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방법 논문

골절 후 ICG 근적외선 영상 및 초음파를 이용한 림프 배출 평가

176 조회수

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DOI:

10.3791/70466

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2026년 6월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 5Shanghai Pudong New Area Hospital of Chinese Traditional Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인도시아닌 그린(ICG) 근적외선 영상과 초음파를 결합하여 골절 후 림프관 배출을 평가하여 쥐에서 족저 ICG 클리어와 슬와림프절 확대를 정량화합니다.

초록

외상성 골절은 종종 림프 배출 기능 장애를 동반합니다. 골절 후 림프절 배출량 감소와 림프절 확대는 급성 염증 반응과 면역 세포 모집의 지속적이고 역동적인 과정을 나타냅니다. 이 글에서는 가짜 또는 경골 골절 수술을 받는 쥐의 족저부위에 0.2 mg/mL 인도시아닌 그린 6 μL을 피피 내주입하는 방법을 설명합니다. 근적외선 형광 영상은 0시와 24시의 족저 ICG 신호를 정량하여 24시간 동안 정확률을 산출하여 쥐 림프 배출의 판독값을 산출했습니다. 동시에 초음파를 사용해 슬와림프절(PLN)을 3D 재구성하고, 양을 비교하며, 골절로 인한 확대를 평가하였습니다.  결과는 골절 후 림프관 제거율이 유의미하게 감소하고, 족저 부위의 ICG의 형광 강도가 현저히 높았으며, PLNs의 부피가 유의미하게 증가함을 보여주었습니다.  조직병리학적 절편이나 림프신티그래피와 같은 이전 림프계 측정 방법과 비교할 때, 이 방법은 생 체 내 동적이고 지속적인 관찰에 실패하는 경우가 많았으며, 이 방법은 높은 안정성과 재현성을 보여줍니다. 특히, 이 시스템은 림프 배출 기능의 동적 모니터링을 가능하게 하며, 골절 모델에서 림프류 역류 변화를 조사하는 데 강력한 기술적 지원을 제공합니다.

서론

외상성 골절은 종종 심각한 조직 손상과 부기를 유발하여 감염, 괴사, 골 비유합과 같은 합병증 위험을 높입니다1,2. Grzegorz Szczesny 등은 림프 배출 기능 장애가 조직 부종을 유발하는 것이 치유 지연과 연관되어 있음을 보여주었다. 연구에 따르면 골절 치유 과정에서 골 조직 수리 외에도 골절 부위의 림프계도 중요한 역할을 합니다. 림프관은 간질액을 배출하고 부종을 예방할 뿐만 아니라 면역 세포 이동을 조절하고 대사 노폐물을 제거하는 역할도 합니다. 그러나 골절 초기 단계에서는 TNF-α, IL-1, IL-6, 대식세포 콜로니 자극인자(MCSF)와 같은 염증성 인자가 림프 내피 세포를 손상시켜 퇴행, 부종, 섬유증과 같은 병리학적 변화를 초래할 수 있습니다. 관련 연구들은 뼈와 골막뿐만 아니라 주변 지방 및 근육 조직에도 림프성 내피세포가 존재함을 보여주었습니다. 더 나아가, 림프 배출은 골절 후 혈종의 미세환경 조절에도 관여합니다; 효과적인 림프 배출은 골세포의 생존과 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)의 증식을 촉진합니다7. 골절 동안 손상된 부위의 면역세포가 생성하는 염증성 인자(TNF-α, IL-1, IL-6)와 성장 인자(TGFβ1, PDGF)는 골아세포 세포자멸사와 BMSC 증식의 중요한 조절 인자입니다. 휴세인 아슬란과 다른 학자들은 림프성 부종이 골세포에 미치는 부정적 영향을 확인했습니다. 이러한 연구 결과는 골절 치유에서 림프 배출이 중요한 역할을 한다는 점을 강조합니다. 최근 ICG 근적외선(NIR) 형광 영상의 발전은 동물 모델과 인간 모두에서 림프류 역학을 비침습적이고 실시간으로 관찰할 수 있게 했습니다 9,10,11. 이 기법은 림프관 수축력, 배액 속도, 경로 완전성을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다10,11. 관절염과 염증의 마우스 모델을 이용한 연구에서는 ICG-NIR 영상이 급성 및 만성 림프 반응을 구분하여 조직 손상과 회복 과정에서 뚜렷한 배액 패턴을 강조할 수 있음을 보여주었습니다. 더 나아가, NIR 림프 영상은 수동 림프 배출 후 기능 회복 모니터링과 림프 표적 치료의 효능 평가에 효과적임이 입증되었습니다. 초음파는 배액 림프절의 형태와 부피, 그리고 림프 배출 장애와 관련된 조직 부종을 평가하는 보완적인 정량적 방법을 제공합니다. NIR 형광 영상과 초음파의 통합은 림프 기능과 해부학적 변화를 동시에 평가할 수 있게 하여, 생체 내 림프 역학을 조사하는 다중양식 접근법을 제공합니다. 외상 후 치유에서 림프 기능 장애의 중요한 역할에 대한 인식이 높아지고 있음에도 불구하고, 골절 후 림프 배출을 평가하는 표준화되고 재현 가능한 방법은 여전히 부족합니다. 현재의 많은 영상 방법은 침습적이거나 충분한 공간 해상도가 없거나 림프 흐름을 동적으로 모니터링하지 못합니다. 따라서 ICG-NIR과 초음파 영상을 결합한 프로토콜 개발은 이러한 방법론적 한계를 해결하고 림프 회복과 뼈 수리에 기여하는 효과를 평가하는 효과적인 도구를 제공할 것으로 기대됩니다.

