냉동 버피 코트 샘플에서 유도된 다능성 줄기세포주 재프로그래밍

요약

현재 프로토콜은 제조사 지침에 따라 재프로그래밍이 어려운 환자 샘플의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 유도 문제를 해결하는 절차를 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 버피 코트 샘플에 특이적이지만 정제된 PBMC 재프로그래밍에도 적용될 수 있습니다.

초록

인간 다능성 줄기세포(hPSCs)는 질병 모델링에 유용한 도구입니다. 추가로 성체 체세포에서 재프로그래밍된 줄기세포는 유도다능줄기세포(iPSC)라고 부릅니다. iPSC 기술은 특정 연구 참가자와 집단을 평가하고 맞춤형 의학 분야로 진출할 수 있게 합니다. 혈액은 연구 목적으로 정기적으로 채취되어 냉동 보존됩니다. 이 샘플들은 백혈구와 혈소판이 포함된 혈액 샘플인 버피 코트(buffy coat)나 호산구, 호염기구, 혈소판, 적혈구가 없는 보다 정제된 백혈구 집단인 말초혈 단핵 세포(PBMC)로 처리됩니다. 두 방법 모두 재프로그래밍 가능한 체세포를 쉽게 구할 수 있고 비교적 비침습적인 공급원입니다. 여러 보고서는 PBMC에서 재프로그래밍을 상세히 다루는 반면, 냉동 버피 코트에서 이 과정을 설명한 것은 단 한 편뿐입니다. 최근 경험에 따르면, 문헌과 제조사에서 제공하는 PBMC 재프로그래밍 프로토콜이 냉동 버피 코트 샘플에 적용되었을 때 성공하지 못하는 경우가 많아 여기서 설명한 적응과 문제 해결 전략이 필요하다는 것이 밝혀졌습니다. iPSC 기술을 사용하는 많은 연구자들에게 특히 환자 샘플에 소수의 세포만 포함되어 있거나 긴 시간 간격으로 채취되거나 제한된 참여자 풀에서 나오거나 기타 매우 가치 있는 경우에는 성공률이 높은 철저한 프로토콜이 필수적입니다. 여기서는 인간 냉동 버피 코트나 정제된 PBMC 재프로그래밍 가능성을 높이기 위한 체크포인트와 문제 해결 전략이 확인됩니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 연구자들이 재프로그래밍 성공 예측 요인을 파악하고 iPSC 유도 성공 가능성을 높이기 위한 대체 전략을 수립할 수 있게 할 것입니다.

서론

인간 다능성 줄기세포(hPSC) 기술은 신체 내 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 쉽게 확장되고 재생 가능한 인간 세포 공급원으로, 연구자들이 환자에게 접근하기 어렵거나 접근하기 어려운 세포 및 조직 유형을 조사할 수 있게 합니다. 또한, 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)는 환자의 체세포로부터 직접 유래할 수 있습니다^. 이를 통해 환자별 관심 세포 유형을 구분할 수 있게 되어, 질병 모델링과 신약 개발에 매우 귀중한 도구입니다. 따라서 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 엄격하고 재현 가능하며 성공적인 방법이 매우 중요합니다.

