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연구 논문

셩두 핑무 포뮬러가 PI3K/AKT 신호 전달과 장내 미생물 조절을 통해 쥐에서 로페라마이드 유발 변비에 미치는 치료 효과

123 조회수

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DOI:

10.3791/70470

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2026년 5월 12일

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1Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, 2Guangzhou University of Chinese Medicine,, 3Shenzhen Luohu Hospital of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

이 연구는 셩두 핑무 포뮬러가 쥐의 변비를 완화하여 대변 수분 함량과 장 추진력을 증가시킨다는 것을 입증합니다. 이 효과는 PI3K/AKT 경로의 활성화, AQP3 및 AQP8의 상향 조절, 장내 미생물군 구성 조절과 관련이 있습니다.

초록

변비는 흔한 위장 질환이며, 현재 치료법에는 한계가 있는 경우가 많습니다. 전통 중의학에서 유래한 변형된 성두 평무 공식(SDPF)은 변비 치료에 임상적으로 사용되었으나, 그 작용 기전은 아직 명확하지 않습니다. 이 연구는 UPLC-Q/TOF-MS 분석을 사용하여 SDPF 내 188개 화합물을 확인했으며, 그중 50개가 확정되었습니다. 동물 실험에서 SDPF 처리는 장 추진력을 크게 향상시키고 대변 수분 함량을 증가시키며 첫 검은 변 발생 시간을 단축시켰습니다. 네트워크 약리학 및 분자 도킹 분석 결과, PI3K/AKT 경로의 관여가 의심되었고, 이후 이 경로의 상향 조절과 직장 내 AQP3 및 AQP8 발현 증가로 확인되었습니다. 더 나아가, 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과, SDPF는 락토바실러스 와 박테로이데스 와 같은 유익한 박테리아를 증진시키고 염증과 관련된 박테리아를 줄여 장내 미생물군의 항상성을 회복시켰습니다. 전체적으로 SDPF는 PI3K/AKT 경로를 조절하고 장내 미생물군을 조절하는 메커니즘을 통해 변비를 효과적으로 완화합니다.

서론

변비는 드문 배변, 긴장, 단단한 변을 특징으로 하는 광범위한 위장 질환으로, 전 세계 인구의 약 20%에 영향을 미치며 사회경제적으로 중요한 영향을 미칩니다.1. 만성 변비는 치질, 항문 열상, 대변 폐색과 같은 신체적 합병증을 유발할 뿐만 아니라, 불안과 우울증을 포함한 심리적 고통을 유발하여 환자의 삶의 질을 심각하게 저하시킵니다2. 삼투성 완하제와 식이섬유 보조제를 포함한 기존 치료법은 효과가 제한적이고 부작용이 잠재적이며 의존 위험 때문에 종종 최적이 아닌 결과를 낳습니다. 전통 중의학(TCM)은 한방 제제와 침술을 활용하여 기류와 내장 항상성을 회복하여 장 운동성을 조절하는 전체론적 접근법을제공합니다. 그러나 표준화된 프로토콜과 기전적 명확성의 부재로 인해 임상 도입이 폭넓게 제한됩니다. 신흥 연구들은 장내 미생물군 조절과 생리활성 TCM 유래 화합물과 같은 새로운 개입의 잠재력을 강조하며, 이는 부작용을 최소화하면서 장 기능을 시너지 효과로 향상시킬 수 있습니다5. 따라서 TCM 원리와 현대 약물치료를 결합한 근거 기반 통합 치료법 개발은 변비 관리에 혁신을 가져올 가능성을 지니고 있습니다.

느린 통과 변비(STC)는 기초 연구에서 중요한 병리학적 모델로, 인간 변비의 대표적인 운동성 장애인 유의미하게 지연된 대장 통과6을 효과적으로 시뮬레이션합니다. 이 기술은 변비의 분자 기전을 밝히기 위한 '디코더' 역할을 하며, 연구자들이 직장 조직7, 장신경계8, 카알9의 간질세포, 주요 신호 경로10의 병리학적 변화를 직접 조사할 수 있게 하여, 거시적 증상과 임상 연구가 닿지 않는 세포 및 분자 이상을 연결해 줍니다11. 국제적으로 STC 쥐 모델 개발을 위한 확립된 방법은 주로 화학적으로 유도된 접근법12, 특히 로페라마이드(말초 오피오이드 수용체 작용제로, 신경 활동과 아세틸콜린 분비를 억제하여 5–7일 이내에 지연 이동을 지속적으로 유도하는 방법)와 병인 모방 전략 13, 예를 들어 장기간 고용량 자극성 완하제 투여(이는 대장신경 손상, 흑색증 대장증)를 유발하는 방법12, 그리고 이후 완하제 의존성 대장 관성. 따라서 STC 쥐 모델은 변비의 복잡한 원인을 들여다볼 수 있는 창을 제공할 뿐만 아니라, 기본적인 기전적 통찰을 임상 응용과 연결하는 중요한 다리 역할을 합니다.

