플레이트가 준비되었고, 사용된 포스포마이신과 다른 항생제 농도가 플레이트에 기록되었습니다. 단독 요법용으로 총 32장의 메로펜넴-겐타미시네트리 플레이트와 192장의 병용 치료를 위해 준비되었습니다. 대리석 표면 위에 56개의 작은 1cm 정사각형으로 구성된 표준 드로잉이 그려졌습니다. 모든 도면은 이 도면에 직접 접종되었습니다. 따라서 측정값과 접종이 표준화되었습니다(그림 2와 그림 3).
그림 2: 접종 및 읽기 목적을 위해 작성된 표준 도표. 접종 및 평가에 사용되는 표준화된 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 한천 희석판의 평가 방법. MIC 결정을 위한 박테리아 성장 평가. F = 포스포마이신; M = 메로펜엠. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
2밀리리터의 항생제 용액을 18mL의 용융 CAMHA와 혼합하여 최종 작동 농도를 얻었습니다. 제조사의 패키지 설명서에 따라 준비된 이 매체는 뜨거운 물에서 45−55 °C로 냉각되었습니다. 항생제 혼합물의 1부(2 mL)과 9 부(18 mL)의 MHA가 페트리 접시에 혼합되었으며(항생제는 1/10 희석됨), 최종 한천 플레이트 부피는 약 20 mL(18 mL 한천 + 2 mL 항생제 용액)로 표준화되었으며, 희석 후 최종 항생제 농도를 계산하였다. 이렇게 해서 한천 희석판에서 항생제 농도가 달성되었습니다(포스포마이신 2–256 μg/mL, 세프트리악손 0.0625–8 μg/mL, 메로펜넴과 겐타미신 0.125–16 μg/mL). 배지에서 항생제 용액 없이 준비한 플레이트가 성장 대조군으로 사용되었습니다(그림 4). 배지와 항생제 용액으로 구성된 혼합물은 상온에서 고체화되도록 방치했습니다.
그림 4: 항생제 용액 없는 대조 배지. 항생제가 없는 배지를 사용하여 박테리아의 생존 가능성을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
중요한 단계: 한천 깊이가 고르거나 항생제 혼합이 부족하면 MIC 해석이 부정확하고 상호작용이 잘못 발생할 수 있습니다.
분리균의 제제 및 접종
이전에 저장된 순수 품종은 5% 양 혈액 한천에 상온에서 전달되어 37°C에서 16–24시간 배양했습니다. 신선한 배양에서 나온 군집은 멸균 식염수에 부유되었고, 광학 리더기를 사용해 0.5 맥팔랜드 탁도를 얻었습니다.
한천 희석법은 각 점당 약 104 CFU의 박테리아 접종이 필요했습니다. 0.5 맥팔랜드 값에는 약 108 CFU/mL의 박테리아가 포함되어 있습니다. 용액을 멸균 생리식염수로 1:10으로 희석하여 박테리아 밀도 10.7 CFU/mL를 달성하였다.
각 박테리아 현탁액 2μL을 자동 피펫을 사용해 튜브에서 채취했습니다. 이 부피는 스팟당 약 2 × 104 CFU에 해당합니다. 접종은 한천 표면의 목표 부위에 시행되었으며, 포스포마이신 농도가 가장 낮은 플레이트부터 시작해 가장 높은 농도로 진행되었습니다.
따라서 접종은 각 점당 CFU로 정의되었으며, 각 접종 지점은 약 104 CFU를 포함합니다. 각 박테리아 현탁액의 접종은 15분 이내에 완료되었습니다.
포스포마이신 함유 플레이트에 접종하기 전에 성장 조절 플레이트를 접종하여 오염 여부를 확인했습니다. 접종은 실온에서 건조되었습니다. 유기성 조건에서 35–37°C에서 16–24시간 동안 배양이 수행되었으며, 탁도는 보정된 밀도계로 측정되었습니다.
과도한 접종 밀도는 지연 성장과 종점 결정의 어려움을 초래할 수 있습니다. 탁도를 0.5 맥팔랜드로 재조정하고, 합류가 일어나면 다시 접종을 합니다.
조합 시험
분말 항생제인 메로펜넴, 포스포마이신, 겐타미신, 세프트리악손, 포도당-6-인산이 사용되었습니다.
항생제 용량은 부피/무게/효능 공식으로 계산되었습니다. 재고 용액을 준비한 후, 감수성 MIC 범위보다 3회 2배 희석, 4회 낮은 2배 희석 농도로 항생제 용액을 준비했습니다. 희석 범위는 포스포마이신은 2–256 μg/mL, 세프트리악손은 0.0625–8 μg/mL, 겐타미신과 메로펜넴은 0.125–16 μg/mL로 계산되었습니다(표 2, 표 3, 표 4).