섬유아세포, 소변 세포,^{혈액 세포 2,3}은 각각 한계가 있지만, iPSC 유도에 가장 자주 사용되는 체세포 원료 중 하나입니다. 섬유아세포는 역사적으로^{재프로그래밍에} 가장 인기 있는 선택이었으나, 쉽게 구할 수 없어 다소 침습적인 피부 생검이 필요합니다. 재프로그래밍 가능한 세포는 소변 샘플에서 유래할 수 있으며, 이는 쉽게 얻고 비침습적이지만, 재프로그래밍 과정은^{수집 4}번 후 최대 48시간까지 신선한 샘플로 시작해야 합니다. 혈액은 최소 침습적이고 쉽게 구할 수 있기 때문에 재프로그래밍 가능한 세포의 훌륭한 공급원입니다. 말초혈 단핵세포(PBMC), 림프구를 포함한 단일 핵을 가진 혈액 세포, 단핵구, 자연 살^{해 세포 등}에서 다양한 재프로그래밍 프로토콜이 제공됩니다. PBMC는 다른 혈액 세포보다 밀도가 낮기 때문에, 밀도 구배 원심분리⁵를 통해 갓 분리된 전혈 샘플에서 분리/정제할 수 있습니다. 또는 원심분리 시 전혈은 혈장, 부피 코트, 적^{혈구 세} 개의 뚜렷한 층으로 분리됩니다. 버피 털에는 PBMC, 혈소판, 일부 적혈구가 포함되어 있습니다. 하지만 PBMC 는 대부분의 바이오뱅크에서 구하기 쉽지 않은 반면, 전혈 또는 부피 코트는 풍부하고 쉽게 구할 수 있습니다⁷. 바이오뱅크에 버피 코트가 존재하고 이 샘플들에 재프로그래밍 가능한 PBMC가 존재함에도 불구하고, 냉동 버피 코트⁸에서 재프로그래밍하는 프로토콜은 매우 적어 이 자원은 아직 활용되지 않은 상태로 남아 있습니다.

현재 재프로그래밍을 간소화하기 위해 많은 프로토콜^{1, 8, 9}와 상업적으로 이용 가능한 키트¹⁰이 많이 출판되어 있습니다; 하지만 재프로그래밍이 어려운 환자 기증자 세포의 성공 극대화 방법에 대해 깊이 있게 문제 해결하지는 않습니다. 일부 세포는 재프로그래밍되지 않는다는 것이 일반적으로 받아들여지며, 이럴 경우 많은 연구자들이 다른 기증자 세포 유형이나 다른 환자로 시도하기도 합니다. 하지만 이는 많은 연구자나 환자 집단에게는 실현 가능한 선택이 아닐 수 있습니다. 이전에 발표된 프로토콜 ^8,9와 달리, 이 프로토콜은 재프로그래밍 성공을 예측할 수 있는 체크포인트와 기준이 포함된 가이드를 포함하며, 해동 시 밀도 구배 원심분리를 통해 냉동 버피 코트를 정제하는 독특한 접근법을 취합니다.

과정은 선정된 개체로부터 혈액을 채취하고 PBMC 또는 버피 코트를 분리하는 것으로 시작됩니다. 새로운 실험의 경우, 이는 IRB 승인과 적절한 동의서 하에 신선한 혈액 채취를 받을 새로운 기증자를 모집하는 것을 포함할 가능성이 큽니다. 다음 단계는 체세포 확장으로, 냉동 혈액 세포를 해동하여 조혈 줄기세포와 적혈구 전구세포의 증식을 촉진하는 조건에서 배양하는 과정입니다. 이 혈구들은^{재프로그래밍에} 가장 적합한 후보입니다. 10일에서 14일 후, 세포는 이전 프로토콜에서 논의되지 않은 독특한 형태학으로 증명된 대로 재프로그래밍 준비가 되며, 이후 야마나카 인자를 보유한 센다이 바이러스로 접시되어 Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4¹을 전달합니다. 전도 후 세포는 야마나카 전사 인자를 발현시키기 시작하고, 다능성 상태로 돌아오며, 이는 뚜렷한 형태학적 변화와 줄기세포 집단으로의 증식으로 나타납니다. 신생 군체들은 개별적으로 채취, 확장, 냉동 보존됩니다. 10개의 구간 후, 세 개의 생식층에 대한 줄기 마커와 분화 가능성을 발현하는 확인을 통해 성공적으로 재프로그래밍된 iPSC 계통이 검증되었습니다.