성두 평무 공식(SDPF)은 Radix Paeoniae Alba(바이샤오), Curcuma longa(장황), Rhizoma cibotii(탕고우지), Siegsbeckia orientalis L.(Xixiancao), Clematis chinensis Osbeck(Weilingxian)로 구성되어 있으며, 전통 중의학 이론에서 유래한 수정된 병원 제제로, 오랜 기간 우리 부서에서 관련 질환에 사용되어 왔습니다. 우리 병원의 예비 임상 관찰에 따르면 SDPF가 변비 증상 완화에 도움이 될 수 있다고 합니다(미공개 데이터). 연구에 따르면 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 장내 운동성 조절에 관여하며, 장내 미생물군과 그 대사산물이 장내 신경 및 평활근 활동을 조절함으로써 중요한 역할을 할 수 있음이 밝혀졌습니다15. 그럼에도 불구하고, 정확한 규제 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 우리는 PI3K/AKT 경로와 장내 미생물군이 함께 대장 운동성을 조절하는 필수 축을 형성한다고 제안합니다. TCM 제형이 대장의 운동 이상에 미치는 치료 효과가 PI3K/AKT 경로의 조절과 미생물군-장 축의 재균형과 관련이 있을 수 있다고 가설이 제기됩니다. 본 연구는 PI3K/AKT 경로와 장내 미생물군이 결장 운동성에 중요한 상호 의존 축으로 기능한다는 새로운 통합 가설을 제안하고 검증함으로써 이 격차를 해소합니다. 이 연구의 주요 목적은 SDPF가 느린 변비에 미치는 치료 효과가 이 축의 이중 조절을 통해 매개되는지 확인하는 것입니다. 특히 쥐 모델을 사용하여 SDPF가 주요 PI3K/AKT 신호 전달 단백질, 장내 미생물군 구성 변화, 대장 운동 기능에 미치는 영향을 조사했습니다. 이 복합 기전을 밝히는 연구는 미생물군-PI3K/AKT 축이 TCM 기반 개입의 통합 표적임을 입증하는 최초의 실험적 증거를 제공하여, 대장 운동성 장애 치료에 대한 보다 포괄적인 분자적 기반을 제시합니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 실험동물 관리 및 사용 지침(국립보건원, 2011년 개정)에 따라 수행되었으며, 산둥 중의학대학교 윤리심사위원회(복지윤리 면허 번호: SDUTCM20250421238)의 승인을 받았습니다.

SDPF 준비
허브 혼합물은 Radix Paeoniae Alba(Baishao) 20g, Curcuma longa (Jianghuang) 10g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30g, Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30g으로 구성되어 있습니다. 이 조합 비율은 임상 경험을 바탕으로 결정되었습니다. 이 조성은 먼저 고체와 액체 비율 1:9(g/mL)로 탈이온수에 30분간 담가두고, 그 후 60분간 끓여서 추출되었습니다. 생성된 용액은 즉시 거즈로 걸러진 후 4,500 × g 에서 5분간 원심분리하여 상원액을 수집했습니다. 잔류물은 동일한 조건(1:9 비율, 탈이온수)에서 두 차례 재추출되었으며, 각 추출마다 끓는 시간을 30분으로 줄였습니다. 세 번의 추출에서 나온 상청액은 모두 합쳐져 농축된 후 5일에서 7일간 진공 동결 건조되어 SDPF 분말을 얻었고, 이후 냉장 보관을 위해 추가 사용되었습니다.

