방법 논문

AAV 형질도입 연구를 위한 3D 스페로이드 평가

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DOI:

10.3791/70517

⸱

2026년 8월 14일

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

이 논문에서

요약

3차원 스페로이드 배양 시스템은 AAV 유전자 치료제 개발을 위한 기존의 2D 모델을 개선한 방식입니다. 이 방법론을 통해 저용량에서의 AAV 형질전환을 민감하게 검출할 수 있으며, 생리학적 관련성을 높이고 견고한 장기 모니터링이 가능합니다. 이 플랫폼은 다양한 세포주와 AAV 혈청형에 걸쳐 효능 평가, 고속 스크리닝 및 벡터 최적화를 지원합니다.

초록

아데노 부속 바이러스(AAV)는 유전자 치료제에서 유전자 전달에 사용되는 강력한 벡터입니다. AAV 개발에는 벡터 설계, 혈청형 성능, 조절 요소 강도 및 발현 키네틱스의 차이를 안정적으로 검출할 수 있는 in vitro  시스템이 필요합니다. 이러한 시스템은 역가 평가 및 벡터 최적화와 같은 응용 분야도 지원해야 합니다. 본 논문에서는 다양한 세포주에 걸쳐 AAV 역가, 트랜스진 발현 키네틱스 및 혈청형 특이적 형질전환 효율을 평가하는 데 최적화된 간소화된 3차원 스페로이드 플랫폼을 설명합니다. 초저부착 플레이트를 사용하여 균일한 스페로이드를 생성하며, 안정적인 구조와 장기 이미징을 지원하는 조건에서 유지합니다. AAV 형질전환 후, 라이브 세포 이미징 시스템을 사용하여 형광 또는 발광 리드아웃을 실시간으로 모니터링합니다. 이를 통해 연속적인 키네틱스 이미징으로 리포터 신호, 용량 반응성, 조절 요소 활성 및 발현 시작 시간을 정량적으로 평가할 수 있습니다. 이 플랫폼은 강력한 벡터 게놈 설계와 약한 설계를 효과적으로 구별하며, 여러 AAV 혈청형 간의 차이도 판별합니다. 이 방법은 느리게 분열하는 세포주와 빠르게 분열하는 세포주 모두에서 견고한 성능을 보여줍니다. 이러한 결과는 이 시스템이 전임상 유전자 치료 평가 및 개발을 위한 확장 가능하고 생리학적으로 유의미한 시스템으로서 유용함을 입증합니다.

서론

AAV 벡터는 안전성 프로필과 지속적인 유전자 발현 달성 능력 덕분에 in vivo 응용 분야에서 선호되는 유전자 전달 시스템 중 하나가 되었습니다1. AAV 유전자 치료는 수백 개의 제품이 개발 파이프라인에 있을 정도로 여러 희귀 질환 적응증 치료에서 성공을 거두고 있습니다2. 또한, Cas9과 같은 게놈 편집 구성 요소의 in vivo 전달을 포함한 신규 응용 분야는 치료가 어려운 적응증의 치료를 돕는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다3. 주요 개발 과제로는 높은 제조 비용과 제품 품질 및 임상 효능을 결정하는 현재의 in vitro 분석법의 제한적인 예측 능력이 있습니다4.

AAV 치료제의 발전은 임상적 성능을 정확하게 예측할 수 있는 예측 가능하고 표준화된 활성 분석법의 부재로 인해 근본적인 제약을 받고 있습니다4,5. 이러한 분석법은 엔지니어링된 벡터 라이브러리 스크리닝, 표적성 향상을 위한 캡시드 수정 최적화, 조직 특이적 친화도 평가 등 다양한 목적으로 사용되므로 개발 파이프라인의 핵심 구성 요소가 됩니다. 또한, 조절 서열이 트랜스진 발현에 미치는 영향을 규명하는 데에도 활용됩니다6. 후보 물질 선정 외에도, AAV 형질전환 분석법은 로트 출시, 로트 비교 연구 및 안정성 평가에 사용되는 역가 시험을 통해 제조 공정의 중요한 품질 관리를 지원합니다6,7.

과학적 과제는 일상적인 사용을 위한 실용적인 가능성을 유지하면서 벡터-숙주 상호작용의 복잡성을 포착하는 분석법을 개발하는 것입니다7,8. 현재의 접근 방식에는 전통적인 2D 단층 배양에서 표적 장기를 나타내는 불멸화 세포주를 활용하는 것이 포함됩니다. 이러한 배양 조건은 생리학적 관련성이 부족하며 높은 약물 용량을 필요로 합니다. 이는 실험실의 예측과 임상 적용 가능성 사이에 상당한 격차를 유발합니다. AAVR을 과발현하거나 CRISPR로 활성화된 시스템과 같은 새로운 엔지니어링 세포주는 중요한 진전을 나타내지만, 천연 조직의 특성인 3차원 구조와 세포외 기질 상호작용을 재현하는 데는 실패했습니다9,10,11. in vivo 미세환경을 더 잘 모사하는 차세대 모델은 이러한 중개적 격차를 메울 수 있을 것입니다12,13,14.

당사는 최근 AAV 형질전환 분석의 전이 가능성을 높이기 위해 AAV 형질전환에 최적화된 3D 스페로이드 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 표준 2D 분석법과 비교하여 여러 세포주와 AAV 혈청형 전반에서 AAV 형질전환 효율을 유의미하게 향상시킵니다. 분석에 사용되는 제품의 보존성과 민감도가 향상되었을 뿐만 아니라, 이 모델들은 스페로이드 내 세포 위치에 따라 달라지는 실제적인 세포 간 상호작용을 제공함으로써 2D 단층 배양보다 개선된 환경을 제공합니다. 또한 실제 장기 조건을 모사하여 약물 침투에 대한 유의미한 조사를 가능하게 합니다11,15,16. 나아가, 이 스페로이드 접근법은 표준 실험 장비를 사용하며 특수 배지나 스캐폴드 요구 사항이 없어, 더 복잡한 오가노이드 또는 공동 배양 시스템보다 실무적인 이점을 제공합니다. 이러한 단순성은 재현성과 확장성을 보장하여, 일상적인 유전자 치료제 테스트 및 벡터 개발 워크플로우에 매우 적합합니다17.

이 3D 스페로이드 플랫폼은 저용량에서의 AAV 형질전환에 대한 민감한 검출과 벡터 게놈 설계의 비교 평가가 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다. 또한 혈청형 의존적 친화성(tropism) 평가도 지원합니다. 특히 기존의 2D 배양에서는 높은 AAV 용량이 필요했던, 형질전환 효율이 상대적으로 낮은 세포주에 매우 유리합니다. 이러한 상황에서는 3D 플랫폼의 향상된 민감도와 개선된 생리학적 관련성이 매우 중요합니다. 하지만, 면역 성분, 혈관 전달 또는 전체 조직의 복잡성이 필요한 연구에는 이 시스템이 덜 적합할 수 있습니다. 이는 스페로이드가 in vivo 환경을 완전히 재현하지는 못하기 때문입니다.

따라서 본 연구에서는 두 가지의 결정적이고 상호 보완적인 판독 값인 형질전환 효율(여기서는 스페로이드당 총 리포터 신호로 정의)과 형질전환 역학을 통해, AAV 형질전환 분석에 최적화된 간편한 3D 스페로이드 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 AAV 효능 평가, 벡터 설계 및 중화 분석을 위해 비용 효율적이며 생리학적으로 관련성이 높고 유용한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

본 연구에서는 상용 제품 또는 기존에 발표된 출처로부터 얻은 기성 인간 세포주(HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 및 A375)를 사용하였다. 일차 인간 또는 동물 샘플은 사용되지 않았으므로 윤리적 승인이 필요하지 않았다.