본 연구는 ICG-NIR 형광 영상과 고해상도 초음파를 결합하여 쥐의 경골 골절 후 림프 배출을 평가하는 혁신적인 틀을 제시합니다. 이 접근법은 배액 효율의 반정량적 분석을 가능하게 하며, 골절 치유 과정에서 림프절의 부피를 측정할 수 있습니다. 하지만 몇 가지 한계도 있습니다. 첫째, ICG-NIR은 주로 표재성 림프관 평가에 사용되며, 더 깊은 구조에 대한 영상 능력은 제한적입니다. 둘째, 림프절 부피 변화는 일부 정보를 제공하지만, 특이성이 부족하여 직접적인 기능적 측정을 완전히 대체할 수 없습니다. 이 방법론은 상당한 번역 잠재력을 지니고 있으며, 뼈 재생에서 림프 기능에 대한 이해를 향상시킵니다.

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프로토콜

이 동물 실험은 상하이 모델 생물 센터의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). 이 연구에는 골절 모델을 가진 C57 수컷 쥐(6–8주)가 사용되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 전 관리

  1. 쥐를 최소 1주일간 자유롭게 적응시키고 , 음식과 물을 확보하세요. 컴퓨터가 생성한 무작위화 목록을 사용해 동물들을 골절 또는 가짜 그룹에 무작위로 배정합니다.
  2. 쥐를 동물용 온열 패드 위에 올려놓고 37°C의 일정한 온도를 유지하세요.
  3. 가스 마취기를 켜고 마우스를 유도 챔버에 2%–3% 이소플루란 농도로 5분간 넣어주세요.
  4. 유도 후에는 1%–2% 이소플루란으로 전환하고, 시술이 끝날 때까지 코 콘 을 통해 마취를 유지하세요.

2. 실험적 절차

참고: 마취 설정, ICG 용량 및 용량, 주사 부위 및 깊이, 노출 시간, ROI 정의, 초음파 스캔 매개변수를 모든 세션에서 표준화하여 동물 간 변동성을 최소화하세요.