SDPF의 구성 성분 분석
고체 샘플을 준비하기 위해 적정량의 균질화된 물질을 2 mL 원심분리관에 옮기고, 70% 메탄올 1mL와 3mm 스테인리스 스틸 비즈와 결합한 후 자동 분쇄기에서 3분간 처리한 후 10분간 소용돌이 처리를 했습니다. 액체 표본은 순수 메탄올로 희석되어 10분간 소용돌이 과정을 거쳤다. 이후 모든 샘플은 12,000 × g에서 4 °C에서 10분간 원심분리되었고, 생성된 상청액은 0.22 μm 필터를 통해 여과되었습니다. 기기 분석 전에 2-클로로페닐알라닌(내부 표준 100 μg/mL)을 여과액에 포함시켜 최종 농도가 1 mg/L로 달성되었습니다. 크로마토그래피 분리는 C18 컬럼(1.8 μm × 2.1 mm × 100 mm)을 갖춘 LC-MS 시스템에서 수행되었으며, 30 °C에서 0.3 mL/min의 유량으로 유지되었습니다. 이동상은 물 속 0.1% 개미산(A)과 순수한 아세토니트릴(B)으로 구성되어 있었습니다. 주입 부피는 2 μL로 설정되었고, 오토샘플러는 4 °C로 유지되었습니다. 질량분석법 검출은 다음 조건에서 양 및 음의 이온화 모드로 수행되었습니다: 히터 온도 325 °C, 외피 가스 45 임의 단위, 보조 가스 15 arb, 스윕 가스 1 arb, 전기 분무 전압 3.5 kV, 모세관 온도 330 °C, S-렌즈 RF 레벨 55% 모두. 데이터는 120,000 해상도의 풀스캔 MS 모드에서 100–1500 m/z 범위에서 수집되었으며, MS/MS 단편화는 60,000 해상도의 데이터 의존 획득 모드(dd-MS2, TopN=5)에서 고에너지 충돌 해리를 사용해 수행되었습니다.

동물 실험
72마리의 수컷 스프래그-도울리 쥐(6주, 초기 체중 180–200g; RRID: IMSR_JAX:000664)은 SPF 조건(24± 1°C, 12시간 빛/어둠 주기)에서 자유롭게 음식과 물을 이용할 수 있는 환경에서 수용되었습니다. 1주일 적응 후 체중에 따라 무작위로 6개 그룹(n=12/그룹)으로 나뉘었습니다: (1) 빈 대조군(정상 식염수), (2) 변비 모델 그룹(10 mg/kg 로페라마이드 하이드로클로라이드), (3) 저용량(SDPF-L), (4) 중량(SDPF-M)-, (5) 고용량(SDPF-H) 그룹(각각 6, 9, 12 g/kg), (6) 양성 대조군(2 mg/kg 모사프라이드 시트레이트). SDPF는 증류수에서 3, 4.5, 6 g/mL 농도로 신선하게 현탁액으로 제조되었고, 경구 간부주로 고정된 용량인 2 mL/kg으로 투여되었으며, 각각 6, 9, 12 g/kg의 용량에 해당합니다. 로페라마이드 하이드로클로라이드는 증류수에서 5 mg/mL 농도로 현탁액으로 신선하게 제조되고, 경구 가베지로 고정된 용량인 2 mL/kg(10 mg/kg에 해당)으로 투여되었습니다. 적응 1주일 후, (2) – (6) 그룹에서 로페라마이드 하이드로클로라이드를 하루 1회 경구 투여하여 1주일간 변비를 유도하였다. 빈 대조군은 동등한 양의 생리식식염수를 투여했습니다. 이후 일주일간 (3)–(5) 그룹의 쥐는 하루 1회 경구 개비지를 통한 SDPF 치료를 받았고, 양성 대조군(6)은 동시에 모사프라이드 시트레이트(2 mg/kg)를 투여했으며, (2)–(6) 그룹의 쥐는 변비 모델을 유지하기 위해 하루 1회 로페라마이드 하이드로클로라이드(10 mg/kg)를 계속 투여했습니다. 무표정 대조군은 계속 정상 식염수를 투여받았습니다. 치료 기간이 끝날 무렵, 모든 쥐는 하룻밤 단식하며 물을 자유롭게 마실 수 있게 했습니다. 그 후 동물들은 복막 내 주사로 펜토바르비탈나트륨(체중 40 mg/kg)을 투여했습니다. 발달 반사가 없다는 확인으로 확인된 깊은 마취 후, 쥐들은 경추 탈구로 안락사되었다. 즉시 직장 조직이 신속하게 채취되었다. 조직학적 및 면역조직화학적 분석을 위해 조직 구간을 4% 파라포름알데히드에 고정하였다. 단백질 발현 분석을 위해 조직 샘플을 액체 질소에 급동하여 -80 °C에서 보관하여 추가 사용을 기다렸습니다.

