방법 논문

쥐의 중뇌동맥 선택적 및 영구 폐색: 운동 및 공간 기억 결손 연구를 위한 실험적 접근법

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DOI:

10.3791/70519

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2026년 3월 20일

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1Endocrine Physiology and Metabolism Laboratory, State University of Western Paraná, 2Laboratory of Experimental Morphology, State University of Western Paraná

이 논문에서

요약

본 연구의 목적은 쥐에서 두개골 절제술 후 영구적이고 선택적인 중뇌동맥 폐색을 수행하는 재현 가능한 방법을 확립하여 운동 및 공간 기억 결손에 대한 실험 연구에 적용하는 것이었습니다.

초록

임상적으로 중요한 중요성을 지닌 허혈성 뇌졸중(IS)은 새로운 보조제 치료법 개발을 가능하게 하는 실험적 접근법을 요구합니다. 뇌 혈관 해부학이 인간과 유사하기 때문에, 쥐는 IS의 실험 모델로 널리 사용되고 있습니다. 그러나 선택적 동맥 폐색을 우선시하는 접근법을 적용하면서, 인간에서 관찰되는 허혈 환경을 더 유사하게 생성할 수 있는 방법이 여전히 필요합니다. 이 맥락에서 본 연구의 목적은 쥐에서 두개골절제술 후 중대뇌동맥(MCA)의 영구적이고 선택적 폐쇄를 수행하는 재현 가능한 방법을 확립하고, 모델을 표준화하며 운동 및 공간 기억 결손 연구에 적용할 때 기술적 도전을 줄이는 것이었습니다. 위스타 쥐(N = 28)는 두 그룹으로 균등하게 나뉘었는데, 한 그룹은 두개골 절제술(SHAM)을 했고, 다른 그룹은 두개골 절제술 후 선택적 MCA 폐합(MCAO)을 시행했습니다. 수술 후 7일째와 8일째에는 각각 자세 검사와 물체 위치 인식 기억 검사가 수행되었습니다. 안락사 후에는 뇌 표본을 채취하고 니슬 염색된 조직학 절편을 준비했다. 방법의 실현 가능성과 효과를 입증하기 위해, 수술 전 준비, 마취, 위치 조정, 두개골 절제술, MCAO, 폐쇄 등 상세한 수술 프로토콜이 개발되었습니다. 적용된 방법은 MCAO 그룹에서 결함을 보여주었으며, 자세 검사(p = 0.015)와 물체 위치 인식 기억 검사(p < 0.001)에서 이를 확인할 수 있습니다. 조직학적 분석 결과, 외부 캡슐 외에도 해마 관련 부위(예: 주위피질, 내감피질, 이상피질)가 손상되었으나, 더 깊은 뇌 구조는 보존됨이 확인되었습니다. 이 프로토콜은 쥐에서 선택적 MCA 허혈을 유도하는 재현 가능하고 효과적인 방법임이 입증되었으며, 허혈성 뇌졸중의 병태생리학적 및 치료 기전을 조사하는 실험 연구에 유효하고 기술적으로 접근 가능한 도구로 제시됩니다.

서론

허혈성 뇌중(IS)에서 경각 부위를 둘러싼 허혈성 반음은 적시에 치료를 시행하면 회복이 가능하며, 이를 통해 운동 및 기억 장애를 예방하거나 완화하는 것을 목표로합니다. 그러나 화학적 혈전용해술과 기계적 혈전절제술과 같은 치료법은 인구의 상당 부분에게 임상 실무에서 접근성이 여전히 부족해보다 널리 이용 가능한 치료 전략을 연구하기 위한 실험적 모델의 필요성을 뒷받침합니다. 동물 연구는 재현성과 측부 순환 분석 능력 때문에 필수적입니다.3, 쥐는IS 모델에 널리 사용되고 있습니다. 인간 IS5와 혈관 직경과 밀접한 상관관계 때문에, 중뇌동맥(MCA)은 동맥 폐색 실험 연구에서 주요 표적 혈관입니다.

