골관절염 환자의 슬개골하 지방 패드에서 작은 세포외 소포의 분리 및 특성 분석

Summary

요약 이 프로토콜은 골관절염 환자의 슬개골하지방 패드 조직에서 작은 세포외 소포(sEV)를 분리하고 특성화하기 위한 표준화된 워크플로우를 제시합니다.

Abstract

세포외소포(EV), 특히 200nm 미만의 소포로 정의되는 작은 세포외소포(sEV)는 세포 간 소포의 필수 매개체 역할을 하며, 거의 모든 세포 유형에서 다양한 생물학적 체액으로 방출됩니다. 슬개하지방 패드(IPFP)는 무릎 골관절염(OA)의 발병 및 진행과 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 IPFP 외부 식물에서 직접 sEV를 분리하는 표준화된 방법은 여전히 제한적입니다. 우리는 OA 환자로부터 얻은 IPFP 조직에서 유래한 sEV의 분리 및 특성화를 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. IPFP 조직 배양에서 채취된 조건 배지는 저속 원심분리로 순차적으로 세포와 이물질을 제거한 후, 초원심분리를 통해 sEV 크기 범위 내의 소포를 농축합니다. 결과된 소포는 세포외 소포(MISEV2023) 권고를 위한 최소한의 정보에 따라 특징지어지며, 서로 다른 기능 범주에 걸친 대표적인 단백질 마커 집합을 사용합니다: 막 관련 테트라스패닌으로서의 CD63, ESCRT(ESCRT) 기계에 의해 매개되는 세포질 생성에 관여하는 세포질 단백질인 ALIX와 TSG101, 그리고 소포체 소상 단백질로서 잠재력을 모니터링하는 칼넥신 비소포성 오염. 이 워크플로우는 골관절염 연구에서 기능적 분석이나 프로테옴 프로파일링과 같은 후속 응용에 적합한 명확한 sEV 제제를 생성합니다.

Introduction

작은 세포외소포(sEVs)는 국제세포외소포학회(ISEV MISEV2023)가 제시한 작전 분류에 따르면, 일반적으로 지름¹이 200 nm보다 작은 소포로 정의되는 이질적인 소포입니다. sEV는 거의 모든 세포 유형에서 생물학적 체액으로 방출되며, 생리적·병리학적 맥락에서 세포 간 소통의 매개체로서 필수적인 역할로 인해 점점 더 주목받고 있습니다 ^2,3.

sEV의 막은 여러 기능 단백질로 풍부하게 이루어져 있습니다. 그중 CD63과 같은 테트라스패닌은 소포막 조직과 융합과 관련이 있습니다^. 더불어, 수송에 필요한 ESCRT(원도체체 분류 복합체)와 관련된 세포질 단백질인 ALIX와 TSG101은 sEV의 생합성과 분비에 필수적입니다. 따라서 이들은 분리된 소포의 내체체 기원을 확인하는 신뢰할 만한 표지자 역할을 합니다 ^5,6.

슬개하지방 패드(IPFP)는 골관절염(OA^)의 시작 및 진행과 밀접하게 연관된 활성 관절 관련 조직으로 인식되었습니다^7,8. 염증성 및 퇴행성 상태에서 IPFP에서 유래한 sEV는 염증 매개체와 병원성 신호를 지니고 있으며, 이로 인해 활막 염증과 연골 분해에 기여할 것으로 추정됩니다^. 따라서 골관절염 환자로부터 IPFP 조직이 분비하는 sEV를 특성화하는 것은 질병 관련 세포간 통신망에 대한 중요한 통찰을 제공할 수 있습니다.