  1. NIR-ICG 영상
    참고: ICG 근외선 영상의 단계별 절차는 그림 1에 나와 있습니다.
    1. 인도시아닌 그린(ICG) 0.2mg을 계량하여 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮긴 후 1mL PBS에 녹여 0.2mg/mL ICG 용액을 만듭니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호하세요.
    2. 영상 시스템을 켜고 FluoBeam v1.46을 실행하세요. 필요에 따라 카메라 높이를 조절하세요.
    3. 면봉에 75% 에탄올을 적셔 뒷발의 족저면을 소독하세요.
    4. 10 μL 마이크로 주사기를 사용해 ICG 용액 6 μL을 흡인합니다. 바늘을 족저 표면에 약 1mm 삽입하고 일정한 속도로 용액을 주입하여 전체 부피가 전달될 때까지 투여합니다.
    5. 소프트웨어에서 "카메라"와 "레이저" 기능을 모두 활성화하세요. "modify"를 클릭해서 새 폴더를 만들고 저장 디렉터리로 설정하세요. 이미지 획득 시 노출 시간을 0시간과 24시간으로 동일하게 유지하세요.
    6. 마우스를 카메라 아래에 엎드린 자세로 놓고, 모델링한 뒷다리가 시야 중앙에 위치합니다. 모델링된 뒷다리가 시야 중앙에 있는지 확인하세요.
    7. 노출 시간을 30ms로 설정하고, 0시간과 24시간 이미지 모두 동일하게 유지하세요. 주사 후 0시간과 24시간에 동일한 족저 주사 ROI의 이미지를 획득하여 ICG 신호 강도를 측정합니다. 노출 시간은 0시간과 24시간으로 동일하게 유지하세요.
    8. 뒷다리의 림프관이 시야에 뚜렷하게 보일 때는 "사진"을 클릭하여 이미지를 캡처하세요.
    9. 이미지 획득 후 데이터를 내보내고 이미지 분석 소프트웨어를 사용해 0시간과 24시간의 형광 강도를 정량화한 후 형광 제거율을 계산합니다.
    10. 이미지 분석 소프트웨어를 열어.
    11. 파일 → 열기를 클릭하여 형광 이미지를 가져오고, 같은 동물과 같은 검사일에 해당하는 0시간 족저 이미지를 열어보세요(그 후 매칭된 24시간 이미지를 열어보세요).
    12. 타원을 선택한 후 선택 → 편집 → 지정; Width = 30 , Height = 30을 설정하고, 타원을 선택한 후 확인(OK)을 클릭하세요.
    13. 원을 배경 영역 위에 배치하세요.
    14. 분석 → 측정을 클릭하고, 결과 창에 0시간 배경에서의 형광 강도(FI0hbg)로 평균 값을 기록하세요.
    15. 원을 목표 관측 지점 위에 놓고 '분석 → 측정'을 클릭한 후 결과 창에 평균 값을 FI0h로 기록하세요.
    16. 0시간에서 보정된 형광 강도를 보정 FI0h = FI0h − FI0hbg로 계산합니다.
    17. 매칭된 24시간 이미지를 열고 3–7단계를 반복하면 보정된 FI24h를 얻습니다.
    18. 배경 보정 형광 강도를 사용하여 제거율을 다음과 같이 계산합니다: 제거율 = [(FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%.
  2. B모드 초음파
    참고: 초음파 영상 및 림프절 경계 검사의 단계별 절차는 다음 문서에 나와 있습니다 그림 2.
    1. 초음파 시스템을 켜고, 트랜스듀서를 연결한 뒤, 뒷다리가 명확하게 보이도록 마우스를 위치시키세요. 연속 마취 상태에서 마우스를 영상 단계에서 엎드린 자세로 두고, 머리는 조작자와 반대 방향으로, 꼬리는 조작자를 향하게 합니다. 무릎을 굽혀 슬와가 위쪽으로, 약간 옆으로 향하게 하고, 변환기를 슬와와의 움푹 들어간 부분 위에 위치시킵니다.
    2. 모델링한 뒷다리에 초음파 결합 젤을 적용합니다.