첫 번째 검은 변
첫 번째 검은 대변이 배출되는 시간은 그룹당 3마리의 쥐에 대해 기록되었다. 실험 전에는 모든 쥐가 12시간 동안 단식하며 물을 자유롭게 마실 수 있었습니다. 각 동물은 10 mL/kg 체중 용량의 준비된 잉크 현탁액(활성탄 5% 및 아라비 유미 5%)을 위내 투여를 받았으며, 투여 시간은 정확한 기록되었습니다. 비가베이지 후, 쥐들은 각각 따로 우리에 가두고 자유롭게 먹이와 물을 사용할 수 있게 되었다. 각 쥐에서 처음 검은 변이 나타날 때를 주의 깊게 관찰하고 기록하여 장 통과 시간을 계산했습니다.

대변 수분 함량
모델 구축에 성공한 후 처리 종료 시점에 각 쥐 그룹(n = 6)에서 2시간 이내에 배출된 신선한 대변 샘플을 채취하여 미리 무게를 측정한 건조 에너지 검사관에 넣었습니다. 배설물의 젖은 무게가 즉시 기록되었다. 이후 샘플은 건조 오븐에 옮겨져 60°C에서 36시간 동안 탈수되었습니다. 초기 건조 기간 후 샘플을 무게 측정하여 오븐에 다시 넣었고, 무게 측정을 2시간마다 반복하여 일정한 무게가 도달할 때까지 측정했습니다(완전 탈수 상태를 나타냅니다). 대변 수분 함량 비율은 다음 공식으로 계산되었습니다:

대변 수분 함량 (%) = [(습윤 무게 - 건조 무게) / 습윤 무게] × 100%

장 추진율
12시간의 단식 기간(물 자유 이용 상태) 후, 각 그룹의 쥐(n = 6)에게 5% 활성탄과 5% 아라비아 유출액이 포함된 잉크 현탁액(10 mL/kg)을 위내 투여했습니다. 25분 후, 동물들은 복막 내 5% 클로랄 하이드레이트 주사로 마취되었다. 복부 부위는 조직 채취 전에 75% 에탄올로 닦아 소독한 후, 사지를 해부 판에 고정했다. 복강은 수술용 가위로 조심스럽게 노출되었고, 유문에서 회미 접합부까지의 장관은 절제되었다. 분리된 장은 멸균 여과지에 곧게 펴졌고, 두 가지 측정값을 기록했다: (1) 소장의 전체 길이와 (2) 잉크 앞면이 이동한 거리. 장 추진 비율은 다음 공식으로 계산되었습니다:

장 추진율(%) = (잉크 이동 거리 / 총 장 길이) × 100%

HE 착색
대조군, 모델군, SDPF-M군, Mos 그룹(그룹당 n = 3개)에서는 직장 검체를 수집하여 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색을 위해 처리하였다. 표본들은 4% 파라포름알데히드에 고정되고, 등급 에탄올에서 탈수된 후 파라핀 블록에 박혔습니다. 두께 4–5 μm 크기의 얇은 조각들이 준비되어 유리 슬라이드에 부착된 후 전통적인 헤마톡실린과 에오신 염색을 거쳤습니다. 절차는 자일렌을 이용한 탈파라핀화로 시작한 후, 에탄올 농도가 점점 낮아지는 과정을 통해 재수화되었습니다. 핵은 5–8분간 헤마톡실린에 노출시켜 염색했다. 1% 산성 알코올에서 분화하고 0.2% 암모니아수에서 블루잉한 후, 세포질과 세포외 기질을 1–2분간 에오신으로 교환하였습니다. 마지막으로 염색된 부분을 탈수, 정리, 현미경 관찰을 위한 커버슬립을 부착했습니다. 이 접근법은 융모와 지하부의 구조, 상피세포 상태, 고유층 내 염증 침윤 존재 등 장 점막 형태를 상세히 평가할 수 있게 했습니다.