분자 매개 및 잠재적 치료제로서 sEV에 대한 관심이 높아지고 있는 만큼, 고수율, 고순도, 재현 가능한 분리 접근법의 확립이 필수적입니다. 차등 초원심분리는 여전히 가장 널리 사용되는 정제 전략 중^{하나이지만}, 세포 배양 상원액이나 생체유체에 최적화된 프로토콜은 IPFP와 같은 고형 지방 유래 조직에는 직접적으로 적용되지 않을 수 있습니다. 높은 지질 함량, 밀도가 높은 세포외 기질, 그리고 다양한 효소 소화 조건은 소포 회복과 순도에 영향을 미칠 수 있습니다.

조직 이식 배양은 토착 세포 구조와 세포 간 상호작용을 보존하면서 과도한 효소 교란을 최소화하는 생리학적으로 중요한 접근법을 제공하여, 거의 원래의 조건에서 방출된 sEV를 수집할 수 있게 합니다. 하지만 IPFP 이식 배양에서 sEV를 분리하기 위해 특별히 맞춤화된 표준화된 워크플로우는 현재 부족합니다.

여기서는 차별적 초원심분리를 사용하여 골관절염 환자의 슬개하지방 패드 이식 배양에서 작은 세포외 소포를 분리하고 특성화하는 단계별 프로토콜을 설명하며, 하위 기능 및 중개 연구를 위한 재현 가능한 방법론적 틀을 제공합니다.

Protocol

이 연구에서 골관절염 환자로부터 IPFP 조직을 사용한 것은 허베이의과대학교 제1병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 [2024] 018). 샘플 채취는 승인된 기간 내에 이루어졌으며, 조직 채취 전에 모든 참가자로부터 서면 동의를 받았습니다.

1. 배지 및 용액의 준비

1. 기저 DMEM/F12 배지 445 mL, 엑소좀 없는 태아 소 혈청 50 mL(10%), 페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B 5 mL(각각 100 U/mL, 100 μg/mL, 0.25 μg/mL)를 혼합하여 500 mL의 엑소좀 고갈된 완전 DMEM/F12 배지를 준비합니다. 0.22 μm 필터를 통해 필터 멸균을 합니다.
2. 웨스턴 블롯 러닝 버퍼를 950mL 증류수(dH_2O)와 20배 버퍼 50mL(Tris/MOPS/SDS)를 혼합하여 준비합니다.
3. 웨스턴 블롯 전이 버퍼를 800 mL dH₂O와 100 mL 10x 전이 버퍼 100 mL, 절대 에탄올 100 mL를 혼합하여 준비합니다.
   참고: 이 고속 전송 버퍼는 상온에서 고전류 습식 전송(400 mA)을 위해 특별히 최적화되었습니다. 열 발생이 적기 때문에 45분 미만의 전달 시간에는 얼음 욕조가 필요하지 않으며, 이는 10–250 kDa 범위 내 단백질에서 높은 전달 효율을 유지하는 것으로 나타났습니다.
   주의: 절대 에탄올은 인화성입니다. 환기가 잘 되는 곳에서 다루고 열원에서 멀리 떨어뜨리세요.
4. 세척 버퍼는 20 x TBS(200 mM Tris 및 3 M NaCl, pH 7.5–7.6)와 Tween-20 20 mL, dH₂O 950 mL를 혼합하여 세척 버퍼를 준비합니다.
5. 루미놀/인핸서 용액과 과산화물 완충제를 같은 양으로 혼합하여 화학발광 작업 용액을 준비합니다(막 제곱센티미터당 약 0.1 mL의 작업 용액이 필요합니다).
   주의: 화학발광 기질은 자극적일 수 있습니다. 장갑과 안구 보호구를 착용하세요. 화학 폐기물은 지역 기관 규정에 따라 처리해야 합니다.