1. 멸균 실험 설정 및 초기 후드 준비

  1. 생물안전 작업대를 활성화합니다.
  2. 공기 흐름이 충분히 안정화될 수 있도록 실험 시작 15분 전에 Class II 층류 미생물 안전 작업대를 켭니다.
  3. 후드 내부의 모든 표면에 70% (v/v) 에탄올을 분무합니다.
  4. 세포 상층액과 세포 잔해를 폐기하기 위해 500 mL 유리 비커에 5% (v/v) 표백제 소독액을 조제합니다.
  5. 모든 마이크로피펫과 팁 박스를 70% (v/v) 에탄올로 철저히 소독하여 장비를 세척합니다.

2. 세포 배양 배지 준비

  1. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) high glucose 기초 배지 500 mL를 준비합니다.
  2. 기초 배지에 열 불활성화된 소태아혈청(FBS) 10 mL, penicillin/streptomycin 용액(penicillin 100 units/mL 및 streptomycin 100 µg/mL) 1 mL, 그리고 2 mM L-glutamine 5 mL를 첨가합니다.
    참고: 모든 과정 동안 무균 조작법을 유지해야 합니다. 매 실험마다 신선한 배지를 조제하여 사용하십시오. 구체적인 장비 사양은 재료 표를 참조하시기 바랍니다.

3. 스페로이드 준비

  1. 위에서 설명한 대로 완전 DMEM 배지를 준비합니다.
  2. 배양 배지를 37 °C 항온수조에서 10–15분 동안 가온합니다.
  3. 액체 질소 탱크에서 분석 대상 세포주를 꺼냅니다.
  4. 동결 보존된 HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 및 HeLa 세포를 37 °C 항온수조에 넣어 빠르게 해동합니다.
  5. 마지막 얼음 결정이 녹는 즉시 항온수조에서 즉시 꺼냅니다.
  6. 해동된 세포 1 mL를 완전 DMEM 배지 9 mL에 희석합니다.
    참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 세포주는 동일한 DMEM 배지 및 배양 조건에서 유지됩니다.
  7. 실온에서 350 × g.로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
  8. 상층액을 제거합니다.
  9. 침전물을 완전 DMEM 배지 5 mL에 재현탁합니다.
  10. 세포를 T75 세포 배양 플라스크에 접종합니다.
  11. 접종한 플라스크를 37 °C, 5% CO2, 95% 습도로 유지되는 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

4. 세포 성장 모니터링

  1. 3일마다 15 mL의 배양액을 추가합니다.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 및 HeLa 세포가 70% 밀도(confluency)에 도달하면 계대 배양하며, T75 플라스크에서 완전 DMEM 배지를 흡입하여 제거합니다. 
  3. 세포가 포함된 T75 플라스크 에 PBS 5 mL를 추가하여 세포를 세척합니다. 
  4. T75 플라스크에 추가한 30초 후에 PBS 5 mL를 흡입하여 제거합니다.  
  5. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다.  
  6. 0.05% trypsin-EDTA 5 mL를 사용하여 5분 동안 세포를 트립신 처리합니다.  
  7. 세포가 완전히 분리될 수 있도록 플라스크를 37 °C 배양기에서 5분 동안 배양합니다.  
  8. trypsin을 중화하기 위해 완전 DMEM 배지 5 mL를 추가합니다.  
  9. trypsin을 제거하기 위해 세포를 350 × g에서 5분 동안 원심 분리합니다. 
  10. 세포 펠릿을 5 mL의 DMEM에 재현탁합니다. 
  11. 일상적인 세포 계대 배양을 위해 세포를 1:10 비율로 분할합니다. 
    참고: 세포가 로그기(log phase)에 도달하고 대사적으로 활성화될 수 있도록 실험 수행 전 2회 계대 배양하는 것을 권장합니다. 
  12. 세포가 70% 밀도에 도달할 때까지 이러한 제어 조건 하에서 배양을 계속한 후, 후속 실험 절차를 진행합니다.
    참고: 세포의 형태와 성장 패턴을 정기적으로 모니터링해야 합니다. 최적의 가스 교환을 위해 플라스크를 적절하게 배치하십시오. 배양 기간 내내 멸균 상태를 유지하는 것이 필수적입니다.

5. 세포 수확 및 초기 세포 준비

  1. T75 플라스크에서 기존 배양액을 흡입하여 제거합니다.
  2. 잔류 배양액과 부유물을 제거하기 위해 HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 및 HeLa 세포를 PBS로 3회 세척합니다.
  3. 부착 세포를 플라스크 표면에서 분리하기 위해 미리 데워둔 1× trypsin 용액 5 mL를 세포에 첨가합니다.
    참고: 최적의 효소 활성을 유지하기 위해 trypsin을 미리 데워 두십시오. 세포가 완전히 분리될 수 있도록 플라스크를 37 °C 인큐베이터에 5분 동안 둡니다. 과도한 소화를 방지하기 위해 trypsin 처리 시간을 주의 깊게 모니터링하십시오.
  4. trypsin 효소를 불활성화하기 위해 완전 배양액 5 mL를 첨가합니다.
  5. 용액을 균질화하기 위해 혼합물을 피펫으로 위아래로 섞어줍니다.
  6. 전체 세포 현탁액을 각각 라벨이 부착된 원심분리 튜브로 옮겨 세포 현탁액을 수집합니다.
    참고: 세포 생존율을 유지하기 위해 재현탁 과정에서 세포를 조심스럽게 다루어야 합니다.
  7. 실온에서 350 × g로 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.
  8. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 5 mL의 신선한 배양액에 조심스럽게 재현탁합니다.

6. 세포 계수기를 이용한 세포 수 측정 및 생존율 평가

  1. 원심분리 튜브 전체에 세포가 균일하게 분포되도록 피펫팅을 부드럽게 반복하여 현탁액을 균질화합니다.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 및 HeLa 세포를 위한 계수 튜브를 준비합니다.
  3. 완전 DMEM 배지에서 샘플을 1:10으로 희석합니다. 예를 들어, 360 µL의 완전 DMEM 배지에 세포 현탁액 40 µL를 넣습니다.
  4. 혼합물을 부드럽게 네 번 피펫팅하여 균질하게 희석합니다.
  5. 로그인 시 샘플에 라벨을 붙이고, 사용된 세포 유형, 희석 배수 및 샘플 이름을 지정합니다.
  6. 샘플을 세포 계수기로 로딩하고, 희석된 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 지정된 번호에 위치시킵니다.
    참고: 세포 계수기는 세포 샘플을 흡입하여 trypan blue와 혼합하는 자동 세포 계수기로, 작업자 간의 오차를 줄여줍니다.
  7. 샘플을 계수하기 전 세포 현탁액을 1 min 동안 가만히 둡니다.
  8. 정확한 결과를 얻기 위해 계수 전 세포를 고르게 재현탁합니다.
  9. 총 세포 수를 계산합니다.
  10. 총 생존 세포 농도를 사용하여 실험을 위한 세포 파종 수를 결정합니다.
  11. 생존율이 > 90%인 생존 세포를 사용합니다.
  12. 생존 세포(염색되지 않음)와 비생존 세포(청색 염색됨)를 구분합니다.
    참고: 모든 샘플에 대해 일관된 계수 기준을 유지해야 합니다.