KEGG 경로 및 GO 농축 분석
SDPF의 기존 화학 프로파일을 활용하여 각 구성 요소의 단백질 표적에 대한 실리코 예측이 SwissTargetPrediction 플랫폼을 사용했습니다. 변비와 관련된 추정 표적은 DAVID 6.8 데이터베이스를 이용해 필터링 및 기능적 주석을 적용했으며, 유의성 컷오프는 P < 0.05였습니다. 결과적으로 생성된 유전자 집합은 이후 생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성 요소에서의 역할을 밝히기 위해 GO 분류를 거쳤습니다. 질병 발병 기전에서의 관여를 더 명확히 하기 위해, 이 표적들은 이후 KEGG 경로에 매핑되어 여러 신호전달 연쇄 반응이 유의미하게 풍부해졌으며, 변비의 발병 및 발병에 잠재적으로 연관되었음을 밝혀냈습니다.

"구성 요소-목표-경로" 네트워크 구축
Cytoscape(버전 3.6.1)에서는 SDPF의 화학적 성분, 변비에 대한 해당 치료 표적, 그리고 관련 농축 경로를 체계적으로 통합하여 "Component-Target-Pathway" 네트워크를 구축하였습니다. 이 그래픽 모델 내에서는 세 가지 데이터 유형을 나타내기 위해 서로 다른 노드 기하학이 사용되었습니다: 복합물의 원, 타겟의 삼각형, 경로의 직사각형. 이 노드들 간의 연결 강도는 엣지 가중치를 통해 정량화되어, 복잡하고 다층적인 약리학적 상호작용을 전체적으로 파악할 수 있게 되었습니다.

분자 도킹
분자 도킹 분석을 위해 사이클로커큐민, 알비플로린, 클로로겐산, 케르세틴 등 네 가지 생리활성 화합물이 리간드 분자로 선정되었으며, 이들의 구조는 PubChem 데이터베이스에서 해당 CAS 등록 번호를 사용해 다운로드되었습니다. 단백질 수용체를 준비하기 위해 UniProt 지식베이스를 참고하여 표적 단백질 PI3K와 AKT를 확인했으며, 이후 RCSB 단백질 데이터베이스에서 3차원 구조를 검색했습니다. 이 단백질 및 화합물 구조들은 Discovery Studio 2019에서 처리되어 수소 원자가 첨가되고, 전하가 할당되며, 원자 종류가 정의되었습니다; 또한 수용체에 잠재적인 결합 포켓이 확인되었습니다. 준비된 리간드와 수용체는 이후 도킹 시뮬레이션을 위해 PDBQT 형식으로 저장되었습니다. 도킹 절차는 다음과 같은 구성으로 수행되었습니다: 포즈 클러스터 반경 0.5, 10개의 무작위 리간드 구조 생성, 10개의 정제 방향. 도킹 주행이 완료된 후, 후보 복합체들은 예측된 결합 자유 에너지에 따라 평가 및 순위가 매겨졌습니다. 가장 에너지적으로 유리한 결합 자세는 PyMOL을 사용하여 선택되어 주요 분자 간 상호작용을 시각화하였습니다.

면역조직화학
대조군, 모델군, SDPF-M 치료 코호트에서 4 μm 두께로 절단된 파라핀 함침 직장 표본은 먼저 파라핀을 제거하고 점진적으로 수화하였습니다. 항원 부위는 pH 6.0에 조절된 시트레이트 버퍼에서 가열하여 마스킹을 해제하였습니다. 내인성 과산화효소를 억제하기 위해 조직은 3% 과산화수소 용액으로 처리한 후 정상 염소 혈청으로 배양하여 비특이적 항체 결합을 줄였다. 이후 4°C에서 1차 항체와 함께 인산화된 PI3K와 AKT를 표적으로 하여 하룻밤 배양하였다; PBS와 함께 인큐베이션된 병렬 구간이 음성 대조군으로 사용되었습니다. 철저한 세척 후, 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체를 적용하고, 현미경 관찰 하에 DAB 염색원을 이용해 반응 시간을 조절하는 면역염색법을 개발하였습니다. 마지막으로 조직을 헤마톡실린으로 가볍게 상쇄하고, 등급별 알코올로 탈수한 뒤 투명화한 후 마운팅했습니다. p-PI3K와 p-AKT의 발현 수준은 두 명의 독립 연구자가 실험군에 대해 눈가리게 하여 질적으로 평가하였고, 대표성 이미지로 그룹 간 차이를 보여주었습니다.