뇌허혈을 유도하는 데 가장 널리 사용되는 동물 모델 중 하나는 필라멘트 기반 하강내 폐색 후 재관류 9,10입니다. 그럼에도 불구하고, 필라멘트의 MCA 내 정확한 위치, 윌리스 원 인접 혈관의 우연한 폐색, 수술에 필요한 외경동맥(ECA) 결찰로 인한 부수적 영향, 그리고 폐쇄 지속 시간 등이 메타분석에서 상반된 결과를 낳았다11,12.

임상 현장에서 대부분의 IS 환자는 뇌 재관류를 이루지 못하며, ECA 폐색과 관련된 시상하부 손상이나 후유증을 보이지 않아, 선택적 허혈을 유도하는 실험적 접근법의 필요성을 강조합니다. 대안으로는 두개골절제술을 통해 시행하는 영구 MCA 폐색술(MCAO)이 있습니다. MCA를 직접 시각화함으로써 선택적 폐합은 ECA 결찰과 전방 맥락막, 시상하부, 후방 대뇌동맥 손상을방지하여 방공경색에서 관찰되는 허혈 증상과 더 유사하게 나타납니다.

최근 연구들은 IS 동물 모델이 허혈 부위와 부정적 임상 결과 사이에 더 밀접한 상관관계를 보여야 함을 시사합니다(14,15). 결과에 영향을 미치는 합병증을 최소화하면서 허혈을 표적으로 유도할 수 있는 기술적 대안을 개발하는 것이 가장 적합한 전략으로 보입니다. 이 맥락에서 본 프로토콜의 목표는 쥐에서 두개골절제술을 수행하고 영구적이고 선택적인 MCAO를 수행하는 재현 가능한 방법을 확립하여 모델을 표준화하고 기술적 어려움을 줄여 운동 및 공간 기억 결손 연구에 활용하는 것이었습니다. 이 접근법은 높은 생존율을 입증한 고전 연구 16,17,18,19에서 적용되어 장기 평가가 가능했습니다.

하대뇌정맥(ICV)을 해부학적 기준점으로 사용하여 이 프로토콜은 역사적으로 이 접근법의 주요 한계로 지적되어 온 기술적 어려움을 해소하고, 급성 및 만성 상태 모두에서 선택적 뇌허혈을 조사할 수 있도록 합니다. 운동 기능과 공간 기억이 평가되어 제안된 병변 모델에 의해 유발되는 결손을 검증했으며, 허혈성 뇌 영역의 조직학적 분석도 수행하였습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 국가 동물실험통제위원회(CONCEA)가 수립한 실험동물 관리 및 사용 지침을 따랐으며, 서파라나 주립대학교(UNIOESTE) 동물실험 윤리위원회(CEUA)의 승인을 받았으며, 프로토콜 번호 25-23을 받았습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 수술 기구, 거즈, 면봉을 준비하고 입체현미경을 위치시키세요(그림 1).
  2. 수술 테이블과 장비를 70% 에탄올로 청소하세요.

2. 마취

  1. 케타민(3.75 mL), 자일라진(2.5 mL), 0.9% 염화나트륨(3.75 mL) 혼합물로 마취를 유도합니다. 체중 100g당 0.2 mL를 복강 내 투여합니다. 뒷발이나 꼬리로 마취 깊이를 확인하세요.
  2. 필요 시 과다복용을 방지하기 위해 최대 용량의 3분의 1에 해당하는 추가 용량을 투여하세요.
  3. 예방적 항생제인 엔로플록사신(20 mg/kg)과 진통제 트라마돌 하이드로클로라이드(12 mg/kg)를 복강 내 투여합니다.
  4. 항장 체온을 측정하고 시술 내내 온열 패드를 사용해 37°C(± 2°C)로 체온을 유지하세요.