표 2: 포스포마이신-겐타미신 복합을 위한 항생제 용액 준비. 스톡과 작업 용액에 사용되는 준비 단계와 농도. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 3: 포스포마이신-메로펜넴 복합 항생제 용액 준비. 스톡과 작업 용액에 사용되는 준비 단계와 농도. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 4: 포스포마이신-세프트리악손 복합 항생제 용액 준비. 스톡과 작업 용액에 사용되는 준비 단계와 농도. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
본 연구에서는 한천 기반 시험 중 최종 희석 인자 차이를 보상하기 위해 단독 및 복합 실험을 위해 별도의 포스포마이신 스톡 용액을 준비하였습니다. 단독 요법 실험에는 표준 스톡 용액이 사용되었고, 항생제 프리믹스 시 추가 희석을 보상하기 위해 조정된 고농도 스톡 용액이 혼합 실험에 사용되었습니다.
연속 희석의 초기 단계로 정액이 준비되었습니다. 포스포마이신의 경우, 멸균 조건에서 분석 저울을 사용해 256mg의 분말을 정확히 계량하고, 멸균수 50mL에 지속적으로 혼합(자기 교반기)하여 완전히 용해될 때까지 용해하여 최종 농도는 5120 μg/mL의 포스포마이신 디나트륨을 얻었습니다. 젠타미신, 메로펜넴, 세프트리악손의 별도 재고 용액이 준비되었다.
연속 2배 희석을 위해, 25mL의 멸균 증류수를 담은 7개의 멸균 원뿔 튜브가 준비되었다. 기본 용액에서 25mL를 조절 가능한 피펫을 사용해 첫 번째 튜브로 옮긴 후, 이후 튜브로 순차적으로 옮겨 2배 연속 희석을 달성했습니다. 각 튜브는 각 이동 단계 후 5–10초간 소용돌이 믹서와 함께 충분히 혼합되었습니다. 최종 튜브에서 25mL를 버려 부피를 균등하게 유지했습니다. 이렇게 희석 시리즈를 얻어 최소 농도인 40 μg/mL를 얻었고, 총 8가지 농도의 포스포마이신을 준비하였습니다.
동일한 절차가 겐타미신, 메로펜넴, 세프트리악손에도 적용되었습니다. 그러나 표적 농도 범위 차이로 인해, 겐타미신과 메로펜넴 16 mg(0.125–16 μg/mL 범위)과 세프트리악손 8 mg(0.0625–8 μg/mL 범위)을 상온에서 무균 조건에서 각각 무게 측정 및 용해하였다. 앞서 설명한 대로 연속 2배 희석이 수행되었습니다. 최종 최저 농도는 겐타미신과 메로펜넴 2.5 μg/mL, 세프트리악손 1.25 μg/mL였습니다. 각 항생제마다 25mL 농도가 다른 8개의 튜브가 준비되었습니다. 포스포마이신이 세 가지 항생제와 병용되어 총 24개의 희석 튜브(8개× 3개)를 준비하였다.
한천 준비를 위해 18mL의 뮐러-힌튼 한천에 포도당-6-인산(25 μg/mL)을 45–50 °C로 미리 냉각한 후 멸균 페트리 접시에 투여했습니다. 이후 멸균 피펫을 사용해 포스포마이신 용액 1mL와 두 번째 항생제 용액 1mL를 추가하였습니다. 판들은 원형 회전으로 부드럽게 혼합되어 균일한 분포를 보장하고 상온에서 고체화되도록 했습니다. 동부피 혼합과 한천 첨가로 인해 항생제 농도가 약 9배 감소했습니다.
조합 검사를 위해 가장 낮은 포스포마이신 농도(40 μg/mL) 1mL를 8가지 겐타미신 희석액(2.5–320 μg/mL) 각각 1mL씩 섞은 후, 분리된 페트리 접시에 넣어 부드럽게 혼합했습니다. 같은 절차가 다음 포스포마이신 농도(80 μg/mL)에 대해서도 반복되었고, 5120 μg/mL까지 단계적으로 진행하여 모든 가능한 농도 조합을 시험했습니다. 교차 오염을 방지하기 위해 각 이식마다 새로운 멸균 피펫 팁이 사용되었습니다. 총 64개의 페트리 접시(8× 8가지 조합)가 조리되었습니다(표 5).
동일한 절차가 메로펜넴과 세프트리악손과 함께 포스포마이신과 함께 적용되어, 각 항생제 조합마다 64개의 플레이트가 생성되었습니다(표 6 및 표 7).