서부 블롯팅
쥐의 직장 조직 샘플은 차갑게 인산염이 첨가된 식염수로 두 번 헹군 후, 적절한 용량의 RIPA 용해 완충제에서 얼음 위에 10분간 균질화하였습니다. 균질화 후, 혼합물을 15,000 × g에서 원심분리하고 상청액을 보관하여 분석했다. 단백질 정량은 비신코닌산 방법을 사용하여 수행되었습니다. 이후 샘플은 SDS 로딩 버퍼와 결합되어 95°C에서 5분간 배양하여 변성되었습니다. 동등한 단백질 양은 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 통해 분리된 후 0.45 μm의 공 크기의 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막에 전기전사하였습니다. 이식 후, 막은 자연 건조시킨 후 5% 무지방 건조 우유로 TBST에 1시간 동안 상온에서 차단했습니다. 이 단계에 따라 막을 TBST로 세척한 후, 4°C에서 AQP3(RRID: AB_2837708)와 AQP8(RRID: AB_605941)을 표적으로 하는 1차 항체와 함께 하룻밤 배큐했습니다. 다음 날, TBST로 추가 세척한 후, 막을 적절한 고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체와 실온에서 1시간 배양하였습니다. 면역반응 밴드는 결국 영상 시스템을 통해 검출되고 포착되었습니다.

면역형광
면역형광 염색 절차는 대조군, 모델, SDPF-M 처리된 쥐의 직장 조직 절편에 대해 다음과 같이 시행되었다: 냉동절부 후 조직을 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 0.1% Triton X-100으로 투과화한 후, 비특이적 결합을 방지하기 위해 적절한 차단 완충제로 차단하였다. 절편들은 AQP3와 AQP8에 대한 1차 항체 혼합물과 함께 4°C에서 하룻밤 배양되었고, 이후 결합되지 않은 항체를 씻어내어 1시간 동안 실온에서 어두운 상태에서 2차 항체 혼합물과 함께 1시간 배양했습니다. 특히 염소 항토끼 IgG를 Alexa Fluor 594(빨간색)와 결합하여 AQP3를 표지하고, 염소 항생쥐 IgG를 Alexa Fluor 488(녹색)에 결합하여 AQP8을 표지했습니다. 2차 항체 배양 및 이후 세척 후, 세포 핵은 DAPI로 카운터 염색을 하고, 슬라이드는 수성 마운팅 배지로 커버슬립된 후 형광 또는 공초점 현미경을 이용한 영상 촬영 및 시각화를 진행하였습니다.

대변 미생물군의 16S rRNA 시퀀싱
각 실험군(n = 8)에 대해, 상용 토양 DNA 추출 키트를 사용해 쥐 배설물에서 박테리아 유전체 DNA를 분리했으며, 모든 절차는 공급자의 프로토콜을 엄격히 따랐습니다. 16S rRNA 유전자의 V3–V4 과가변 영역을 표적으로 한 PCR 증폭은 338F/806R 프라이머 쌍을 이용한 열 사이클러에서 수행되었습니다. 앰플리콘 시퀀싱은 제조사 지침에 따라 Illumina MiSeq 플랫폼에서 수행되어, 희귀 곡선 포화를 달성하고 신뢰할 수 있는 미생물 다양성 분석을 보장할 수 있는 충분한 시퀀싱 깊이를 생성했습니다. 시퀀싱이 완료된 후, 원시 리드는 품질 필터링, 어댑터 제거, Trimmomatic과 FLASH를 사용해 병합되었습니다. 고품질 서열은 이후 UPARSE를 사용해 97% 유사도 임계값으로 운영 분류 단위(OTU)로 클러스터링되었고, 잠재적 키메라 서열은 UCHIME를 사용해 식별 및 제거되었습니다. 대표 서열의 분류학은 RDP 분류기를 사용하여 SILVA 참조 데이터베이스를 기준으로 70%의 신뢰 임계값으로 수행되었습니다. 미생물 군집 내 알파 다양성을 평가하기 위해 Mothur 소프트웨어 패키지(v.1.30.2)를 사용하여 Chao1 풍부도 추정기와 Shannon 다양성 지수를 계산하였습니다. 베타-다양성 분석에서는 그룹 간 조성 차이를 시각화하기 위해 주좌표 분석을 수행하였습니다. 서로 다른 실험 조건에서 고유하고 공유된 OTU의 분포를 보여주기 위해 벤 다이어그램이 작성되었습니다. 코호트 간 차등 풍부도를 식별하는 작업은 선형 판별 분석 효과 크기를 사용하여 수행되었습니다. 마지막으로, PICRUSt2를 사용하여 미생물 군집 기능의 예측적 프로파일링이 수행되었으며, KEGG 정서학 주석에서 기능적 잠재력을 추론하였습니다.

