급성 호흡곤란 증후군 쥐 모델에서 폐 조직의 단세포 RNA 서열 분석

요약

이 글은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 쥐 모델에서 폐 조직의 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. LPS 유도 모델 구축부터 생물정보학 분석까지의 단계를 상세히 설명하며, 21개의 세포 클러스터와 6개의 대식세포 아집단을 식별하고 ARDS 병인에 관여하는 주요 염증 경로를 강조합니다.

초록

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 높은 사망률을 가진 심각한 염증성 폐 질환으로, 면역 반응 조절 장애와 폐포 손상이 특징이지만, 그 세포 이질성은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 세포 유형 특이적 기전을 해부하는 데 전례 없는 해상도를 제공하지만, ARDS에서의 적용은 기술적 변동성으로 인해 제약을 받고 있습니다. 여기서는 지다당류(LPS) 유도 쥐 ARDS 모델에서 폐 조직의 scRNA-seq 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법에는 최적화된 조직 해리, 엄격한 품질 관리, 더블릿 제거, 배치 효과 보정, 그리고 클러스터링, 주석 및 차별 발현 분석을 위한 포괄적인 생물정보학 파이프라인이 포함됩니다. 우리의 접근법은 21개의 서로 다른 세포 집단을 신뢰성 있게 확인하고, ARDS에서 고유한 전사 시그니처를 가진 6개의 대식세포/단핵구 하위 집단을 밝혀냅니다. 하위 클러스터 특이적 차별 유전자 발현과 기능 풍부 분석을 통해 ARDS 발병기전의 주요 유전자와 경로를 추가로 규명하였습니다. 이러한 재현 가능한 워크플로우는 세포 다양성, 염증 경로, 후보 치료 표적의 심층 특성 분석을 가능하게 하여 ARDS의 기전 및 중개 연구를 위한 견고한 토대를 제공합니다.

서론

급성 호흡곤란 증후군(ARDS)은 확산성 폐 염증과 비심인성 폐부종을 특징으로 하는 급성 호흡기 질환으로, 주로 진행성 저산소혈증과 호흡 부전으로 나타납니다 ^1,2. ARDS의 병리학적 기전은 조절 불능의 염증 연쇄반응, 폐포-모세혈관 장벽 파괴, 그리고 여러 면역 세포 유형의 비정상적인 활성화 및 상호작용을 포함합니다 ^3,4. ARDS가 진행되는 동안, 폐 조직 내 면역 세포는 염증 매개체 분비와 면역 반응 조절을 통해 염증 연쇄 반응을 유도하여 폐 내피를 교란시키고, 외재 응고의 연쇄 반응을 활성화하며, 폐 손상을 악화시킵니다. 그러나 ARDS에서 세포 수준의 병리학적 기전에 대한 현재의 이해는 제한적이며, 이는 특정 약물 치료법의 개발을 제한하고 있으며, 현재의 관리 전략은 주로 산소 지원과 기계적 환기 등의 다양한 방식으로 구성되어 있습니다^. ARDS 병태 기전 중 세포 이질성과 동적 변화에 대한 심층 특성 분석은 새로운 치료 표적을 식별하고 새로운 치료 전략을 개발하는 데 매우 중요합니다 ^8,9,10.

단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 기술의 등장은 RNA 시퀀싱 연구에 혁신적인 돌파구를 가져왔으며, 질병 병인기전에서 세포의 이질성과 기능 역학을 해부할 수 있게 되었습니다^11,12. 기존의 대량 RNA 시퀀싱과 비교할 때, scRNA-seq 기술은 희귀하지만 중요한 세포 하위 집단을 식별하고, 세포 상태 전이의 동적 과정을 밝혀내며, 집단 수준 분석에서 종종 숨겨지는 복잡한 세포 간 상호작용 네트워크를 발견할 수 있습니다 13,14,15. 최근 ARDS에서의 scRNA-seq 연구는 특정 단핵구 유전자 발현 신호 확인, 비정상적인 대식세포 분극 패턴 발견, 그리고 전섬유세포 간 통신망 해명을 포함한 상당한 진전을 이루었습니다 16,17,18,19. 이 발견들은 ARDS의 병태생리학적 기전에 대한 이해를 심화시켰을 뿐만 아니라, 바이오마커 개발, 질병 층화, 정밀 치료에 대한 새로운 통찰을 제공합니다^20,21.