이 프로토콜은 < 1개월 동안 보관된 냉동 보존 버피 코트나, 해동 시 최소 100만 개의 생존 가능한 세포를 가진 최대 2년간 보관된 냉동 보존 PBMC에 가장 적합합니다. 하지만 설명된 체크포인트는 양질의 혈액 샘플에서 재프로그래밍을 문제 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 재프로그래밍된 iPSC를 피더가 없는 조건에 적응시키는 방법에 관한 세부 사항은 시작 체세포 유형과 관계없이 모든 iPSC 재프로그래밍 워크플로우에 적용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 직접 문제 해결을 통해 확립되었으며, 얼어붙은 버피 코트에서 iPSC를 재프로그래밍하고 재프로그래밍 성공의 형태학적 지표를 식별하여 어려운 샘플을 재프로그래밍하는 실용적인 지침을 제공합니다. 궁극적으로 이러한 전략을 실행하면 시간, 비용, 시약, 샘플 절약이 이루어집니다.

프로토콜

이 프로토콜은 조지아 대학교 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 인간 대상 연구는 세계의학협회(World Medical Association)의 헬싱키 선언 지침에 따라 수행되었습니다. 자기진술에 근거한 자원자들은 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 결핵, 천식, 당뇨병 또는 급성 기도 감염 등 다음 질환을 앓지 않았습니다. 18세에서 50세 사이의 남녀 자원봉사자들이 모집되었습니다. 임산부는 연구에서 제외되었습니다.

1. 버피 코트 또는 PBMC 추출 및 냉동 보존

결정 기준: 샘플이 오랜 기간 보관될 경우 옵션 2를 선택하는 것이 가장 좋습니다. PBMC 정제용 시약이 구할 수 없거나 샘플이 짧은 기간 보관될 경우 옵션 1이 적합합니다.

1. 옵션 1: 버피 코트 추출
   1. WHO 모범 사례¹² 에 따라 정맥 천혈(정맥 천공)을 시행하고, 항응고제 코팅 혈액 채취관에 7–10 mL 전혈을 투여하세요. 샘플을 얼려 보관하세요.
   2. 15mL 원뿔 튜브에 전혈 7–10 mL를 옮깁니다. 브레이크를 끄고 200 x g 4°C에서 15분간 회전하는 양동이 원심분리기를 사용해 혈액을 돌립니다. 이 층은 3겹으로 이루어지며, 위쪽에는 노란색 혈장, 가운데에는 흰색 버피 코트층, 아래에는 붉은 적혈구가 있습니다.