    3. 트랜스듀서를 회전시켜 각도가 뒷다리의 종축과 평행하게 유지되도록 합니다.
    4. 스캔 거리를 4mm, 스텝 크기를 0.04mm로 설정하세요. 이미지에서 슬와림프절을 해부학적 위치에 따라 식별하세요.
    5. 꼬리와 모델링된 뒷다리를 양손으로 잡아 쥐를 안정시키세요. 트랜스듀서가 스캔하는 동안 동물을 움직이지 마세요.
    6. 이미지를 획득하세요. 슬와림프절은 중간 또는 약간 콩 모양의 작은 결절로 식별하며, 중간 또는 낮은 반향성으로 주변 지방보다 약간 낮고, 인접한 어두운 줄무늬 근육과 명확히 구분됩니다.
    7. 이미지를 3D 재구성 소프트웨어로 내보내 3차원 이미지 처리를 수행합니다.
    8. 초음파 영상 시스템 콘솔에서 3D 스캔을 완료한 후, 스캔을 3D 데이터셋으로 저장하고 동물 ID, 그룹 코드, 시간(0 / 24 h)을 기록합니다.
    9. 원본 폴더 구조를 변경하지 않고 획득 콘솔에서 분석 컴퓨터로 원시 데이터를 내보내기; 가능한 한 각 동물마다 각 시점마다 폴더를 하나씩 사용하세요.
    10. 3D 재구성 소프트웨어를 열어보세요.
    11. "Study"를 클릭하여 모듈에 입력하고, "Import"를 선택하세요.
    12. 데이터 폴더를 클릭하고, 가져올 데이터를 선택한 후 더블 클릭으로 열어보세요.
    13. 디스플레이 모드에서 "이미지 처리"를 선택→ "3D로 로드"→, "횡방향 뷰"→ "부피 측정" → "시작"을 선택하세요.
    14. 슬라이스 방향과 스텝 매개변수("복셀/간격")가 획득 설정과 일치하는지 확인하세요.
    15. 마우스 휠이나 슬라이더를 사용해 근위에서 원위 끝으로 스크롤하여 PLN이 처음 나타나는 단면을 식별하세요(보통 타원형이나 콩 모양의 구조로 나타나며, 주변 지방에 비해 약간 저반향적이며 경계가 비교적 명확합니다).
    16. PLN이 처음 나타나는 슬라이스에서 왼쪽 클릭으로 윤곽선을 시작하세요.
    17. 림프절 가장자리를 따라 닫힌 윤곽선을 한 점씩 따라 그려가며, 윤곽선을 외피와 최대한 가깝게 유지하고 주변 지방이나 혈관 내강이 포함되지 않도록 하세요.
    18. 마우스 휠을 사용해 PLN의 최대 단면적이 표시된 단면으로 이동한 후 10단계를 반복하여 두 번째 윤곽을 완성합니다.
    19. 마우스 휠을 사용해 PLN이 사라지기 직전 슬라이스로 이동한 후 10단계를 반복해 세 번째 윤곽을 완성하세요.
    20. "Finish"를 클릭하면 3D 분할된 부피를 생성하고 부피 측정값을 출력합니다.
    21. 결과 패널에 PLN 볼륨(mm3)을 기록하세요.
    22. 측정 결과 패널에서 "내보내기"를 선택하고 결과를 .csv 또는 .xls 파일로 내보내세요.
    23. 파일 형식을 선택하고 이미지를 TIFF 이미지 영역(.tif)으로 내보내세요.
    24. 분석 중에는 동물 코드와 시점만 표시하고, 그룹 할당(파절/가짜)은 표시하지 않으며, 모든 부피 추출이 완료되고 그룹이 통계 분석을 위해 해독될 때까지 블라인딩을 유지하세요.
  3. 통계 분석 소프트웨어를 이용한 통계 분석
    1. 새 테이블 및 그래프를 선택한 후 그룹화를 선택하세요.
    2. 데이터 입력 형식을 'Enter replicate values, sub columns로 쌓으세요.
    3. 1 / 7 / 14와 Sham / Fracture의 원시 값을 입력하세요. -그래프를 엽니다.
    4. 그래프 타입을 Scatter(개별 값) + 평균 + 오류 막대로 변경하세요.
    5. 축 포맷: Y축을 설정하고 축 제목을 변경하세요.
    6. 분석(Analysis)을 클릭하고 양방향 ANOVA를 수행하세요.
    7. 각 시점에서 샴과 파절을 비교해 보세요.
    8. 유의성 결과를 그래프에 추가하세요.