7. 스페로이드 파종 및 크기 최적화

  1. 피펫으로 세포 현탁액을 위아래로 섞어 용액을 균질화하십시오.
  2. HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 또는 HeLa 세포를 서로 다른 세포 밀도로 분주하십시오.
  3. 1 x 10^6개의 세포를 파종하는 것으로 시작하십시오.4 200$\mu$L 내의 세포들 µ초저부착(ultra-low attachment, ULA) 96-웰 라운드 바텀 플레이트에 L만큼 분주합니다.
  4. 1 x 10을 단계별로 희석하십시오.4 실험에 필요한 세포 밀도에 도달할 때까지 2배 희석법으로 웰당 세포 수를 조정하십시오.
  5. 최상단 행을 제외한 모든 행(1B-1H)에 1부피의 완전 배지를 추가합니다.
  6. 1 x 10의 2배 부피를 추가하십시오.4 1A행(최상단 행)의 웰당 세포 수.
  7. 1A 행의 용액 1부피를 1B 행에 추가하는 방식으로 1A 행을 연속 희석하고, 이를 반복하십시오. 아래의 실험 배치 예시를 참조하십시오. 부수 도표 1.
    참고- 플레이트 측면을 가볍게 두드려 균일하게 재부유시키십시오.
  8. ULA 플레이트를 원심분리기의 350g에서 원심분리하십시오. × g .세포를 중심으로 모으고 세포 간 접촉을 촉진하기 위해 5분 동안 유지합니다.
    참고: 여기에 보고된 것 외의 다른 세포주를 사용하는 경우, 세포주마다 성장 및 스페로이드 형성 속도가 다르므로 파라미터 최적화가 필요할 수 있습니다.
  9. 초기 스페로이드 형성을 위해 처음 24~48시간 동안은 플레이트를 건드리지 마십시오. 스페로이드의 직경이 약 400$\mu$m에 도달할 때까지 3일 동안 성숙시키십시오. µm.
  10. 스페로이드 크기의 균일성을 확인하십시오. 세포가 균일하게 재현탁되었는지, 그리고 플레이트가 휘어지지 않았는지 확인하십시오.
    참고: 크기가 일정하지 않은 스페로이드(spheroid)가 포함된 플레이트는 사용하지 마십시오. 각 웰(well) 내의 스페로이드 직경이 비교적 균일한지 확인하십시오.
  11. 스페로이드 형태를 모니터링하십시오.
    참고: 잘 형성된 스페로이드는 경계가 뚜렷하고 둥근 모양으로 나타납니다.
  12. 느슨한 세포 응집체가 아닌, 조밀한 세포 간 접착을 나타내는 성숙한 스페로이드를 제작하십시오.
  13. 파종 밀도를 높이거나 형성 시간을 연장하십시오. 스페로이드가 조밀하지 않은 경우, 파종 밀도를 높이거나 형성 시간을 연장하십시오.
  14. 시딩 밀도를 낮추거나 원심분리 단계를 연장하여 다수의 작은 응집체가 형성되는 것을 최소화하십시오.

8. 살아있는 세포의 실시간 스페로이드 모니터링

  1. 세포 현탁액을 원심 분리한 후, 자동 살아있는 세포 이미징을 위한 라이브 셀 이미징 기기가 설치된 37 °C 인큐베이터(5% CO2, 95% 습도)로 플레이트를 옮긴다.
  2. 실험에 따라 스페로이드 라이브 셀 이미징 파라미터를 설정한다.
    참고: 테스트한 모든 세포주에 대해 다음 파라미터가 사용되었다.
  3. 획득 소프트웨어에 로그인한다.
  4. 다음 명령을 선택한다: |Schedule To Acquire | Launch Add Vessel | Scan On Schedule | Create Vessel: New.
  5. |Select Scan Type|: Spheroid. |Select the channels of interest|: Phase + Brightfield (스페로이드 성장 추적용), Green/Red (AAV 형질전환 추적용, 획득 시간은 각각 300 ms 또는 400 ms).
  6. 원하는 배율을 선택한다: 10x.
  7. 플레이트 모델과 드로어 내 위치를 선택한다.
  8. 이미징할 웰의 위치와 웰당 필요한 이미지 수를 선택한다.
  9. 실험 설명(이름, 세포 종류, 세포 수)을 입력한다.
  10. 분석 설정에서  Defer Analysis Until Later를 선택한다.
  11. 타임라인을 우클릭하고  Set Selected Scan Group Interval 옵션을 선택한다.
  12.  6 h마다 스캔을 추가하도록 설정하고  무기한 스캔(scan indefinitely)으로 설정한다. 원하는 시작 시간(자동 이미징 장치 내 배양 시작 후 최소 1 h 이후)을 설정한다.
  13. 이미징 소프트웨어에 로그인하여 매일 스페로이드 성장을 확인한다.
  14.  View Recent Scans  옵션을 선택하고 원하는 실험을 더블 클릭한다. |이미지 채널 패널에서  Brightfield 를 선택|한 다음,  |Measure image|  기능  도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정한다.
    참고: 대상 세포로부터 조밀한 스페로이드를 형성하기 위해서는 최적의 성숙 시간이 필요할 수 있다.
  15. 스페로이드 형성이 최적화된 날에 플레이트를 꺼내 AAV 형질전환에 사용한다.

9. AAV 형질도입

  1. AAV 혈청형 구매 또는 제조3 및 관심 외래유전자.
  2. DMEM 배지 490 mL에 FBS 10 mL를 첨가하여 AAV 형질전환용 2% FBS 보충 DMEM 배지를 제조하십시오.
    참고: 대표 결과 섹션에서 입증된 바와 같이, 캡시드 또는 게놈 조절 요소의 스크리닝에는 GFP 트랜스진이 매우 효과적입니다. 관심 대상인 AAV를 항생제가 포함되지 않은 2% FBS 보충 DMEM 배지로 희석하십시오.
  3. 계열 희석을 위해 지정된 96-well round plate에 희석합니다.
  4. AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9의 역가를 측정하기 위해 초기 MOI로부터 1:10 연속 희석액을 조제하십시오.
  5. 아래의 예시 실험 배치도를 참조하십시오. 부록 그림 2. 고찰(Discussion) 섹션에 설명된 대로, AAV 형질도입(transduction)에 필요한 MOI를 계산하십시오.
  6. 33을 추가하십시오. µAAV 스톡 L을 297로 µ330을 얻기 위한 배지 L µMOI 1의 총 L × 106.
  7. MOI 1부터 시작하여 10배 단계 희석을 수행하십시오. × 106 33을 추가함으로써 µL을 297으로 µ2% FBS가 첨가된 DMEM 배지 L.
    참고: 세포 생존율 저하를 방지하기 위해 높은 MOI(감염다중도)를 피하는 것이 권장됩니다. 세포 유형과 AAV 혈청형에 따라 최적의 MOI가 크게 달라질 수 있으므로, 각 조건에 맞는 실험 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다. 모든 바이러스 게놈이 감염성을 갖는 것은 아니므로, 기능적 역가(functional titer)는 vg/mL 값과 다를 수 있습니다.

10. AAV 투여

  1. 멀티채널 피펫을 사용하여 이미 준비된 스페로이드 플레이트에서 모든 배지를 흡입하여 제거합니다.
  2. 멀티채널 피펫을 사용하여 희석 플레이트에서 처리 플레이트로 원하는 MOI의 용액 100 µL를 옮겨 넣어줍니다.
  3. 플레이트를 다시 이미징 장비에 넣고 72 h 동안 녹색 형광 강도를 추적하여 형질전환을 모니터링합니다.
  4. 3일 이상 모니터링하는 경우, 영양분을 보충하기 위해 3일마다 웰당 100 µL의 완전 DMEM 배지를 추가합니다.