   3. 버피 코트 층을 손상시키지 않고 멸균 혈청 피펫을 사용해 혈장을 채취하세요. 플라즈마를 버려. 흰색 버피 코팅층을 신선한 15mL 원뿔 튜브(약 1–2 mL)로 옮깁니다.
      주의: 혈장은 적절한 생물학적 위험 폐기통에 버리세요.
      참고: 버피 코트에 약간의 혈장 오염이 있어도 해동 후 회복에 도움이 되므로 괜찮습니다.
   4. DMSO를 버피 코팅에 첨가하여 최종 조성이 10% DMSO v/v가 되도록 하고, 즉시 -80 °C에서 크라이오비얼(1mL/바이알)에 냉동합니다. 다음 날에는 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관하세요.
      참고: 예를 들어, 버피 코트 2ml에 DMSO 200 μl을 넣고 잘 섞은 후 2개의 바이알로 나누어 나눕니다. 이로 인해 샘플당 1–3개의 냉동 바이알이 생성됩니다.
2. 옵션 2: PBMC 정화
   1. WHO 모범 사례¹² 에 따라 정맥 천혈(정맥 천공)을 시행하고, 항응고제 코팅된 혈액 채취관에 7–10 mL 전혈을 투여하세요. 샘플을 얼려 보관하세요.
   2. 4 mL 밀도 구배 용액 1을 신선한 15 mL 원뿔 튜브에 추가하세요. 밀도 구배 용액 1 위에 조심스럽게 4mL의 혈액을 층층이 올립니다.
   3. 원심분리기는 400 x g 압력으로 30분 동안 회전하는 버킷 원심분리기를 사용하며 브레이크를 끄는 과정입니다. 이로 인해 상층에는 혈장, 중간에는 PBMC가 있으며, 나머지 혈액은 아래층에 남게 됩니다.
   4. PBMC 분획을 신선한 15mL 원뿔 튜브에 모은 후, 브레이크를 걸고 350 x g 압력의 회전 버킷 원심분리기에서 5분간 원심분리하여 1x PBS로 2–3번 세척합니다. 상원액은 버리세요. 냉동 보존을 건너뛰고 즉시 재프로그래밍을 시작하려면 2.3.4 단계로 진행하세요.
      주의: 상청액은 적절한 생물학적 위험 폐기물통에 버리세요.
   5. 즉시 펠릿을 냉동 보존 배지(90% 혈청, 10% DMSO)에 재현탁하고, -80 °C에서 크라이오비얼(1 mL/바이알)에 즉시 냉동합니다. 다음 날에는 바이알을 액체 질소로 옮겨 장기 보관하세요.
      참고: 신선한 혈액에서 PBMC 정제를 위해 밀도 구배 원심분리 대신 PBMC 분리 혈액 수집관을 사용할 수 있습니다. 또한 시중에서 구할 수 있는 대체 냉동 매체를 이용해 냉동 보존이 가능합니다. 일반적인 수확량은 샘플당 1–4개의 냉동 바이알입니다.