표 5: MHA 배지에서의 포스포마이신-겐타미신 조합 배열. 뮐러-힌튼 한천에서의 항생제 농도 배열. FF = fosfomycin; GN = 젠타미신. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 6: MHA 매개체 위의 포스포마이신-메로펜넴 조합 배열. 뮐러-힌튼 한천에서의 항생제 농도 배열. FF = fosfomycin; MEM = 메로펜엠. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 7: MHA 매개체 내 포스포마이신-세프트리악손 조합의 배열. 뮐러-힌튼 한천에서의 항생제 농도 배열. FF = fosfomycin; CRO = 세프트리악손. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
항생제 혼합물을 준비한 후, 각 플레이트에 18mL의 용융된 뮐러-힌튼 한천(45–50 °C)을 첨가하여 항생제 혼합물 1mL를 넣어 온도 조건이 항생제 활성을 저해하지 않도록 했습니다. 이로 인해 초기 항생제 용액이 약 9배 희석되었습니다.
체계적 평가를 위해 판은 체커보드(2차원 희석) 형식으로 배열되었습니다. 포스포마이신 농도는 수직축(A–H행)을 따라 정렬되었으며, A행에서 가장 높은 농도가 나타나고 H행으로 갈수록 농도가 감소했습니다. 두 번째 항생제는 수평축(1–8열)을 따라 배치되었으며, 1열에서 8열로 갈수록 농도가 점차 증가했습니다. 따라서 각 잘 동등한 위치는 두 가지 항생제 농도의 독특한 조합을 나타내어 상호작용 효과를 포괄적으로 평가할 수 있게 했습니다.
결과 평가
최소 억제 농도 결과는 EUCAST v.11 권고안에 따라 평가되었습니다. 성장 조절판에서는 눈에 띄는 박테리아 증식이 관찰되었고, 불임 조절판(비접종)은 증식이 없었습니다. MIC는 눈에 띄는 성장이 전혀 없는 가장 낮은 농도로 정의되었습니다. 조합 검사에서는 상호작용 효과를 FICI 값을 사용하여 해석했습니다. 시너지는 FICI ≤ 0.5, 무관심 0.5–4, > 4, 그리고 > 4로 정의되었습니다. 포스포마이신의 경우 MIC 수치가 32 μg/mL≤ 감수성으로 간주되었고, 32 μg/mL> 환자는 내성으로 간주되었습니다. 겐타미신과 메로펜넴(수막염 감염 환자)의 경우, MIC 수치가 2 μg/mL≤ 감수성이 있다고 판단되었고, 2 μg/mL> MIC 수치는 내성으로 간주되었습니다. 메로펜넴(비수막염 감염)의 경우, MIC 수치≤ 2 μg/mL가 감수성으로 간주되었습니다. 8 μg/mL> 값은 내성으로 간주되었고, MIC ≤ 세프트리악손(비수막염 감염)은 감수성, MIC ≤ 세프트리악손(수막염 감염)은 2 μg/mL, MIC > 세프트리악손(수막염 감염)은 내성16으로 간주되었습니다.
연구 데이터의 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.
통계: 범주 변수는 숫자와 백분율로 표현되었습니다. 모든 예상 세포 수가 ≥5인 비교에는 피어슨의 카이제곱 검정이 사용되었습니다. 피셔의 정확한 검정은 표본 크기가 적거나 예상 세포 수가 <5일 때 분석에 사용되었습니다. 구체적으로, 카이제곱 검정은 포스포마이신 내성률의 전반적인 비교에 사용되었고, 피셔의 정확 검정은 일부 조합에서 저빈도 분포로 인한 시너지, 가산, 길항성 상호작용률의 하위 그룹 분석에 사용되었다. P 값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.
해석 노트: 억제 영역 내의 작은 단일 군락은 반복 시험에서 합류하거나 재현 가능하지 않으면 성장으로 간주되지 않았습니다.
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결론
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총 60개의 카바페넴 내성 대장균 분리주가 연구에 포함되었습니다. 모든 분리주는 Dicle 대학교 의과대학 병원의 중환자실이나 임상 병동에 입원한 환자들로부터 채취되었습니다. 성인 환자가 전체 83.3%를 차지했고, 소아 환자가 16.7%를 차지했습니다(표 8 및 표 9). 다제제 내성이 80%(n = 48)의 분리주에서 관찰되었습니다.
표 8: 입원 위치와 연령에 따른 대장균 분리 분포. ICU = 중환자실. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
표 9: 샘플 유형별 대장균
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공개 사항
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저자들은 이해 충돌이 없다고 선언합니다.
감사의 글
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이 연구는 프로젝트 번호 SBE.21.004의 디클레 대학교 과학 연구 프로젝트 조정 단위(DÜBAP)의 지원을 받았습니다.
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