11. 살아있는 세포 이미징, 형질도입 모니터링 및 데이터 분석

  1. 처치군에 원하는 AAV와 MOI를 첨가한 후, 플레이트를 다시 기기에 넣으십시오.
  2. 6시간마다 형질도입 효율(transduction efficiency) 기록을 시작하십시오.
    참고: 최적의 GFP 발현을 달성하는 데는 보통 3일에서 5일이 소요됩니다. 이는 사용된 프로모터 및 게놈 구성에 따라 달라집니다.
  3. 관심 세포 및 리포터 유전자에 특정한 분석 정의를 생성하여 데이터를 분석하십시오.
    참고: 또는, 플레이트를 표준 37°C 배양기에 보관하십시오. °인큐베이터에서 배양하고 qPCR, 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA를 통해 형질도입 효율을 평가한다.
  4. 1차 스페로이드 검출을 위해 명시야 분석(Brightfield Analysis)을 수행하여 분석 파라미터를 정의하십시오.
  5. 다음과 같이 세그멘테이션 매개변수를 최적화하십시오:
    1. 분석 유형: "스페로이드 명시야 영상"
    2. 분할 방법: "적응형 임계값"
    3. 임계값 범위: 0.3–0.8 (초기에는 자동 조정 권장)
    4. 탑햇 필터: 200–500 µm (불균일한 조명 제거)
  6. 명시야 매개변수를 다음과 같이 최적화하십시오:
    1. 대표 이미지 불러오기 서로 다른 시점에서.
    2. 검사 임계 범위 최적의 검출 조건을 찾기 위해 (0.2–0.9)를 사용합니다.
    3. 크기 필터 조정 예상되는 스페로이드 크기 범위에 근거하여.
    4. 분할 검증 시각적 오버레이 검사를 통해.
  7. AAV 형질도입 평가를 위해 다음과 같이 녹색 채널(Green Channel)을 최적화하십시오.
    1. 배경 수준 결정 처리하지 않은 웰(MOI=0)의.
    2. 임계값 설정 2–3× 배경 소음(background noise) 이상으로.
    3. 가장 높은 MOI로 처리한 샘플을 사용하여 테스트하십시오.
  8. 노출 시간 최적화 신호를 유지하면서 포화를 방지하기 위해
    참고: AAV 형질전환의 경우, 형질전환 효율의 척도로 스페로이드당 총 형광 신호를 보고하십시오.

12. 데이터 분석

  1. 배경 노이즈가 아닌 이미지 상의 세포만 선택될 수 있도록 필터와 마스크를 조정하여 적절한 파라미터를 선택하십시오.
  2. 소프트웨어를 학습시키기 위한 대표 이미지를 선택하십시오.
  3. 최적화된 파라미터를 연구에 사용된 모든 이미지에 적용하십시오.
  4. 데이터를 개별 값 또는 그룹화된 형태로 추출하여, 추가적인 데이터 제시를 위해 통계 분석 시스템으로 전송하십시오.

13. 발현 시간 계산

  1. MOI당 첫 번째 GFP 신호를 검출하는 데 걸리는 시간을 계산합니다.
  2. 처리하지 않은 웰(MOI = 0)의 평균값 + 3 표준편차(SD)에서 보간법을 수행합니다.
  3. 라이브 셀 이미징 소프트웨어에서 각 시점별 각 스페로이드의 녹색 형광 강도를 통계 소프트웨어로 복사합니다.
  4. 반복 실험값의 평균을 냅니다.
  5. 처리하지 않은 스페로이드가 포함된 모든 웰(MOI = 0)의 평균 신호 및 SD를 계산합니다.
  6. 비대칭 시그모이드(Asymmetric Sigmoidal) 5PL 곡선 피팅을 사용하여 각 MOI에 대한 발현 시작 시간을 보간합니다.
  7. 예를 들어, Table 1에서는 다음과 같은 보간 값이 사용되었습니다:
    1. scGFP의 경우: 254,955 (평균) + 3 × 288,055 (SD) = 1,412,120 (보간 신호)
    2. ssGFP의 경우: 2,417,941(평균) + 3 × 26,093  (SD) =  3,200,746 (보간 신호)

14. 형광 측정 기능이 있는 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.

  1. 플레이트 리더기에 연결된 컴퓨터에서 형광 플레이트 리더 소프트웨어를 실행하십시오.
  2. 탐색 ~로/에게/까지 파일 > 열기 프로토콜을 확인하고 플레이트 유형(예: 96-웰, 384-웰)을 선택하며, 올바른 웰 레이아웃이 선택되었는지 확인하십시오. 
  3. 각 웰에서 리더가 형광을 수집하는 시간을 결정하는 형광 검출 통합 시간을 설정하십시오.
  4. 조절 제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요. 이득 또는 민감도 설정
    만약 ~라면 그 분석법 필요함 더 높은 또는 낮은 신호 검출
  5. GFP의 형광 파라미터를 다음과 같이 설정하십시오: 들뜸 파장 485 nm, 방출 파장 528 nm.
  6. 소프트웨어에서 Run을 클릭하여 측정을 시작하십시오.
  7. 측정 형광 ~로부터 각각의 웰(well)
    참고- 분석 완료 후 소프트웨어에 원시 형광 값이 표시되며, 평균값을 계산하고 배경값을 빼어 그래프를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
  8. 내보내기 결과 내에 그/그녀/그것 (문맥에 따라 생략 가능) 선호되는 형식 ~을 위한 추가적인 분석 또는 보고.
    참고: 샘플 프로토콜이 수정된 경우, 파일을 사용하십시오. > 다른 이름으로 저장하여 고유한 버전을 생성하고, 향후 사용을 위해 원본을 보존하십시오.

15. 발광 트랜스진 형질전환

  1. 위에서 상세히 설명한 것과 동일한 세포 파종 및 AAV 투여 프로토콜을 따릅니다.
  2. ULA 플레이트에서 이미 배양된 HeLa 스페로이드 100µL에 0–106 범위의 서로 다른 MOI를 갖는 나노 루시퍼레이스 트랜스진을 운반하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 및 AAV9 100µL를 첨가합니다.
  3. 플레이트를 일반적인 37 °C 인큐베이터에서 배양하고, 형질전환 3일 후에 형질전환 효율을 평가합니다.

16. 살아있는 세포 분석 검출을 위한 세포 외 발광 억제제 및 발광 기질 준비

  1. 3일째(종점)에 배양기에서 분석 플레이트를 꺼냅니다.
  2. 세포에 세포외 발광 억제제와 기질을 직접 첨가합니다.
    참고: 배지를 제거할 필요는 없습니다.
  3. -20 °C 보관소에서 세포외 억제제를 꺼내 실온에서 해동합니다.
  4. 짧게 원심분리하여 튜브 캡과 벽면에 맺힌 액체를 모읍니다.
  5. 세포외 억제제 1 부피와 완전 DMEM 배지 14 부피를 혼합하여 필요한 양의 재구성된 15X 세포외 발광 억제제를 준비합니다.
    1. 예를 들어, 실험에 1.0 mL의 시약이 필요한 경우, 933 µL 의 DMEM에 67 µL의 억제제를 첨가합니다. 플레이트 1개당 DMEM 1 mL을 준비하고 67 µL의 억제제를 첨가합니다.
  6. 단계 16.5에서 준비한 억제제를 멸균 시약 리저버로 옮깁니다.
  7. 멀티채널 피펫을 사용하여 AAV가 형질전환된 웰에 억제제 10 µL를 분주합니다.
  8. -20°C 보관소에서 Live Cell Substrate를 꺼내 혼합합니다.
  9. 짧게 원심분리하여 튜브 캡과 벽면에 맺힌 액체를 모읍니다.
  10. 필요한 양의 재구성된 3.6X Live Cell Reagent를 준비합니다.
  11. 플레이트 1개당 DMEM 4 mL를 준비하고 기질 144 µL를 첨가합니다.
  12. 단계 16.11에서 준비한 기질을 멸균 시약 리저버로 옮깁니다.
  13. 멀티채널 피펫을 사용하여 AAV가 형질전환된 동일한 웰에 기질 50 µL를 분주합니다.
    참고: 여러 개의 분석 플레이트를 동시에 진행하는 경우 시약의 부피를 조정해야 할 수 있습니다.
  14. 실온에서 300 rpm으로 5분 동안 플레이트를 흔들어 섞어줍니다.
  15. 발광 검출 시약을 첨가한 후 2시간 이내에 in vivo 이미징 시스템 기기로 플레이트를 판독합니다.
    참고: 발광 강도는 2시간에 걸쳐 점진적으로 감소합니다.