2. 체세포 증식을 위한 샘플 준비

1. 미디어 준비
   1. 45mL의 EM 염기를 분리하여 팽창 배지(EM)⁹ 를 준비합니다. 127.8 μL L-아스코르브산(100 mM 스톡에서 50 μg/mL)과 450 μL 페니실린-스트렙토마이신(100배 스톡)을 추가합니다.
   2. EM + 사이토카인¹³ 에서 4 ml EM을 준비하고, 2 μL 줄기세포 인자(SCF)(100 μg/ml 스톡에서 50 ng/mL), 2 μL 인터루킨-3(IL-3)(20 μg/mL 스톡에서 10 ng/mL), 16 μL 에리스로포이에틴(EPO)(500 U/mL 스톡에서 2 U/mL), 4 μL 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF1)(40 ng/mL, 40 μg/ml 스톡), 그리고 4 μL 덱사메타손(1 μM 재고에서 1 μM)을 투여했습니다. EM + 사이토카인은 준비된 당일에 사용하세요.
      참고: 대체 상업용 팽창 매체 시스템도 사용할 수 있습니다.
2. 옵션 1: 프로즌 버피 코트에서 PBMC 정화
   결정 기준: 1단계의 옵션 1(즉, 버피 코트 추출)을 선택했다면, 2단계의 옵션 1(즉, 냉동 버피 코트에서 PBMC 정화)를 선택하세요.
   1. 밀도 구배 솔루션 2를 회수하여 실온으로 가게 합니다. 병을 뒤집어 충분히 섞으세요. 3 mL 밀도 구배 용액 2를 15 mL 원뿔 튜브에 무균적으로 옮깁니다.
   2. 12mL Dulbecco's 인산염염수(DPBS)가 포함된 15mL 원뿔형 튜브를 추가로 준비합니다.
   3. 액체 질소에서 얼린 버피 코트 바이알을 꺼내세요. 녹을 때까지 얼음 보관하세요. 샘플을 37°C 수조에서 부드럽게 해동하세요. 작은 얼음 결정만 남으면 제거하세요.
   4. 바이알 내용물을 조심스럽게(드롭 방향으로) DPBS가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 1mL DPBS로 바이알을 헹구고, 채취한 세포가 담긴 원뿔형 튜브에 넣으세요.
   5. 원심분리기를 사용해 200 x g 의 압력으로 RT에서 10분간 원심분리기. 상정액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 4 mL DPBS에 1% 태아 소 혈청(FBS)과 함께 재현탁합니다.
   6. 버피 코트 혼합물을 밀도 구배 용액 위에 부드럽게 층층이 쌓으면서, 섞이지 않도록 주의하세요. 원심분리기를 800 x g 에서 20분 동안 RT에서 브레이크를 끄고 사용했습니다.
   7. 피펫을 사용해 플라즈마: 그라디언트 계면을 방해하지 않고 상부 플라즈마 층을 제거하고 버립니다. 피펫을 사용해 인터페이스의 PBMC 층을 제거하고(그림 1A), 깨끗한 15mL 튜브로 옮깁니다.
      주의: 나머지 층은 적절한 생물학적 위험 폐기통에 버리세요.
   8. PBMC를 3 mL EM으로 세척하여 200 x g 에서 10분간 RT에서 원심분리합니다. 상원액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 2 mL EM + 사이토카인 혼합물에 재현탁합니다. 12웰 플레이트 중 1웰에 플레이트를 넣으세요.
   9. 플레이트를 인큐베이터에 37°C,_CO2 5%, 산소 20%에 넣으_세요.
3. 옵션 2: 냉동 PBMC 해동
   결정 기준: 1단계의 옵션 2(즉, PBMC 정제)를 선택했거나, 냉동 버피 코트가 생존율이 낮을까 우려된다면(즉, 1개월 이상 보관됨) (그림 1B), 2단계의 옵션 2(즉, 냉동 PBMC 해동)를 선택하세요.
   1. 15 mL 원뿔 튜브에 12 mL DPBS를 준비하세요.
   2. 액체 질소에서 냉동 PBMC 바이알을 회수하세요. 녹을 때까지 얼음 보관하세요. 37°C 수조에서 소용돌이치며 샘플을 부드럽게 녹입니다. 작은 결정만 남으면 제거하세요.
   3. 조심스럽게(떨어뜨리는 방향으로) 바이알 내용물을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 바이알 내 모든 세포는 1mL DPBS로 세척하여 반드시 채취하세요.
   4. 원심분리기를 200 x g 에서 10분 동안 RT로 돌립니다. 상원액을 조심스럽게 제거하고 펠릿(그림 1C)을 2 mL EM에 재현탁한 후, 10 μL을 사용해 트리판 블루 배제 검사를 실시하여 세포 수¹⁴를 얻습니다.
      주의: 상청액은 적절한 생물학적 위험 폐기물통에 버리세요.
   5. 1.0 x 10^6–2.0 x 10^{6 세포/}mL를 2 mL EM + 사이토카인 12웰 플레이트의 한 웰에 플레이트 배지합니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C,_CO2 5%, 산소 20%에 넣으_세요.