3. 위치 선정

  1. 쥐를 현미경 스테이지의 솜 패드 위에 측면 디큐비투스로 놓습니다(그림 1A). 머리를 작은 부드러운 롤로 받치고 180°로 정렬하여 두개골의 왼쪽 측면을 노출시킵니다. 헤드를 접착 테이프로 고정하세요(그림 2A).
  2. 윤활제 안약을 바르고 눈꺼풀을 테이프로 감으세요.
  3. 직장 온도를 다시 확인하고 필요하면 가열원을 조절하세요.

4. 두개골 절제술

  1. 미니 트리코토마이저 또는 면도날을 사용해 측안과 트라거스 사이(약 1.6 cm × 0.5 cm)를 시행합니다(그림 1B).
  2. 면도한 부위를 2% 클로르헥시딘 스크럽과 0.2% 수용성 클로르헥시딘으로 소독하세요.
  3. 직선 가위로 1cm 크기의 피부와 피하 절개를 하며(그림 1C), 외안각 뒤쪽 0.3cm 경계와 악모 앞쪽에 경계를 유지합니다(그림 2B).
    참고: 이 층은 Adson 겸자(그림 1D)나 정혈 겸자로 당겨야 합니다.
  4. 전기소작술을 사용하여 표재성 측두혈관의 중간 측두지(측두기 분지)를 확인하고 응고시키세요(그림 1E).
  5. 더 자유로운 엘리베이터(그림 1F)로 지혜충궁을 촉지하고, 측두근막을 세로 절개합니다.
  6. 측두근을 두개와 후쪽 측면에서 해리하여 측두골과 전두골, 그리고 교근 일부를 노출시킵니다. 광대궁을 종방향으로 분리하고 약 0.5cm 크기의 마디를 제거한다(그림 2C).
    1. 주의사항:
      1. 압박 또는 전기소작술을 사용하여 상악혈관의 전부 깊측두지에서 발생하는 출혈을 조절합니다.
      2. 측두하악관절 손상을 막기 위해 후방 사근 절개는 피하세요.
      3. 아치 아래에 위치한 안와외 눈액선 손상을 피하세요.
      4. 안와 공동을 열지 마세요.
  7. 저속 회전 모터에 장착된 직경 3.5mm 원형 다이아몬드 코팅 버를 사용해 광관절 아치 제거 부위 바로 뒤쪽의 측측두골을 드릴링합니다(그림 2D). 열손상을 방지하기 위해 0.9% 식염수로 간헐적으로 관개하세요. 경막에 작은 뼈 조각을 붙여 두고(그림 2E), 할스테드 겸자(그림 1H)로 부드럽게 제거하세요.
    참고: 작은 드릴 비트를 사용하는 두개골 절제술은 대안이지만 경막질 및 뇌 손상 위험을 증가시킵니다.

5. MCA 폐색 (그림 3)

  1. 경막을 6mm × 0.25mm 초미세 바늘로 열어.
    참고: 인접한 피질 혈관을 손상시키지 마세요.
  2. 두개골절제술 창문 아래의 하대뇌정맥(ICV)과 그 위에서 수직으로 교차하는 MCA를 확인하라(그림 3A, C). 두개골절제부 중앙에 위치한 기저부와 가장 두꺼운 MCA 가지를 식별합니다.
  3. 흡수되지 않는 8-0을 패스하세요 미세 바늘 홀더를 이용해 MCA 주변에 폴리프로필렌 봉합을 합니다(그림 3B 및 그림 1I). 혈관을 막기 위해 세 개의 매듭을 묶습니다(그림 3C).
    참고: 나일론, 면, 실크 등 다른 비흡수성 봉합사도 사용할 수 있습니다.
  4. 하류 혈류가 없는지 확인해. 추가로 MCA 지류가 있다면 그것도 결찰하세요.
  5. 필요 시 생리식염수로 충혈하고 전기소작 또는 부드러운 압박으로 혈전을 시행하세요.
    참고: 조직학적 또는 신경염증성 인공물을 예방하기 위해 뇌 조직 응고를 피하세요.