그러나 현재 ARDS scRNA-seq 연구는 불충분한 방법론적 표준화, 샘플 처리 프로토콜의 상당한 차이, 일관성 없는 데이터 분석 파이프라인 등 연구 결과와 임상 중개 응용의 재현성을 제한하는 도전에 직면해 있습니다^22,23. 이 프로토콜은 조직 처리, 품질 관리 및 데이터 분석을 위한 절차를 최적화하여 ARDS 폐 조직의 scRNA-seq 분석과 관련된 기술적 도전을 해결하여, 기전적 연구와 치료 개발의 기초를 제공합니다. 표준화된 접근법은 서로 다른 실험실 간 재현성을 보장하고, ARDS 세포 이질성 연구에서 비교 연구를 용이하게 합니다.

프로토콜

6±주에서 7주 된 특정 병원체가 없는 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 12마리를 베이징 바이탈 리버 실험동물기술유한회사(United Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.)에서 구입했습니다(동물 허가 번호: SCXK (Jing) 2025-0008). 쥐들은 베이징 중의대학 동즈먼병원 실험동물센터에 수용되었으며, 이는 중국 국가실험동물표준화 기술위원회가 발행한 국가 표준 "환경 및 사육 시설의 실험동물 요구사항"(GB 14925-2010)에 따른 것입니다. 실험 절차는 베이징 중의대 동즈먼병원 동물복지윤리위원회(승인번호: 24-54)에서 승인받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 모델 구축 및 표본 수집

참고: 실험 전에 모든 쥐를 1주일간 적응 기간에 노출시켜 스트레스 유발 효과를 최소화하세요.

1. 대장균 지지다당류(LPS)를 0.9% 식염수에 녹여 0.4 mg/mL LPS 용액을 얻습니다.
2. SPF 수컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 12마리를 무작위로 두 그룹으로 나누어 놓습니다: 대조군(n = 6)과 ARDS 모델 그룹(n = 6).
3. 대조군에게는 0.5 mL/체중 100g 용량의 0.9% 생리식 염수를 기관 내 주사로 투여합니다.
4. 0.4 mg/mL LPS 용액 을 기관내 주사로 동일한 용량(0.5 mL/100g)으로 ARDS 모델 그룹에 투여하고, 16시간 후 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 이소플루란으로 쥐를 마취합니다.
5. 복부 대동맥 을 통해 혈액을 채취한 후 원심분리기(4°C, 1000 × g, 30분)로 혈청을 얻습니다.
6. 흉강을 열고 폐 조직을 추출하세요.
7. 주사기를 이용해 기관지 절단기를 통해 기관지폐포 세척액(BALF)을 채취합니다^24,25.
8. 오른쪽 폐엽을 채취하여 PBS로 헹구고 이후 병리학적 검사를 하십시오.
9. 왼쪽 폐엽을 채취하여 PBS로 세척하여 이후 단세포 시퀀싱 및 분자생물학 실험을 수행한다^26,27.