17. 생물 발광 이미지 분석

  1. CCD 카메라를 냉각(−90 °C)시키기 위해 이미지 촬영 최소 30분 전에 생물발광 이미징 시스템의 전원을 켭니다.
  2. 플레이트가 이미징 준비가 되었는지 확인합니다(예: 생물발광 판독을 위해 생세포 이미징 기질이 추가되었는지 확인).
  3. 빛의 반사와 산란을 방지하기 위해 플레이트 덮개를 제거합니다.
  4. 하단에서 이미징하는 경우 플레이트 바닥을 세척합니다.
  5. 플레이트를 이미징 챔버의 스테이지 위에 놓습니다.
  6. 플레이트가 카메라 중앙에 오도록 배치합니다.
  7. 발광(Luminescence) 이미징 파라미터를 설정합니다: 자동 노출 또는 노출 시간 설정(일반적으로 1–60 s), 비닝(Binning, 중간 단계 권장), f-스톱(최대 감도를 위해 1로 설정).
  8. 해부학적 참조를 위한 사진을 촬영합니다.
  9. 발광 이미지를 캡처합니다.

18. 생물 발광 이미지 데이터 분석

  1. ROI 도구를 사용하여 웰 또는 관심 영역을 원으로 지정합니다.
  2. 비교를 위해 샘플 전반에 걸쳐 ROI 크기를 일정하게 유지하십시오.
  3. 생체 발광의 총 광속(photons/second)을 측정합니다.
  4. 복사 효율을 측정합니다.
  5. 통계 분석을 위해 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
  6. 이미지 파일과 분석 결과를 저장합니다.
  7. 발표용으로 이미지를 TIFF 또는 JPEG 형식으로 내보냅니다.

결과

본 연구에서는 3D 스페로이드(spheroid)가 AAV 형질전환(transduction)을 평가하고, 자기상보적(self-complementary, sc) 및 단일가닥(single-stranded, ss)과 같은 벡터 게놈 설계를 구분하며, 형질전환 역학을 평가하는 도구로 사용될 수 있음을 보여줍니다. 전체 공정의 개요는 다음에서 확인할 수 있습니다. 그림 1. 간략히 설명하면, 먼저 세포를 2D 배양으로 증식시킨 후 초저부착(ultra-low attachment, ULA) 플레이트에 분주하여 조밀한 스페로이드를 형성합니다.그림 1A). 그 후, 응집을 촉진하기 위해 플레이트를 원심 분리합니다 (그림 1B) 및 실시간 스페로이드 형성 모니터링을 위해 라이브 셀 이미징 시스템으로 옮겼다(그림 1C). 3일 차에, 다양한 MOI(감염 다중도)로 AAV를 스페로이드에 형질도입합니다.그림 1D). 형광 라이브 셀 이미징(live-cell imaging)을 통해 트랜스덕션 역학(transduction kinetics)을 종단적으로 추적합니다(그림 1E), 그리고 플레이트 기반의 형광 또는 발광 판독법을 사용하여 최종 분석을 수행합니다. (그림 1F).

그림 2는 6가지 서로 다른 세포주에서 형성된 스페로이드의 형태를 보여주며, 밀도, 원형도 및 모양의 범위를 나타냅니다. 모든 세포주는 실험에 사용하기 전 몇 차례 계대 배양을 통해 완전 DMEM 배지에서 성장시켰습니다. 세포가 로그 성장기에 도달하면 HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 및 Huh7 세포를 수확하여 ULA-라운드 바텀 플레이트에서 웰당 10,000 cells의 세포 밀도로 시작하여 2배씩 단계적으로 희석하였습니다(부록 그림 1에 플레이트 레이아웃이 포함되어 있으며, 대표적인 결과는 부록 그림 2에 제시되어 있습니다). 스페로이드 크기는 50 µm 정도로 작아도 스페로이드 구조와 우수한 형질전환 감수성을 유지할 수 있습니다. 세포 파종 후, ULA 라운드 바텀 플레이트를 350 × g에서 5분 동안 원심 분리하여 세포가 웰 중앙에 모여 스페로이드로 자가 조립되도록 하였습니다. 이 단계는 자연적으로 응집되지 않는 세포에 특히 유용합니다. 림프구와 같이 응집 저항성이 높은 세포의 경우 원심 분리 시간을 5분에서 15분으로 연장할 수 있습니다. 잘 형성된 스페로이드는 HEK293T 및 Huh7 세포에서 관찰되는 것과 같이 둥글고 조밀한 표현형을 보이는 반면, 제대로 형성되지 않은 스페로이드는 느슨하게 응집되어 배지 교체 중에 분해되기 쉽습니다.

다음으로, 플레이트를 살아있는 세포 모니터링 장비가 갖춰진 37 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 여기에 보고된 각 세포주에 대한 스페로이드 형성을 평가하기 위해 플레이트를 6시간 간격으로 매일 모니터링합니다. 대부분의 세포주는 스페로이드로 자가 조립되는 데 3일이 소요됩니다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 각 세포주는 파종 3일 후 뚜렷한 형태학적 특징과 다양한 수준의 응집도를 보였습니다. 간 세포주(Huh7, HEPG2, HEP3B)는 다른 세포주보다 더 조밀하고 밀도가 높은 스페로이드를 형성했습니다. HEK293T는 뚜렷한 괴사 중심핵을 가진 매우 둥근 구형 외관을 형성한 반면, A375는 불규칙한 모양의 세포 응집체(이전 연구에서 변형된 스페로이드로 설명됨)18,19를 형성했습니다. 이러한 형태학적 차이는 질병의 병태생리학적 상태를 나타내는 지표로 생각되며, 이는 2D 배양 시스템과 비교했을 때 3D 모델의 유용성을 더욱 뒷받침합니다18,19. 스페로이드 조립 프로토콜은 테스트한 6가지 세포주 전체에서 재현성이 매우 높았으며, 여기에 제시된 모든 형질전환 과정에 적용되었습니다.