2. IPFP 조직 준비 및 조건 배지 수집

1. 신선히 얻은 IPFP 조직(약 10g)을 원심분리관 내에서 부드럽게 수동적으로 저어주어 잔류 혈액을 완전히 제거하기 위해 50mL 미리 냉각된 PBS와 세 번 세척합니다.
2. IPFP 조직을 멸균 가위나 메스로 약 2mm x 2mm x 2mm 크기로 잘게 썰어주세요.
3. IPFP 조직 조각을 T175 플라스크에 옮깁니다. 엑소좀 고갈된 DMEM/F12 완전 배지 50 mL를 추가합니다. 37°C에서 5% CO₂를 넣고 48시간 동안 부드럽게 교반하여 배양하세요.
4. DMEM/F12 완전 배지(즉, 조절된 배지)를 50mL 튜브에 얼음 위에 담아 채취합니다. 조직 이물질을 제거하기 위해 70 μm 체를 걸러내세요.

3. 차동 초원심분리를 이용한 sEV 분리

참고: 다음 모든 단계는 4°C 또는 얼음 위에서 수행하세요.

1. 조직 이물질 제거를 위한 초기 저속 원심분리
   1. 조절된 배지를 300 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 상원액을 조심스럽게 수집하여 새로운 50mL 원심분리관으로 옮기세요.
   2. 상청액을 3,000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 상청액을 수집하여 새로운 튜브로 옮기면서 펠릿이 손상되지 않도록 하세요.
2. 중간 원심분리 및 여과.
   1. 상청액을 10,000 x g 에서 4 °C에서 30분간 원심분리합니다.
   2. 상원액을 수집하여 0.22 μm 진공 필터를 통해 더 큰 소포와 오염물을 제거합니다.
3. 첫 번째 초원심분리: sEV 펠릿.
   1. 여과된 상정액을 40mL 폴리카보네이트 원심분리관에 옮깁니다.
   2. 고정 각도 로터(k-팩터 = 70)를 사용해 110,000 x g 크기에서 4 °C에서 70분간 초원심분리합니다. 피펫을 사용해 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
   3. 펠릿을 10mL의 미리 냉각된 멸균 PBS에 재현탁합니다. 재현탁된 용액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과하여 남은 골재를 제거합니다.
4. 두 번째 초원심분리: sEV 정제
   1. 고정각 로터(k-팩터 = 70)를 사용해 110,000 x g 에서 4 °C에서 70분간 서스펜션을 다시 초원심분리합니다.
   2. 상청액을 조심스럽게 버리고, sEV 펠릿은 튜브 바닥에 남겨두세요. 마지막 sEV 펠릿을 멸균 PBS 200 μL에 재현탁합니다.
   3. sEV 서스펜션을 20 μL 알리코트로 나누어 반복적인 동결-해동 사이클로 인한 손상을 방지하세요. 장기간 사용할 때는 -80°C에서 보관하세요.