3. 체세포 확장(해동 후 1일)

1. 각 웰에서 사용한 배지 1mL를 조심스럽게 제거하세요. 사용된 배지는 다른 우물이나 원심분리관에 수집하여 세포가 손실되지 않았는지 확인할 수 있습니다.
2. 사용한 배지를 신선한 EM + 사이토카인 1mL로 대체합니다.
3. 3.1단계와 3.2단계를 반복하며 이틀에 한 번씩 PBMC를 사진으로 찍으며, 형태에 큰 크기와 작은 크기의 밝고 둥근 세포(각각 주황색과 파란색 화살표)가 관찰되며(그림 2A, 주황색과 파란색 화살표), 이것이 재프로그래밍 세포 유형인 적혈세포입니다. 이 과정은 약 10일에서 14일 정도 걸립니다.
   참고: 이러한 형태를 보이지 않는 세포는 보통 더 큰 둥근 세포가 없으며(그림 2B), 재프로그래밍에 성공할 가능성이 낮고 죽었을 수도 있습니다(그림 2C).

4. 전도(해동 후 10–14일)

1. 센다이 바이러스 준비
   1. 로트 특이적 역가 값을 사용하여, 제조사 권장에 따라 KOS: c-Myc: Klf4를 사용하여 감염 배수율(MOI)을 5:5:3으로 하여 2.0 × 10⁵ 개의 세포 전이 이식에 필요한 각 바이러스의 부피를 계산합니다. 이 계산 공식은 제조사가 제공한 제품 문서에서 확인할 수 있습니다.
   2. 냉동고에서 바이러스를 꺼내 얼음에 보관해 녹일 때까지 보관하세요. 하나씩 37°C 물에서 소용돌이치며 바이러스를 부드럽게 녹여 나가세요.
   3. 세 바이러스를 적절한 부피로 혼합하여 2.0 ×^{10 5} 세포에 5:5:3 MOI로 전도하는 알리쿼트를 준비합니다. -80 °C에서 얼리며 사용 준비가 될 때까지 보관하세요.
      주의: 센다이 바이러스에 접촉한 모든 폐기물은 철저히 표백하세요.
      참고: 제조사 지침에는 실제 세포 수를 권장하며, 추가된 바이러스의 부피를 결정하기 위해 MOI 계산을 해야 하지만, 이 프로토콜에서는 2.0 × 10⁵ 의 근사치가 성공했습니다. 알리쿼트는 비용 효율적일 수 있고 바이러스의 냉동 및 해동 주기를 줄일 수 있습니다.
2. 전송의 날 (d0)
   1. 전날 PBMC를 먹이지 않았다면, 사용한 배지 1mL를 제거하고 신선한 EM + 사이토카인 1mL로 교체합니다. 바이러스를 얼음 위에 해동한 뒤, 바로 우물에 넣고 매체를 휘저어 넣으세요.
   2. 플레이트를 파라필름으로 감싸고, 350 x g 압력의 회전 버킷 원심분리기에서 RT로 90분간 원심분리합니다. 플레이트를 인큐베이터 37°C,_CO2 5%, 산소 20%를 하룻_{밤 동안 넣} 습니다.
      주의: 센다이 바이러스에 접촉한 모든 폐기물은 철저히 표백하세요.
3. 전도(transduction) 후 1일 (d1)
   1. 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모으세요. 2mL 전자기압으로 잘 헹군 후 현미경으로 모든 세포가 채취되었는지 확인하세요. 원심분리기 셀을 300 x g 에서 RT 10분간 사용하세요.
   2. 상청액을 조심스럽게 제거하고 2 mL EM + 사이토카인에 재현탁합니다. 12웰 플레이트의 신선한 웰에 넣고, 37°C, 5%_CO2, 20%_O2에서 플레이트를 인큐베이터로 돌려보냅니다.
      주의: 센다이 바이러스에 접촉한 모든 폐기물은 철저히 표백하세요.