세포 농도, 스페로이드 형성 시간 및 녹색/적색 자가형광 상태를 최적화한 후(다음에 표시됨) 부속 그림 3), 당사는 라이브 셀 이미징 시스템과 플레이트 리더를 사용하여 스페로이드에서의 AAV 형질전환을 테스트하였습니다 (AAV 적정-titration-을 위한 플레이트 레이아웃의 예시는 다음에서 확인할 수 있습니다. 부수 그림 4). 그림 3 네 가지 서로 다른 세포주(HEK293T, Huh7, HEP3B 및 HEPG2)에 적용된 최적화된 스페로이드 프로토콜을 보여줍니다. 스페로이드 형성 3일 차에, 서로 다른 벡터 게놈 디자인을 가지며 GFP가 태그된 두 가지 AAV2 벡터를 다양한 감염 다중도(MOI)로 트랜스덕션하였습니다. 이 두 가지 AAV 트랜스진 디자인은 고효능(scGFP) 및 저효능(ssGFP) GFP 변이체를 나타냅니다. 세포 트랜스덕션 후, AAV 트랜스덕션을 실시간으로 모니터링하기 위해 플레이트를 라이브 셀 이미징 시스템에 배치하였습니다. 72시간 시점에서 라이브 셀 이미징 소프트웨어를 사용하여 녹색 형광 강도를 검출하였습니다. 그림 3, 파란색 선은 sc-GFP 게놈을 나타내며, 빨간색 선은 ss-GFP 게놈을 나타냅니다. 스페로이드는 AAV 형질도입에 매우 민감하였으며, scGFP의 경우 매우 낮은 AAV 타이터에서도, 그리고 서로 다른 세포주 전반에서 강력한 형질도입이 검출되었습니다. 다양한 세포주와 MOI에서 실시간으로 촬영한 AAV 형질도입의 대표 비디오가 다음의 영상에 제시되어 있습니다. 보충 영상 1, 보충 영상 2, 보충 영상 3, 보충 영상 4, 보충 영상 5, 및 보충 영상 6반면, ssGFP AAV의 스페로이드 형질전환은 더 낮은 수준으로 관찰되었으며, 이는 이러한 유형의 조절 요소에서 예상되는 더 약하거나 느린 형질전환 양상을 재현합니다.20,21이는 강한 AAV 형질전환과 약한 형질전환 모두에 대한 3D 스페로이드의 유용성과 더불어, sc-GFP와 같은 강한 형질전환 유전자와 ss-GFP와 같이 효능이 낮은 유전자를 구별하는 데 유용함을 보여줍니다. MOI 10에서 sc와 ss 트랜스진 간의 상대적 형광 값에 100배의 차이가 관찰되었습니다.6 HEK293T 세포에서, 그리고 HEP3B와 같이 형질전환이 더 어려운 세포주에서는 3배의 차이를 보였다.

다음으로 HEK293T 스페로이드와 Huh7 스페로이드 모두에서 다양한 혈청형의 AAV 형질도입을 농도 의존적으로 테스트하였습니다. 그림 4에 나타난 바와 같이, 3D 스페로이드는 네 가지 서로 다른 혈청형의 AAV-scGFP 형질도입이 가능했습니다. 형질도입 72시간 후, 형광 플레이트 리더(그림 4A,B)와 라이브 셀 이미징 소프트웨어(그림 4C,D))를 사용하여 scGFP를 측정하였습니다. 이 두 장비를 통해 4가지 혈청형 모두 성공적으로 검출되었습니다. 정규화된 신호에서는 유의미한 차이가 나타나지 않았으나, 라이브 셀 이미징 시스템이 형광 플레이트 리더보다 신호 대 잡음비의 범위가 더 높게 나타났습니다. 분석 결과, 두 세포주 모두에서 AAV2가 가장 강력한 형질도입 효율을 보였고, AAV1이 그 뒤를 이었으며, AAV5와 AAV9는 현저히 낮은 형질도입 효율을 보였습니다.

다음으로, 스페로이드 프로토콜을 사용하여 발광 전달 효율을 평가하였습니다. 이를 테스트하기 위해, 본 문서에 기술된 최적화된 프로토콜에 따라 HeLa 세포를 3D 스페로이드로 배양하였습니다. 3일 차에, 나노 루시퍼레이즈 리포터 유전자를 인코딩하는 5가지 서로 다른 AAV 혈청형을 HeLa 스페로이드에 전달하였습니다. AAV 전달 72시간 후, 세포에 Live Cell 기질을 처리하고 실온에서 5분 동안 배양하였습니다. 이어서 생체 발광 이미징 시스템을 사용하여 발광을 측정하고 이미지를 획득하였습니다. (그림 5A)본 시스템을 사용했을 때 모든 AAV 혈청형에서 효율적인 형질전환이 관찰되었습니다. 서로 다른 AAV 혈청형 간의 형질전환 효율에 대해 정밀한 구분이 관찰되었으며, 이는 본 프로토콜이 형광 판독법에만 국한되지 않음을 나타냅니다. 다음에서 관찰된 경향과 일치하게 그림 5HeLa 세포에서의 AAV-nano luciferase 형질전환 결과, AAV-GFP 벡터에서 확인된 바와 같이 AAV2가 가장 강력한 혈청형인 것으로 나타났습니다. 마찬가지로, 형광 및 발광 벡터 모두에서 AAV9 혈청형의 형질전환 효율이 가장 낮게 관찰되었습니다.그림 4 및 5). AAV-나노 루시페라제(nano luciferase) 형질전환의 대표 이미지가 다음에서 제시되어 있습니다. 그림 5B.

형질도입 강도뿐만 아니라, 3D 스페로이드 프로토콜을 통해 형질도입의 키네틱 모니터링이 가능합니다.그림 6 다양한 MOI(0-10)로 형질전환했을 때, AAV2-scGFP 및 AAV2-ssGFP의 3D HEK293T 스페로이드 형질전환 역학에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다.6) (그림 6A-G). AAV2-scGFP 형질도입은 MOI가 10 정도로 낮을 때도 검출 가능하다는 것을 확인하였습니다.1라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 관찰한 결과, 처리하지 않은 세포와 비교하여 약 34시간 후에 검출 가능한 GFP 신호의 증가가 나타났다. AAV2-ssGFP 신호는 AAV2scGFP 신호보다 훨씬 약하고 느리게 나타났다. 형질전환 속도를 추가로 비교하기 위해, GFP 신호가 검출되기 시작하는 시점인 발현 개시 시간을 계산하였다. 그 결과, scGFP가 ssGFP보다 세포 형질전환 속도가 평균 4배 더 빠르다는 것을 확인하였다. 개별 발현 개시 시간은 다음의 데이터에 보고되었다. 표 1이러한 역학 측정 결과는 분석 최적화에 유용한 형질도입 효율의 추가적인 측면을 보여줍니다.

세포 배양 워크플로우 도식; IncuCyte를 이용한 스페로이드 형성, 형질전환 및 분석.
그림 1: 3D 배양을 이용한 AAV 형질전환 개요. (A) 세포를 2D 배양으로 증식시킨 후 초저부착(ULA) 플레이트에 분주하여 스페로이드를 형성시킨다. (B) 응집을 촉진하기 위해 플레이트를 원심분리하고 (C) IncuCyte S3 시스템으로 옮겨 스페로이드 형성을 실시간으로 모니터링한다. (D) 3일째에 다양한 MOI로 AAV를 이용하여 스페로이드를 형질전환시킨다. (E) 라이브 세포 이미징을 통해 형질전환 역학을 종단적으로 추적하며, (F) 플레이트 기반의 형광 또는 발광 리드아웃을 사용하여 최종 분석을 수행할 수 있다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

세포 배양 스페로이드 비교; 실험 설정 내 6가지 서로 다른 세포주의 현미경 이미지.
그림 2: 다양한 세포주에서 형성된 스페로이드의 형태학적 특성 분석. HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 및 Huh7 세포로부터 생성된 스페로이드의 대표 이미지는 크기, 형태 및 치밀도의 다양성을 보여주며, 반복 실험 간의 높은 재현성을 나타낸다 (스케일 바, 50 µm). 모든 세포주는 웰당 1 x 104 cells/well의 밀도로 3일 동안 배양되었다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