4. 서부 블롯 분석을 통한 sEV의 특성 파악

1. sEV 단백질 샘플을 준비하세요.
   1. 3.5.2단계의 sEV 펠릿을 80–120 μL RIPA 용해 완충제와 프로테아제 억제제를 보충하여 혼합합니다.
      참고: 추정 단백질 0.5–1.0 μg당 약 1 μL RIPA 버퍼 비율을 목표로 하십시오. 효율적인 전기영동 분리와 웨스턴 블롯 분석 시 고품질 신호 검출을 위해 최소 1.0 μg/μL 이상의 최종 단백질 농도가 권장됩니다.
      주의: RIPA 버퍼에는 세제와 자극제가 포함되어 있습니다. 개인 보호 장비를 착용하세요.
   2. 혼합물을 잠시 보텍스(Votex)한 뒤 샘플을 얼음 위에 15–30분간 부드럽게 흔들며 부드럽게 부양시킵니다.
      참고: 이 단계에서 철저한 혼합이 완전한 막 붕괴와 최적의 단백질 방출에 매우 중요합니다. 소용돌이 불량은 분해 불완전 및 복제체 간 단백질 농도의 불일정을 초래할 수 있습니다.
   3. 용해액을 12,000–14,000 x g 에서 10–15분 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 채취하세요.
   4. 고감도 비신코닉산(BCA) 단백질 분석법을 사용하여 sEV 용해액의 총 단백질 농도를 측정합니다.
      참고: 검출 범위가 낮음(0.5–20 μg/mL)으로 인해 정제된 sEV 제제에서 얻는 일반적으로 낮은 단백질 농도를 정량화할 수 있기 때문에, 표준 BCA 분석보다 고감도 BCA 검사를 권장합니다. 키트 프로토콜에 따라 분석을 수행하세요.
2. 서부 블롯 분석.
   1. 단백질 샘플을 5개의 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼와 혼합합니다.
      참고: CD63 검출을 위해서는 비환원 5배 로딩 버퍼(β-머캅토에탄올 제외)를 사용하여 샘플을 준비하고 70°C에서 10분간 배양하세요. 이러한 조건들은 구조적 에피토프를 보존하고 이 테트라스패닌 단백질의 열에 의한 응집을 방지합니다. ALIX(ALG-2 상호작용 단백질 X), TSG101(종양 감수성 유전자 101), 칼넥신 등 다른 마커의 경우, 10% β-머캅토에탄올이 포함된 환원 5배 로딩 버퍼를 사용해 샘플을 준비하고 95°C에서 5분간 가열하여 단백질 완전 변성을 보장합니다.
   2. 준비된 샘플(일반적으로 총 단백질의 20–40 μg)을 프리캐스트 그라디언트 젤(4%–12%)에 적재합니다.
   3. 제조사의 권장에 따라 단백질 분자량 마커를 지정된 우물에 적재하세요.
   4. 젤을 러닝 버퍼에 100V 일정 전압으로 돌리세요.
   5. 1–1.5시간 동안 반복하거나, 로딩 염료가 젤 바닥에 도달할 때까지 반복하세요.
      참고: 실행 시간은 전기영동 시스템과 젤의 비율에 따라 다를 수 있습니다.
   6. 젤에서 PVDF 막으로 단백질을 400 mA의 습식 전달 시스템을 사용하여 30분간 전달합니다.
      참고: 전송 시간은 사용되는 전송 버퍼 브랜드에 따라 다를 수 있습니다.
   7. 단백질 없는 차단 완충제를 0.2% Tween-20(TBS-T)이 포함된 삼중완충 식염수에 넣어 상온에서 30분간 부드럽게 저어주며 막을 차단합니다. 차단 완충제는 비특이적 결합과 배경 간섭을 최소화하기 위해 혈청 단백질, 비오틴, 인산화 단백질 없이 조제됩니다.
   8. 단백질 기반 안정제와 항체 보존 첨가제가 포함된 혈청 무첨가 항체 희석 완충제에 희석된 특정 1차 항체를 4°C에서 12–16시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.
   9. 세척 완충제(TBST 0.2% Tween-20 함유)에서 셰이커에서 부드럽게 저어주면서 막을 세척하세요.
   10. 적절한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하여 막을 배양합니다.
   11. 세척 완충제로 다시 세척 완충제를 사용해 셰이커에서 부드럽게 저어줍니다.
   12. 화학 발광 기질을 이용해 단백질 밴드를 시각화하세요.
       주의: 화학발광 기질은 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 적절한 장갑과 안전안경을 착용하세요. 기질은 기관 유해 폐기물 지침에 따라 처리해야 합니다.