2. 폐 조직의 조직병리학적 평가

1. 채취한 쥐의 오른쪽 폐 조직을 4% 파라포름알데히드에 12시간 동안 담가 고정시킨다.
2. 고정 후에는 에탄올(70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%)으로 조직을 탈수시키며, 각 농도에서 2시간을 허용합니다.
3. 탈수 조직을 자일렌으로 처리하여 투명해집니다.
4. 투명 조직에 녹은 파라핀을 넣어 60°C 오븐에서 2시간 동안 넣습니다.
5. 침투된 조직 블록을 임베딩 몰드에 넣고 신선한 파라핀을 부은 후 식혀 고체 상태로 파라핀 블록을 만듭니다.
6. 미세토임을 사용해 파라핀 블록을 4 μm 두께의 조각으로 절단하고, 45°C 수욕에 띄워 펼친 후 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드로 집어 나릅니다.
7. 슬라이드를 60°C 오븐에 구워서 단단히 슬라이드에 접착되도록 하세요.
8. 자일렌에 담가 절단면을 탈파라핀화한 후, 에탄올의 하강 구배(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)를 통해 재수화합니다.
9. PBS로 절단부를 세척하고, 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색을 시행한 뒤, 중성 수지로 커버슬립을 부착하세요.
10. 호중구 침윤, 간질성 염증, 부종, 울혈을 기반으로 한 표준화된 평가 시스템을 사용하여 전체 슬라이드 스캔 단면의 폐 손상을 평가합니다.
    참고: 각 매개변수는 병리학적 관여 정도에 따라 0에서 4까지 점수를 매겼습니다: 0(없음); 1명(≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)^28,29.

3. 효소 결합 면역흡착 분석법

참고: 채취 직후 분석이 불가능한 경우 샘플은 -80 °C에서 유지할 수 있습니다.

1. 표준을 녹여 15분간 실온에서 두고, 제조사 지침에 따라 직렬 희석을 수행합니다.
2. 매뉴얼에 따라 바이오티닐화 항체 작동 용액, 효소 결합 작동 용액, 세척 버퍼를 준비하세요.
3. 각 샘플당 100 μL 또는 100 μL 연속 희석 표준 물질을 항체 코팅 웰에 추가하고, 37 °C에서 90분간 배양합니다.
4. 플레이트를 4회 세척하고, 100 μL 비오티닐화 항체 작업 용액을 추가한 후 37 °C에서 30분간 배양합니다.
5. 플레이트를 4번 세척하고, 효소 합액 작업 용액 100 μL을 추가한 후 37 °C에서 30분간 배양합니다.
6. 웰당 기질 용액 100 μL를 추가하고, 37 °C에서 빛을 차단한 상태로 10분간 배양합니다.
7. 웰당 100 μL 정지 용액을 추가하고 부드럽게 혼합한 후 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
8. 설계된 소프트웨어를 사용해 OD 값을 표준 농도와 대비하여 표준 곡선을 생성합니다.
9. 측정된 OD 값과 표준 곡선을 바탕으로 시료 농도를 결정하세요.

4. 시퀀싱을 위한 단일 세포 현탁액 준비

참고: 폐 조직을 얻은 후에는 세포 생존 유지를 위해 얼음 위에 올려 신속하게 처리해야 합니다.

1. 폐 조직을 4°C로 미리 냉각한 PBS로 3번 세척하세요.
2. 미리 냉각된 PBS 2mL를 추가하고, 멸균 가위로 약 0.5 mm³ 크기로 더 작은 조각으로 갈아냅니다.
3. 파스퇴르 피펫을 사용해 다진 조직과 PBS를 15mL 원심분리관에 옮깁니다.
4. 4°C로 미리 냉각된 PBS 1mL를 추가로 배양 접시에 넣고, 남은 조직 조각을 헹군 후 재현탁한 후 현탁액을 같은 튜브로 옮깁니다.
5. 부피를 6.5 mL로 조절하고, PBS는 4 °C로 미리 냉각한 상태입니다. 콜라겐 I(100 U/mL)과 디스파이즈 II(1 U/mL)가 포함된 효소 용액에서 조직 조각을 소화한 후, 실온에서 부드럽게 흔들며 30분간 배양합니다.
6. 조직 조각이 반투명해지고 뚜렷한 고체 조각이 남지 않으면, 소화된 조직을 70 μm 및 40 μm 세포 체로 걸러낸 후 원심분리기(4°C, 500 × g, 5분)로 가열한 후 상원액을 버립니다.
7. 즉시 펠릿을 적혈구(RBC) 용해 버퍼 3mL에 재현탁하고, 피펫팅으로 부드럽게 섞은 후 얼음 위에 10분간 용해합니다.
8. 상혈이 연한 노란색이나 거의 무색으로 보이면 반응을 종료하기 위해 PBS 7mL를 추가하고, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용한 후 상원액을 버립니다.
9. 3mL의 PBS를 추가하여 세포를 재현탁시키고, 트리판 블루 염색을 이용해 세포 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
   참고: 세포 생존율이 70% 미만일 경우 죽은 세포 제거 절차를 수행하십시오.
10. 세포를 0.04% 소혈청 알부민(BSA)이 포함된 세척 완충제로 DPBS에서 두 번 세척합니다.
11. 셀을 재현탁하여 계수를 하고, 농도를 1,000 셀/μL로 조절하여 이후 로딩 및 검출을 시킨다.