5. 형질전환된 세포를 피더 세포에 재판

1. 피더 셀 준비
   1. 43.5 mL에 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM)를 5 mL FBS(최종 농도 10%), 0.5 mL 최소 필수 배지 비필수 아미노산 용액(MEM-NEAA)(100x 재고에서), 50 μL 2-머캅토에탄올(55 μM 재고에서 55 μM), 그리고 0.5 mL 항생제-항진균제(100x 재고에서 추출)를 첨가합니다.
   2. 젤라틴 코팅 6웰 플레이트를 준비하는데, 600 μL 젤라틴(2% 스톡의 0.1%)을 12 mL DPBS에 첨가하고 웰당 2mL를 분포합니다. 실온에서 20분간 부화하세요.
   3. 방사선 처리된 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 냉동 바이알을 회수하여 37°C 물욕에서 부드럽게 해동합니다.
   4. 10 mL DPBS가 들어 있는 15 mL 원뿔 튜브에 점진적으로 추가하고, 추가로 1 mL DPBS를 넣은 채 세척 바이알을 사용합니다. 원심분리기를 200 x g 에서 RT로 5분간 가열하세요.
   5. 상정액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 1mL 섬유아세포 배지에 재현탁합니다. 세포 생존성을 확인하기 위해 10 μL을 제거하여 트리판 블루 배제 검사를 수행하여 세포 수를 얻^습니다.
   6. 6웰 플레이트에서 젤라틴 용액을 제거하고 2.5 × 10⁴ 셀/^cm²에 방사선 처리된 MEF를 플레이트합니다. 인큐베이터에서 37°C,_CO2 5%, 산소 20%를 6–48_{시간 배양} 합니다.
      참고: 피더 세포 플레이트는 형전환 세포의 재도금 전에 반드시 준비되어야 합니다. 방사선 처리된 MEF를 재판 전 약 2일간 배양했을 때 가장 좋은 결과가 나타났으며, 최소 6시간 배양으로도 충분할 수 있습니다.
2. 형질전환 세포 재판
   1. iPSC 배지 90 mL DMEM/F12에 10 mL FBS(최종 농도 10%), 1 mL MEM-NEAA(100x 스톡에서), 1 mL L-글루타민(200 mM 스톡에서 2 mM), 1 mL 페니실린-스트렙토마이신(100x 스톡에서), 100 μL 2-머캅토에탄올(55 μM 스톡에서 55 μM), 100 μL 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)(10 μg/mL 스톡에서 10 ng/mL)를 준비합니다. 각 급식 시 신선한 L-아스코르브산(50 μg/mL)을 추가하세요.
   2. 전면 후 3일째에는 전면 웰에서 모든 배지와 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 모으세요. 최소 1mL 이상의 전자기와 원심분리기를 300 x g 압력으로 RT로 10분간 세척하세요.
   3. 펠릿을 6mL iPSC 배지에 재현탁합니다. 판의 3개 웰에서 방사선 MEF를 흡입하세요.
   4. 이 3개의 방사선 MEF(2ml/웰) 웰에 세포를 이식했습니다. 인큐베이터 내에서 37°C,_CO2 5%, 산소 20%에서 배큐_하세요.

6. 군체 출현까지의 유지

1. 전도후 4, 5, 6일째에는 매일 각 웰에 1mL의 신선한 iPSC 배지를 추가합니다. 이렇게 하면 새로 재프로그래밍된 세포가 먹이통에 정착할 때 불필요한 교란을 줄이고, 신선한 영양분도 공급할 수 있습니다.
2. 전도후 7일째에는 모든 기존 배지를 제거하고 웰당 2mL의 신선한 iPSC 배지를 교체합니다. 집단이 나타나기 시작할 때까지 이틀에 한 번씩 iPSC 매개체를 계속 먹이세요.
3. hES 배지 78 mL DMEM/F12에 20 mL FBS 자유 보충제(20%), 1 mL MEM-NEAA(100x), 1 mL L-글루타민(200 mM 스톡에서 2 mM), 1 mL 페니실린-스트렙토마이신(100x), 100 μL 2-머캅토에탄올(55 mM 스톡에서 55 μM), 100 μL FGF2(10 μg/ml 스톡에서 10 ng/mL)를 준비합니다. 각 급식 시 신선한 L-아스코르브산(50 μg/mL)을 추가하세요.
4. 작은 집락이 나타나기 시작하면, 이틀에 한 번씩 hES 배지를 공급하여 형질전환된 세포를 계속 유지합니다(그림 3A).
   참고: 군집은 변환 후 7일째부터 나타나기 시작합니다. 만약 전도(transduction) 후 3주가 지나도 집단이 나타나지 않았다면, 집단이 다시 나올 가능성은 낮습니다.

7. 군집이 더 커지면 집단을 수확한다 (그림 3B)

참고: 때때로 형질전환된 세포는 줄기세포와 같은 콜로니를 형성하지 않는 형태학적 변화를 겪기도 합니다(그림 3C). 이 군집은 성공적인 iPSC 계통으로 이어질 수 있는 군집으로 간주되지 않습니다.