GFP 표지 세포의 유전자 발현 분석; MOI 대 형광, 여러 세포주, 그래프, 이미지.
그림 3: 세포주별 자가 보완형(scGFP) 및 단일 가닥(ssGFP) 벡터의 AAV 형질전환 효율 비교. (A>) HEK293T, (B>) Huh7, (C>) HEP3B, 및 (D>) HEPG2의 3D 스페로이드를 자가 조립하고 다양한 MOI의 AAV2-scGFP(청색) 및 AAV2-ssGFP(적색)로 형질전환하였다. 형질전환 72시간 후에 총 녹색 형광 강도를 정량화하였다. 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 72시간 시점에서 각 AAV의 최고 MOI로 처리한 스페로이드의 대표 이미지이다. 스케일 바는 200 µm를 나타낸다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

HEK293T, Huh7 세포 내 AAV 혈청형의 형광 강도 그래프; MOI, 시간 변수.
그림 4: 3D 스페로이드에서의 AAV 형질도입은 서로 다른 AAV 혈청형의 활성을 구분한다. (A,C>) HEK293T 및 (B,D>) Huh7 유래 3D 스페로이드에 다양한 MOI 범위로 AAV1, AAV2, AAV5, AAV9 scGFP 트랜스진을 형질도입하였다. 형광 강도 단위는 형광 기반 플레이트 리더(A,B>)와 살아있는 세포 이미징 시스템(C,D>)을 사용하여 72 h에 측정하였다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

AAV 형질전환 효율 그래프 및 히트맵; MOI 대 총 플럭스; 바이러스 벡터 분석.
그림 5: 발광 리포터를 이용한 3D 스페로이드 내 AAV 형질전환. HeLa 스페로이드에 nanoluciferase 리포터 트랜스진을 인코딩하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9을 점진적으로 증가하는 MOI로 형질전환하였다. 형질전환 72시간 후 발광 이미지 시스템의 Endpoint 리드아웃을 사용하여 발광을 시각화하고 측정하였다. (A>) 총 플럭스(Total Flux) 값. (B>) 스페로이드 플레이트의 대표적인 End-point 리드아웃 발광 이미지는 MOI 및 혈청형에 따른 신호 분포를 보여준다. 각 AAV 벡터는 두 개의 수평 반복구로 수행되었다. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

유전자 발현 분석; MOI 대 시간 그래프; sgGFP 형광 강도; 실험 결과.
그림 6: 3D 스페로이드 내 도입 역학 평가. HEK293T 스페로이드에 7가지 MOI 범위에서 AAV2-scGFP(청색)와 AAV2-ssGFP(적색)를 도입하였다(A–G). 전체 녹색 형광 강도를 Monitor spheroid formation/growth 시스템을 사용하여 6시간 간격으로 72시간 동안 측정하였다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

감염다중도(MOI)scGFP (시간)ssGFP (시간)
1>72시간>72
1034.2>72
10016.554.2
10005.623.1
100003.313
1000001.98

표 1: GFP 검출 시작 시간.

보충 그림 1: 스페로이드 적정을 위한 플레이트 배치도. (A) 10,000에서 78 cells 범위의 초기 파종 밀도로 생성된 HEK293T, Huh7, HEP3B 및 HEPG2 스페로이드의 희석 계획을 보여주는 대표 플레이트 배치도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 다양한 세포 파종 밀도에 따른 스페로이드 형성. 10,000에서 78 cells 사이의 초기 파종 밀도로 생성된 HEK293T 및 Huh7 스페로이드의 3일차 대표 현미경 이미지. 스케일 바는 50 µm를 나타냄.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 3D 스페로이드 형성을 위한 세포주 정보.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

부록 그림 4: AAV 연속 희석을 위한 플레이트 배치도. (A) MOI 106부터 시작하여 AAV1, AAV2, AAV5 및 AAV9에 사용된 AAV 연속 희석 도식을 보여주는 대표 플레이트 배치도. H행에는 처리되지 않은 스페로이드를 나타내는 음성 대조군이 표시되어 있습니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 1: MOI 106에서 HEK293T 스페로이드 내 AAV2-scGFP 형질전환의 실시간 살아있는 세포 이미징.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 2: MOI 106에서 Huh7 스페로이드의 AAV2-scGFP 형질도입에 대한 실시간 살아있는 세포 이미징.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 3: MOI 106에서 HEP3B 스페로이드 내 AAV2-scGFP 형질도입의 실시간 살아있는 세포 이미징.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 4: 용량 의존성 연구의 일환으로, MOI 106에서 HEK293T 스페로이드의 AAV2-scGFP 형질전환을 실시간 살아있는 세포 이미징으로 관찰한 모습.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 5: MOI 104에서 HEK293T 스페로이드의 AAV2-scGFP 형질전환 실시간 생세포 이미징.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 영상 6: MOI 101에서 HEK293T 스페로이드의 AAV2-scGFP 형질전환에 대한 실시간 살아있는 세포 이미징.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: AAV 형질전환에 필요한 MOI 계산법.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 AAV 개발 및 역가 시험을 위한 효율적인 in vitro 3D 플랫폼을 제시합니다. 이 플랫폼은 인간 조직 구조와 더 유사한 3차원 세포 배양을 통해 향상된 형질도입, 높은 민감도 및 더 나은 중개 예측 가능성을 활용합니다. 이 시스템은 여러 세포주에서 단일 가닥 및 자가 보완 벡터를 포함하여, AAV 혈청형 및 조절 요소에 따른 형질도입 효율의 차이를 성공적으로 구분해 냅니다. 형질도입 효율을 흔히 외래유전자 양성 세포의 백분율로 정의하는 기존의 2D 분석법과 달리, 3D 스페로이드 시스템은 단일 세포 해상도의 정량이 용이하지 않다는 점에 주목하십시오. 따라서 본 연구에서 형질도입 효율은 전체 리포터 신호 강도(형광 또는 발광)로 정의하며, 이는 형질도입된 세포의 비율과 세포당 외래유전자 발현 수준의 결합된 기여도를 반영합니다. 스페로이드의 높은 민감도는 제품의 대량 사용 필요성을 상당히 낮추어, AAV 연구 및 개발에 있어 비용 효율적이고 다각적이며 생리학적으로 유의미하게 작용합니다.

이러한 접근 방식은 인공 표면으로의 부착에 의존하며 세포 조직화가 결여되어 발생할 수 있는 기존 2D 세포 배양 분석의 주요 문제점들을 해결합니다. 이는 임상 환경에서 벡터 성능에 대한 예측력이 떨어지는 결과로 이어집니다. 3D 스페로이드 시스템은 조직 구조와 약물 분포 패턴을 더 잘 모사하여, 실제 생물학적 조건과 더 밀접하게 일치하는 벡터 거동 데이터를 제공합니다.22,23본 프로토콜은 단순한 초저부착 플레이트를 사용하므로 표준 실험실 환경에서 쉽게 재현할 수 있습니다.

이 적응형 시스템은 AAV 중화 분석, AAV 침투 연구, 그리고 다양한 세포 환경이 AAV 형질전환에 미치는 영향을 조사하기 위한 더욱 복잡한 공배양 실험 개발에 활용될 수 있습니다. 또한, 고처리량 약물 및 벡터 스크리닝 플랫폼을 스페로이드 플랫폼과 쉽게 통합할 수 있어, 보다 표적화된 제품 개발을 위한 벡터 발굴 워크플로우의 자동화와 비용 절감이 가능합니다.

스페로이드의 주요한 실질적 장점은 세포 계대 배양 없이 수주 동안 지속적으로 성장할 수 있어, AAV 활성에 대한 장기적인 연구가 가능하다는 점입니다. 이러한 안정적인 배양 시스템은 중요한 세포 간 상호작용과 매트릭스 구성 요소를 유지하며, 2D 배양에서 필요한 반복적인 세포 수확으로 인한 중단을 방지합니다24. 이렇게 보존된 세포 환경은 AAV의 세포 결합 및 침투를 평가하는 데 필수적인 천연 단백질 조직과 막 구조를 지원합니다25.