5. 단일 세포 시퀀싱 데이터에 대한 품질 관리

참고: 단일 세포 RNA 라이브러리는 세포 현탁액에서 방울 기반 단일 세포 라이브러리 구축 방법을 사용하여 제조되었습니다. 라이브러리들은 DNA 나노볼 기반 시퀀싱 화학을 이용한 고처리량 플랫폼에서 시퀀싱되었습니다. 라이브러리당 약 21,000개의 세포가 적재되었으며, 세포 회수율은 ~60%를 목표로 했습니다. 시퀀싱은 라이브러리당 총 5.0× 10개의⁸ 리드를 생성했으며, 셀당 평균 깊이는 30,000-40,000 리드였습니다. 원시 시퀀싱 데이터는 해당 단세포 RNA 분석 파이프라인을 통해 처리되어 각 샘플의 유전자 발현 행렬을 생성했습니다.

1. 올리고 라이브러리를 PCR과 바코드 표시로 구성하여 농도>10 ng/μL, 최대 크기 180 bp ±10 bp를 보장합니다.
2. 단편화, 말단 복구, 어댑터 연결, PCR을 통해 cDNA 라이브러리를 구축하여 농도>10 ng/μL, 최대 크기 350–550 bp를 보장합니다.
3. R(v4.2.0) 소프트웨어의 Seurat 패키지(v4.3.0)의 Read10X 함수를 사용하여 유전자 발현 행렬에서 각 샘플에 대해 Seurat 객체를 생성합니다.
4. 미토콘드리아 유전자 비율>10% 또는 헤모글로빈 유전자 비율>5%)을 가진 세포는 필터링하여 저품질 세포를 제거합니다.
5. "LogNormalize" 방법을 사용하여 스케일 팩터 10,000으로 데이터를 정규화합니다.
6. "vst" 방법을 사용하여 매우 변이가 큰 특징을 식별하고, 상위 2,000개의 유전자를 보존하여 후속 분석을 수행합니다.
7. Seurat의 내장된 세포주기 마커 유전자를 이용해 세포주기 점수를 수행하고, 세포 주기 효과를 회귀시키세요(G2M). 점수와 S.Score) 데이터 스케일링 중입니다.
8. DoubletFinder(v2.0.3)를 사용하여 pN = 0.25, pK = 0.09, 예상 이중항률 0.06의 잠재적 이중항을 검출하고 제거하며, 추가 처리에서 제외합니다.
9. Harmony 패키지(v0.1.1)를 사용하여 샘플 간 배치 효과를 올바르게 수정할 수 있으며, theta = 2, max.iter.harmony = 20입니다.
10. 개별 샘플 이름에 대한 정보 열과 ARDS 모델 그룹 및 대조군의 그룹 세부 정보를 Seurat 객체의 메타데이터에 추가하세요.