6. 폐쇄

  1. 가능하면 경막을 다시 근사하세요.
  2. 깊은 근육층을 재조정하고 측두근근막을 흡수성 4-0 봉합사로 봉합합니다(그림 3D).
  3. 흡수성 4-0 폴리글락틴 910 봉합사로 피하 및 피부층을 연속 패턴으로 봉합하세요.
    참고: 노출된 봉합 끝을 남기지 마세요. 지속적인 봉합이 권장됩니다.
  4. 수술 부위를 0.2% 수용성 클로르헥시딘으로 세척하세요.
  5. 마취에서 회복할 때까지 동물들을 따뜻하게 유지하세요. 우리에 다시 넣기 전에 온도를 모니터링하세요. 피부 절개부터 상처 봉합까지의 총 수술 시간은 보통 30분에서 45분 사이입니다.
  6. 수술 다음 날에는 예방적 항생제 두 번째 투여를 하세요.

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결과

총 28마리의 수컷 위스타 쥐(10–12주, 평균 체중 349g)는 무작위로 두 그룹으로 균등하게 나뉘었다: MCAO(기술된 완전한 프로토콜에 제출)와 SHAM(두개골절제술 단계에만 제출됨). 본 연구에서는 3마리의 동물이 수술 중 배제되었고, 정맥 출혈(2 MCAO) 또는 두개골 절제술 중 경미한 피질 손상(1 SHAM)으로 인해 교체되었습니다. 수술 후 5일째에 추가로 한 마리의 MCAO 동물이 사망했습니다. 모델의 전체 사망률은 3.6%였습니다. 최종 분석된 표본은 27마리의 동물로 구성되었습니다. 운동 및 공간 기억 능력은 각각 수술 후 7일차와 8일차에 평가되었습니다(그림 4, 그림 5).

수술 후 7일째에 자세 검사를 통해 운동 수행 능력이 평가되었습니다. 쥐는 꼬리에 매달려 반대쪽 앞다리의 움직임을 평...

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토론

쥐의 MCAO 모델은 1975년부터 뇌 허혈의 실험 패러다임으로 사용되어 왔으며, 수년에 걸쳐 다듬어져 신경학적 손상 유도에 효과가 있음을 입증했습니다 8,22,23,24,25,26,27,28. MCA에 직접 신경외과적으로 접근하는 기술적 어려움으로 인해, 혈관내 섬유 폐색 기법이 널리 사용되...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

이 작업은 대학원 지원 프로그램(PROAP)의 지원을 받아 교육 또는 연구 재정 지원 프로젝트(Financial Assistance for Educational or Research Project, 절차 번호 88881.594204/2020-01, 보조금 번호 1359/2020)를 통해 지원받았습니다. 프로젝트 전반에 걸쳐 기술적·학술적 지원을 해주신 UNIOESTE 생리학, 대사 및 인체 해부학 연구실(Unioeste, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 브라질 캠퍼스 대학교)의 교수, 기술자, 학생들께 감사드립니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Adson toothed forcepsABC 스테인리스L47-P4-164다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Castroviejo needle holderGolgran135-3다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
ElectrocauteryChunguang 의료128다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Freer elevatorABC 스테인리스47P4-819다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Halsted curvedABC 스테인리스AI1055다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Micro drillNail drillZS-710다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Mini trichotomizerKemeiKM-666다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
ProleneEthicon 8730H8-0 사이즈 봉합사
StereomicroscopeAlltionASM-112다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Straight scissorABC 스테인리스L23-W4다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Surgical compresseCremer158595다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
Surgical gauzeCremer198669다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
ThermometerG-TechDMT-2027다른 회사에서 다른 옵션이 제공될 수 있습니다
VicrylEthicon VCP346H4-0 사이즈 봉합사
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