5. 나노입자 추적 분석(NTA)을 통한 sEV의 특성 분석

1. 제조사 지침에 따라 나노입자 추적 분석기와 주사기 펌프 모듈을 켜고, 측정 전 최소 30분 동안 시스템이 평형을 이루도록 하세요.
2. EV 샘플을 얼음 위에서 부드럽게 해동한 후, 권장 측정 범위(약 1 x 10⁸에서 1 x 10 9 입자) 내에서 무균 무입자 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하여 최적의 입자 농도를 달성합니다.
3. 희석된 샘플 1mL를 멸균 주사기에 주입한 후 천천히 측정실에 주입하여 기포가 생기지 않도록 합니다.
4. 카메라 레벨과 초점을 조정하여 개별 입자가 브라운 운동을 보이도록 선명하게 시각화하세요.
5. 주사기 펌프를 사용해 일정한 유량 조건에서 각 샘플에 대해 60초 동안 지속되는 3개의 영상을 녹화하여 입자의 일정한 분포를 보장합니다.
6. NTA 소프트웨어를 사용해 녹화된 영상을 분석하고, 감지 임계값은 12, 블러 크기는 자동으로 설정, 최대 점프 거리는 자동으로 설정하세요.
7. 소프트웨어의 자동 분석 기능을 사용하여 입자 크기 분포와 농도 프로필을 생성합니다.
8. 원시 데이터, 입자 크기 분포 그래프, 농도 측정값은 추가 통계 분석을 위해 내보내세요.
9. 측정실을 무균 무입자 물로 철저히 세척한 후 70% 에탄올을 사용한 후, 샘플 간 교차 오염을 방지하기 위해 무균 무분천수로 다시 세척하세요.

6. 투과 전자현미경(TEM)을 통한 sEV의 특성 분석

1. 탄소 코팅된 200메시 구리 그리드를 사용하세요. 가능하다면 글로우 방전 시스템을 사용하여 그리드에 30초간 글로우 방전을 수행합니다.
2. 멸균 필터링된 PBS에 재현탁된 sEV 현탁액 10 μL을 그리드에 적용하고 실온에서 2–5분간 배양합니다.
3. 과잉 액체를 제거하려면 필터 페이퍼로 격자 가장자리를 살짝 만져보세요.
4. 샘플이 적재된 표면을 순차적으로 초순수한 물 세 방울 위에 놓아 그리드를 세척합니다.
5. 2% 인산화산 용액(pH 7.0) 10 μL 격자에 적용하고 상온에서 1–2분간 배양합니다.
   주의: 인산화는 부식성 산성 시약으로, 피부, 눈, 호흡기에 자극을 줄 수 있습니다. 장갑과 안구 보호 장비 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 기관 안전 지침에 따라 취급하세요. 착색된 폐기물 및 오염된 물질은 승인된 유해 화학 폐기물 절차에 따라 처리하십시오.
6. 여과지로 과잉 얼룩을 제거하고, 그리드를 실온에서 최소 10분간 완전히 자연 건조시키세요.
7. 80kV의 가속 전압으로 작동하는 투과 전자현미경을 사용해 그리드를 조사합니다.
8. 소포 형태를 평가하기 위해 적절한 배율로 대표적인 이미지를 촬영하세요.

Results

인간 슬개골하지방 패드(IPFP) 조직에서 작은 세포외 소포(sEV)를 성공적으로 분리한 것이 다중 양식 특성 분석을 통해 확인되었습니다.

투과 전자현미경(TEM)은 분리된 소포가 특징적인 컵 모양과 명확하게 정의된 지질 이중층 막을 보였으며, 이는 sEV의 구조적 특징과 일치함을 보여주었다(그림 1)¹¹.

그림 1: 작은 세포외소포(sEV)의...

Discussion

이 프로토콜은 이식 배양 후 차등 초심분리를 통해 인간 슬개골하지방 패드(IPFP) 조직에서 작은 세포외 소포(sEV)를 분리하는 재현 가능하고 실용적인 워크플로우를 제공합니다. 분리된 소포는 투과 전자현미경(TEM), 나노입자 추적 분석(NTA), 웨스턴 블롯 검출 등 상호 보완적인 특성화 방법으로 검증되었습니다^. TEM은 특징적인 형태를 가진 막 결합 소포의 존재를 확인했고, NTA는 sEV 집단과 일치하는 크기 분포를 보였으며, 웨스턴 블롯 분석은 CD63, Alix, TSG101의 존재를 확인하면서도 칼넥신의 부재를 확인하여 세포내 소기관의 오염이 최소화됨을 시사하였다. 이 결과들은 구조적으로 온전하고 분자적으로 검증된 sEV를 IPFP 조직에서 분리하는 데 있어 이 프로토콜의 효과성과 신뢰성을 입증합니다.