6. 차원 축소, 군집화 및 셀 유형 주석

1. Seurat의 RunPCA 기능을 사용하여 고변동 유전자에 대해 주성분 분석(PCA)을 수행합니다.
2. ElbowPlot 시각화를 통해 주성분의 최적 수를 결정하세요.
3. Seurat의 FindClusters 함수와 FindNeighbors 함수 를 통해 Leiden 알고리즘을 적용하여 해상도 0.1로 주요 셀 클러스터를 식별합니다.
4. 선택된 주성분을 사용하여 UMAP 차원 축소를 수행합니다.
5. FindAllMarkers 기능을 사용하여 마커 유전자를 식별하여 세포 유형을 주석을 달아.
6. DotPlot 함수를 사용하여 세포 유형 전반에 걸쳐 마커 유전자 발현을 시각화할 수 있습니다.
7. 메타데이터에 셀 주석 결과의 새로운 정보 열을 추가하고 Umap으로 셀 유형 주석을 시각화하세요.
8. dplyr 함수를 사용하여 각 확인된 세포 유형 내 각 실험 그룹의 비율을 계산하여 세포를 세고 백분율을 계산합니다.
9. ggplot2를 사용해 셀 유형별 그룹 구성을 보여주는 스택 막대 그래프를 생성하고, 백분율 라벨과 그룹 간 통계 비교도 포함합니다.

7. 아집단 분석

1. 하위 집합 함수를 사용하여 대상 세포 하위 집단을 추출하고, 하위 집단 수준 분석을 위한 대응하는 Seurat 객체를 생성합니다.
2. 미토콘드리아 유전자, 헤모글로빈 유전자, UMI 수, 세포주기 점수를 회귀하는 동안 하위 집단 데이터를 재정규화하고 재척도합니다.
3. 2차 PCA 분석을 수행하고 하모니 배치 보정을 하위군에 맞게 적용합니다.
4. FindNeighbors와 FindClusters 기능을 사용하여 목표 세포 하위 집단 내에서 구별되는 하위 유형을 식별하기 위해 재클러스터링을 수행합니다.
5. 새로운 UMAP 임베딩을 생성하고, 앞서 설명한 것과 동일한 방식으로 셀 유형 주석을 사용해 하위 집단 클러스터를 시각화합니다.

8. 차별 유전자 발현 분석

1. MAST 통계 방법을 사용하여 각 하위 클러스터별로 ARDS 모델 그룹과 대조군 간의 차등 발현 유전자(DEGs)를 식별합니다.
2. 차별 발현 검사 중 시퀀스 깊이 효과를 제어하기 위해 잠재변수 회귀를 통합합니다.
3. 사전 정의된 로그 접힘 기반 DEG는 FindMarkers 함수를 사용하여 임계값과 조정된 p-값을 변경합니다.
4. 각 하위 클러스터별로 ggplot 함수를 사용해 유전자 발현 패턴과 유의성 라벨링을 시각화하는 화산 플롯을 생성합니다.
5. DEG 결과를 내보내고 포괄적인 요약표를 작성하여 기능 농축 및 기타 후속 분석을 용이하게 합니다.

9. 농축 분석

1. 조직을 이용해 유전자 기호를 ENTREZ ID에 매핑하세요. 경로 분석 호환성을 위한 주석 데이터베이스Rn.eg.db.
2. 모든 하위 클러스터의 DEG를 결합하고, 로그 폴드 변화 임계값과 조정된 p-값(윌콕슨 랭크-합 검정, logfc.threshold = 0.25, p_val < 0.05)을 기준으로 유의한 유전자를 필터링합니다.
3. 생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성 요소 온톨로지 범주, 벤자미니-호흐버그 보정법을 사용하여 GO 기능 농축을 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 풍부화 분석을 수행합니다.
4. 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부화 분석을 쥐 유기체 데이터베이스와 함께 KEGG 기능 강화 및 통계적 유의성 임계값을 적용합니다.
5. 도트플롯 함수를 사용하여 GO 및 KEGG 풍부도 결과에 대해 도트 플롯을 생성하며, 유전자 비율과 조정된 p-값을 포함한 상위 15개의 유의미하게 풍부화된 항을 표시합니다.
6. 풍부한 결과 CSV 파일을 내보내고, 시각화 그래프를 저장하여 포괄적인 경로 분석 해석을 할 수 있습니다.