3. 수술 후 관리

  1. 실험이 끝나면 쥐를 온열 패드 위에 올려놓고 마취에서 회복할 시간을 줍니다.
  2. 상태를 면밀히 관찰하고, 이상이 없으면 다시 케이지로 돌려보내 계속 키우세요.

4. 평가

참고: 조사관에게 그룹 할당에 눈을 가리키고 이미지 획득 및 정량적 분석을 수행하도록 하고, 통계 분석이 완료될 때까지 모든 데이터셋을 코딩해 두세요.

  1. NIR-ICG 영상
    1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 마우스 발바닥에서 수집한 ICG 이미지의 형광 강도를 상대적으로 정량적으로 분석합니다.
      참고: 마우스 발판에서 ICG 제거율 계산 공식은 다음과 같습니다:
      정리율 (%) = [(FI0h – FI24h) / (FI0h)] × 100%
    2. 동일한 방법으로 각 측정값의 제거율을 기록하고, 림프 제거율과 시간 간의 관계를 통계 분석 소프트웨어를 사용해 분석하세요.
  2. B모드 초음파
    1. 3D 재구성 소프트웨어를 사용해 B모드 및 3차원 이미지를 분석하여 PLN 부피를 결정합니다.
    2. 통계 분석 소프트웨어를 사용해 산점도를 작성하여 림프절 부피의 시간에 따른 변화를 평가합니다.
  3. 통계 분석
    1. 1일, 7일, 14일에 얻은 반복 측정값을 양측 반복 측정 ANOVA를 사용해 분석합니다.

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결과

골절 모델 구축 후 1, 7, 14일째에 골절 그룹의 24시간 족저 ICG 형광 강도(FI24h)는 가짜 수술군보다 일관되게 높았습니다(그림 3). 수집된 족저 영상에서 ICG 형광 강도에 대한 상대적 정량 분석 결과, 골절군의 림프 ICG 제거율은 가짜 수술군보다 유의하게 낮았다(p < 0.05)(그림 4). 한편, 3차원 B모드 초음파 검사에서는 골절군 쥐의 슬와림프절 부피가 1일, 7일, 14일째에 대조군보다 유의하게 높았음을 밝혀냈습니다(p < 0.05)(그림 5). 이 결과는 림프절 제거율과 림프절 확대 사이에 높은 상관관계가 있음을 보여주었습니다.

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토론

이 프로토콜에는 쉽게 간과되기 쉬운 몇 가지 세부 사항이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 노출 시간은 고정되어 있지 않으며 특정 형광 강도를 기준으로 결정해야 합니다. 하지만 같은 쥐 그룹의 0시간과 24시간 노출 시간은 일정해야 하며; 그렇지 않으면 결과가 신뢰할 수 없을 수 있습니다. 초음파를 관찰할 때는 반드시 하체를 결합제로 완전히 덮어야 하며, 노출된 부분은 프로브가 해당 영역을 스캔할 때 결과 이미지에 왜곡을 일으킵니다. 스캔 중에는 쥐의 하체가 움직이지 않아야 합니다. 조작자는 한 손으로 하체를 부드럽게 당기고 다른 손으로 꼬리를 잡아 쥐를 안정시킬 수 있습니다. 이 단계는 특히 어렵지만 정확한 초음파 검사를 위해 매우 중요합니다.

ICG-NIR과 초음파는 다양한 연구 및 임상 맥락에서 널리 사용되지만, 관찰되는 특정 지표에 따라 매개변수가 달라질 수 있다는 점을 유의해야 합니다

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 국립자연과학재단(82174407 YJZ), 상하이 푸둥 신구 보건위원회 학과 리더 양성 프로그램(PWRd2020-05), 푸둥 신구 보건위원회 학과 리더 프로젝트(PWRq2020-56), 그리고 선전 산명 의학 프로젝트(번호)의 지원을 받았습니다. SZZYSM202311006).

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재료

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근적외선 이미징 시스템올림푸스MVX10올림푸스 MVX10은 근적외선 이미징에 최적화된 매크로 줌 형광 현미경 시

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