이 프로토콜의 핵심 방법론적 특징은 효소 소화 대신 조직 이식 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 mL PET 원심분리관	히맥 (에펜도르프 히막 테크놀로지스)	5720411148	폴리에틸렌 테레프탈레이트, 26 x 90 mm
70 & 마이크로; m 셀 스트레이너	베이징 란제커 테크놀로지	560049	조직 이물질 제거를 위해
항알릭스 항체	상하이 애브웨이즈 생명공학	7215년	sEV 양성 표지
항칼넥신 항체	상하이 애브웨이즈 생명공학	CY5839	음성 마커 (소포체 오염)
항 CD63 항체	어피니티 바이오사이언스	DF2305	테트라스파닌 마커
항 TSG101 항체	상하이 애브웨이즈 생명공학	CY5985	sEV 양성 표지
BCA 단백질 분석 키트	상하이 야메이 바이오테크놀로지	ZJ102	단백질 정량화를 위해
세포 배양 플라스크 (T175)	NEST 생명공학	560229	IPFP 익스플랜트 배양을 위해
원심분리기 튜브 (50 mL)	바이오필	560041	초기 저속 스텝에 대해
엑소좀 고갈된 태아 소 혈청	카이젠 바이오사이언스	FBSNE-01061	조직 배양을 위해
HRP 염소 항토끼 IgG	상하이 애브웨이즈 생명공학	AB0101	WB에 대한 2차 항체
즉석 단백질 로딩 버퍼 (변성, 환원, 5회 포함)	상하이 야메이 바이오테크놀로지	LT101	단백질 변성에 대해
마이크로 BCA 단백질 분석 키트	써모 사이언티픽	23235	단백질 정량화를 위해
Millex-GP 필터 유닛 (0.22 & 마이크로; m)	베이징 란제커 테크놀로지	560360	소포 여과를 위한 멸균
나노입자 추적 분석기	말번 파날리티컬	나노사이트 NS300	크기 및 농도 분석을 위해
옴니플래시 얼음 없는 신속 전송 버퍼	상하이 야메이 바이오테크놀로지	PS201S	웨스턴 블롯 단백질 전달을 위한
인산산 (2%)	시그마-올드리치	P4006	TEM 네거티브 염색을 위해
단백질 로딩 버퍼 (변성, 비환원, 5×)	상하이 야메이 바이오테크놀로지	LT103	단백질 변성에 대해
단백질 없는 신속 차단 버퍼 (5×)	상하이 야메이 바이오테크놀로지	PS108	막을 막을 때
RIPA 용해 완충제	베이징 솔라비오 과학 및 기술 유한회사	R0010	sEV 단백질 추출을 위해
TBS(20번)	베이징 솔라비오 과학 및 기술 유한회사	T1080	세척 완충제 준비
투과 전자현미경	히타치	HT7800	형태학적 특성화를 위해
Tris/MOPS/SDS 전기영동 완충기	상하이 야메이 바이오테크놀로지	PS120	단백질 분리를 위해
트윈-20	베이징 솔라비오 과학 및 기술 유한회사	T8220	세척 완충제 준비
초원심분리기	히맥 (에펜도르프 히막 테크놀로지스)	CP100NX	고속 격리 시스템
초민감 화학발광 탐지 키트	상하이 야메이 바이오테크놀로지	SQ201	단백질 밴드 시각화를 위해
범용 항체 희석 버퍼	상하이 야메이 바이오테크놀로지	PS119L	1차 및 2차 항체에 대해