통계
모든 통계 분석은 SPSS 23.0과 GraphPad Prism 8.0을 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro–Wilk 검정을 사용하여 평가하였다. 두 그룹 간 비교를 위해 정규분포 데이터에는 독립 표본 학생 t-검정을, 비정규 분포 데이터에는 Mann–Whitney U 검정을 사용했습니다. 세 개 이상의 그룹이 포함된 비교의 경우, 정규 분포 데이터에는 일방향 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 사후 검정을 사용했으며, 비정규 분포 데이터에는 Kruskal–Wallis 검정 후 Dunn 사후 검정을 사용했습니다. 마이크로바이옴 분석에서는 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe)와 기본 임계값(LDA 점수 > 2.0)을 사용하여 차등 풍부도를 식별하고, Benjamini–Hochberg 거짓 발견률(FDR) 방법으로 다중 검사 보정을 적용하였다. 마이크로바이옴 통계 분석은 Mothur(v.1.30.2), LEfSe(온라인 도구, Huttenhower 연구소), PICRUSt2(v.2.5.0)를 사용하여 수행되었습니다. p-값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

SDPF 추출 및 동열건조
SDPF는 다섯 가지 약용 식물로 구성된 다한초 제형으로, Radix Paeoniae Alba(바이샤오), Curcuma longa (장황), Rhizoma cibotii (탕고우지), Siegesbeckia orientalis L.(Xixiancao), Clematis chinensis Osbeck(Weilingxian)(그림 1A)입니다. 혼합물은 정제된 물로 추출되어 가루로 재분석되었습니다(그림 1B).

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토론

만성 변비는 장내 미생물군 불균형, 신경근 기능 장애, 장 분비 변화 사이의 복잡한 상호작용을 포함하는 다요인 질환입니다. 이러한 증상은 6개월 이상 지속되며 환자의 삶의 질을 크게 저하시킵니다19. 변비는 느린 통과형, 정상형 이동형, 배변장애,혼합형 등 여러 하위 유형으로 분류할 수 있습니다. 만성 변비의 정확한 발병 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 장내 생물 불균형, 위장 신경 전도 장애, 골반저 근육 기능 장애, 뇌-장 축 이상 등 여러 요인의 상호작용으로 일반적으로 설명됩니다21. 현재 서양 의학 관리는 주로 프로키네틱 제, 완하제, 관장22를 사용합니다. 그럼에도 불구하고 장기 약물치료는 흑색증 대장증, 전해질 장애, 위 손상, 약물 내성 증가와 같은 부작용과 연관되어 있으며, 종종...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

자금 지원: 이 연구는 선전 과학기술 프로그램(보조금 번호) JCYJ20220531092203007).

쥐 변비 모델 구축에 있어 기술적 지도를 제공해 주신 산둥 중의의원의 리쿤 취 박사님께 깊이 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
자동 그라인더샘플 분쇄를 위한 고처리량 조직 균질기JXFSTPRP-48
LC-MS 시스템써모피셔 사이언티브Q 익스액티브 HF LC-MS 시스템초고성능 액체 크로마토그래피 – 질량분석법 시스템
질량 분석기써모피셔 사이언티브Q 익스액티브 HF고해상도 오비트랩 질량분석기
C18 기둥애질런트 테크놀로지스조르박스 이클립스 플러스 C18 (2.1 & 배율; 100 mm, 1.8 & mu; m)화합물 분리를 위한 역상 컬럼
영상 스캐닝 시스템GE 헬스케어이미지콴트 LAS 4000젤 및 블롯 영상 시스템
열순환기응용 생명체계 (써모 피셔 사이언티픽)GeneAmp PCR 시스템 9700PCR 증폭 기기
토양 DNA 추출 키트오메가 바이오텍D5625대변/토양 샘플에서 미생물 DNA 추출을 위한 키트

참고문헌

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