결과

쥐 폐 조직의 HE 염색은 대조군에서 명확한 폐포 구조와 최소한의 염증을 보인 반면, ARDS 모델 그룹은 폐포 공동이 왜곡되고 벽이 두꺼워졌으며, 해당 폐손상 점수에서 유의미한 염증 세포 침윤이 나타났습니다(그림 1A–E). BALF와 혈청에서 IL-6, TNF-α, IL-1β 수치가 상승하여 성공적인 모델링과 전신 염증 반응이 확인되었습니다(그림 2A–F). 품질 관리 후 ScRNA-seq 분석에서 주요 세포 유형, 면역 세포, 구조 세포를 포함하는 21개의 뚜렷한 세포 클러스터가 확인되었으며, 비교 분석 결과 ARDS 모델 폐 조직에서 대식세포/단핵구, 호중구, 수지상세포의 수가 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3A–D<...

토론

이 프로토콜은 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 쥐 모델에서 폐 조직의 단세포 RNA 시퀀싱 분석을 위한 표준화된 접근법을 제시합니다. 이 결과는 조직병리학적 검사, 폐손상 점수 상승, BALF 및 혈청 내 염증성 사이토카인 수치 증가로 확인됨으로, LPS 유도 ARDS 모델의 성공적인 확립을 입증합니다. 단세포 전사체 분석 결과, 21개의 뚜렷한 세포 집단이 확인되었으며, ARDS 조직 내 대식세포/단핵구, 호중구, 수지상세포가 유의미하게 증가했습니다. 대식세포/단핵구 하위 집단의 추가 특성화를 통해 M1, M2, 조직 상주 대식세포를 포함한 여섯 개의 뚜렷한 클러스터가 확인되었으며, 각각 ARDS에 반응하여 고유한 전사 서명을 보였습니다.

여기서 설명하는 프로토콜은 ARDS에서 단일 세포 연구에 내재된 여러 중요한 기술적 과제를 다룹니다. 효소 소화 방법의 선택은 세포 생존력과^{표현형을<...}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.4% 트리판 블루 용액	깁코, 미국	15250061
4% 파라포름알데히드	서비스비오, 중국	G1101
소 혈청 알부민 (BSA)	상곤 바이오텍, 중국	A600332-0005
콜라게나제 I	예센, 중국	40507ES60
커브엑스펙트	하임스 개발	v1.4
디스파즈 II	예센, 중국	40104ES60
대장균 지단다당류(LPS)와 nbsp;	시그마, 미국	L6511
헤마톡실린 및 이오신(HE) 염색	솔라비오, 중국	G1120
고처리량 유전자 시퀀서	MGI 테크 주식회사	MGISEQ-2000RS
인산효소 억제제	비오타임 바이오테크놀로지, 중국	P1081
인산염 완충 용액	솔라비오, 중국	P1020
PMSF	솔라비오, 중국	R0010
R 소프트웨어	루슨트 테크놀로지스, 미국	v4.2.0
쥐 IL-1&베타; ELISA 키트	4abio, 중국	CRE0006
쥐 IL-6 ELISA 키트	4abio, 중국	CRE0005
생트륨 TNF-& 알파; ELISA 키트	4abio, 중국	CRE0003
적혈구(RBC) 용해 완충제	솔라비오, 중국	R1010
적혈구 용해 완충제	톈겐 바이오테크, 중국	RT122-1
RNase 없는 물	암비온, 미국	AM9937
TE 버퍼, pH 8.0	암비온, 미국	AM9858
트리스-글리신 전이 완충제	서비스비오, 중국	G2017