3D 스페로이드는 AAV 형질전환 평가에 있어 큰 가능성을 보여주지만, 천연 조직에 비해 구조가 단순하다는 점 때문에 in vivo 모델과 비교했을 때 몇 가지 중개적 단점이 있습니다. 스페로이드는 벡터 전달을 위한 혈관 체계, 면역원성 평가를 위한 면역 세포, 그리고 혈뇌장벽과 같은 조직 특이적 장벽 등 AAV 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있는 핵심적인 생리학적 구성 요소가 부족합니다26. 이러한 한계는 스페로이드가 기존의 2D 배양과 in vivo 동물 모델 사이의 중간 수준의 복잡성을 제공함에도 불구하고, 포괄적인 AAV 평가에 필요한 생리학적 미세환경을 완전히 재현하기에는 여전히 불충분함을 시사합니다.

여기에서 제시하는 스페로이드 프로토콜은 한 번에 단일 세포 유형을 다룹니다. 이 프로토콜은 기본적인 3차원 구조로 응집되는 2~3가지의 추가 세포 유형을 포함하도록 발전시킬 수 있습니다. 오가노이드나 미세유체 장치와 같은 더 복잡한 3D 모델은 특정 기관의 세포 다양성과 조직 구성을 재현하는 다세포 시스템으로, 조직과 유사한 패턴으로 배열된 10가지 이상의 서로 다른 세포 유형을 포함합니다. 이러한 고급 3D 오가노이드는 다중 세포27, 하이드로겔 내장 배양, 현수 적하(hanging drop) 기술 및 미세유체 플랫폼11,27,28을 포함할 수 있습니다. 이러한 방법들은 AAV 생물학에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 될 수 있는 더 복잡한 조직 구조를 제공하지만, 더 전문적인 시약과 장비, 그리고 상당한 기술적 전문 지식이 필요한 경향이 있습니다. 반면, 초저부착 플레이트에서 형성된 3D 스페로이드는 상당히 더 간단하며, 비용 효율성과 재현성이 뛰어나 많은 연구실에서 사용하기에 적합합니다.

본 프로토콜을 성공적으로 구현하기 위한 핵심 단계에는 높은 세포 생존율 유지 과정이 포함되며, 이는 세포 상태가 나쁠 경우 스페로이드 형성 및 형질전환 효율이 저하될 수 있기 때문입니다. 또한, 초저부착 플레이트의 사용과 원심분리 조건의 최적화는 스페로이드의 밀집도를 높이는 데 매우 중요합니다. 약한 신호나 포화를 방지하기 위해 각 세포 유형 및 AAV 혈청형에 맞는 MOI를 최적화하는 것이 필수적입니다. 적절한 검출 방법을 선택하는 것 또한 중요하며, 특히 연속 실시간 세포 이미징 시스템과의 호환성이 요구되는 키네틱 분석의 경우 더욱 그러합니다. 3D 스페로이드에서의 AAV 형질전환을 정확하게 해석하기 위해 몇 가지 기술적 고려 사항이 중요합니다.

형질전환 신호가 낮거나 나타나지 않는 경우는 낮은 바이러스 역가, 최적화되지 않은 MOI 또는 불충분한 배양 시간으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 바이러스 역가를 검증하고 MOI를 최적화하며 배양 시간(통상 3–5일)을 연장함으로써 해결할 수 있습니다. 약한 형광 또는 발광 신호는 낮은 트랜스진 발현이나 3D 구조 내의 제한적인 시약 침투를 반영할 수 있으며, 이는 노출 설정을 최적화하거나 기질 확산에 필요한 추가 시간을 확보함으로써 개선될 수 있습니다. HeLa 세포와 같은 특정 세포주에서의 주요 과제는 자가형광으로, 이는 형광 기반 분석에서 높은 배경 신호와 민감도 저하를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 본 연구에서는 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)가 개선되고 자가형광 배경에서도 더 정확한 형질전환 검출이 가능한 발광 기반 nanoluciferase 리포터 시스템을 구현하였습니다. 또한, 배경 신호는 부적절한 임계값 설정이나 배지 관련 형광으로 인해 발생할 수 있으므로, 처리하지 않은 웰(MOI = 0)을 사용하여 기저 수준을 정의함으로써 이를 제어해야 합니다. 마지막으로, 높은 MOI에서 발생하는 신호 포화는 과도한 바이러스 투입이나 검출기 한계로 인해 나타날 수 있으며, 이는 MOI 범위를 줄이고 검출기 노출 설정을 최적화하여 측정값이 선형 동적 범위(linear dynamic range) 내에 유지되도록 함으로써 완화할 수 있습니다.

종합적으로, 이 3D 스페로이드 방법론은 AAV 형질도입, 효능 및 역동성을 평가하기 위한 효율적이고 재현 가능한 시스템을 제공합니다. 기존의 2D 분석법과 in vivo 연구 사이의 간극을 메움으로써, 보다 정보에 기반한 벡터 개발을 가능하게 하며 임상적으로 유의미한 유전자 치료 전략의 발전을 뒷받침합니다.

공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

저자들은 AAV nanoluciferase 생산을 위한 플라스미드와 live substrate 시약을 제공해 준 Morten Seirup과 Trish Hoang에게 감사를 표합니다. 본 프로젝트는 미국 에너지부와 FDA 간의 기관 간 협정에 따라 Oak Ridge Institute for Science and Education이 관리하는 미국 식품의약국(FDA) CBER의 ORISE 연구 참여 프로그램 임명을 통해 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
37°C 인큐베이터ThermoFisher Scientific#51025983표준 배양 조건
A375 세포ATCCCRL-1619세포주
AAV1 플라스미드Addgene112862AAV 플라스미드
AAV2 플라스미드Addgene104963AAV 플라스미드
AAV5 플라스미드Addgene104964AAV 플라스미드
AAV8 플라스미드Addgene112864AAV 플라스미드
AAV9 플라스미드Addgene112865AAV 플라스미드
BioTek GEN5 플레이트 리더Agilent TechnologiesNA형광 또는 발광 엔드포인트 측정
원심분리기ThermoFisher Scientific#TSO-MX1R스페로이드 현탁액 유지
Corning™ 세포 배양용 인산염 완충 식염수 (1X)Fisher Scientific#MT21040CMX세포 세척용 PBS
DMEM high glucose, GlutaMAX 보충제, pyruvateThermoFisher Scientific#10569010완전 성장 배지
세포 외 NanoLuc 억제제 PromegaN235B세포 외 환경에서 발생하는 모든 Nanoluc® 신호를 소광함  
소태아 혈청 (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mL성장 인자 제공
HEK293T 세포ATCCCRL-3216세포주
HeLa 세포ATCCCRM-CCL-2세포주
HEP3B 세포ATCCHB-8064세포주
HEPG2 세포ATCCHB-8065세포주
Huh7 세포ABMT8973세포주
IncuCyte S3 도립 현미경SartoriusNA스페로이드 형성/성장 모니터링
IVIS Spectrum 이미저SpectralinvivoNA발광 엔드포인트 측정
Nano-Glo® 생존 세포 분석 키트 PromegaN2013생존 세포 검출을 위한 발광 기질 시약
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122박테리아 오염 방지
통기성 T75 조직 배양 플라스크Fisher Scientific#NC0509296 세포 배양용 플라스크
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher Scientific#25300120세포의 효소적 분리
초저부착 플레이트Corning#7007세포 부착을 방지하여 스페로이드 형성 촉진

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