참고: 군집 출현 시점부터 iPSC 라인은 실험실에서 선호하는 hPSC 배양 조건에 맞게 조정되어야 합니다. 이 프로토콜은 iPSC 라인이 피더가 없는 조건에 어떻게 적응되었는지, 비트로넥틴(VTN) 코팅된 플레이트에서 배양되고, 화학적으로 정의되고 상업적으로 이용 가능한 hPSC 배지를 공급하는 과정을 보여줍니다. 만약 군체가 새로운 환경에 잘 적응하지 못한다면, hES 매지가 있는 급이 세포에 올라가는 등 더 부드러운 전환이 필요할 수 있습니다.

1. VTN을 해동하고 충분히 혼합하여 VTN 코팅된 플레이트를 준비하세요. 24웰 플레이트의 경우, 120 μL VTN과 함께 12 mL의 DPBS를 준비하고(500 μg/mL 스톡에서 5 μg/mL) 0.5 mL VTN 용액을 분포합니다. 실온에서 1시간 정도 배양하세요.
2. hPSC 배지를 4°C에서 하룻밤 동안 해동하여 hPSC 배지를 준비하세요. 해동되면 500mL 기저 배지 한 병에 10 mL hPSC 보충제를 추가하세요.
3. 플레이트를 피킹할 준비를 위해 24웰 플레이트의 웰에서 VTN 용액을 제거하고, 각 웰에 0.5 μL Y-27632(10 μM 스톡에서 10 μM)를 포함한 0.5 mL hPSC 매체를 추가합니다.
4. 새 플레이트, 형질전환된 세포/콜로니가 들어 있는 6-웰, 멸균 주사기 바늘, 그리고 p200 피펫과 팁을 멸균 상태에서 해부 현미경으로 가져가세요.
5. 형질전환된 세포와 출현된 군락이 담긴 플레이트를 해부 현미경에 올려놓고, 현미경으로 한 군락을 찾아 채취합니다. 플레이트 뚜껑을 들어 우물을 노출시킵니다.
6. 무균 상태로 주사기를 열고 바늘을 노출하세요. 현미경의 안내를 받아 바늘 끝으로 집락의 윤곽을 따라 주변 먹이 세포에서 집단을 분리합니다.
7. 바늘 끝으로 군집을 몇 개의 같은 크기의 조각으로 잘라내세요. 군락 조각이 아직 접시에서 떨어지지 않았다면, 바늘 옆면을 이용해 접시에서 떠서 떠 있도록 퍼내거나 긁어내세요.
   주의: 바늘은 적절한 날카로운 용기에 버려야 합니다.
8. p200을 사용해 현미경으로 선택한 군집을 재배치하세요. 피펫으로 부유 콜로니를 흡입한 후 준비된 24웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 다른 군락이나 피더 셀을 넣지 않고 전체 군체를 우물에 넣으려고 노력하세요.
9. 플레이트를 인큐베이터에 37°C,_CO2 5%, 산소 20%에 넣으_세요.
10. 수확한 군락에 매일 1mL의 hPSC 배지를 먹여 합류할 때까지 먹입니다.
    참고: 식민지는 서로 유전적으로 구별될 가능성이 있습니다. 24웰 플레이트의 각 웰에는 선택된 콜로니가 하나만 있어야 합니다. 각 선택된 집단은 고유한 식별자를 부여받으며, 이제부터는 다른 집단과 다른 세포주로 취급됩니다. 엄격한 재프로그래밍 라운드를 원한다면, 최소 24개의 식민지를 선택하고 최소 3개를 확장하고 특성화하세요.

8. 확장

1. hPSC 유지 관리
   1. 따낸 군체는 크고 둥글며 빛나는 가장자리가 되면 쪼갤 준비가 됩니다(그림 4A). 집단은 따면 여러 조각으로 나뉩니다. 한 우물에 여러 군락이 있다면, 서로 접촉할 만큼 커지기 전에 분리하세요.
   2. VTN 코팅 6웰 플레이트 준비: 6웰 플레이트의 경우, 120 μL VTN (500 μg/mL 스톡에서 5 μg/mL)와 함께 12 mL의 DPBS 샘플을 준비하고, 웰당 1mL VTN 용액을 분포합니다. 실온에서 1시간 배양합니다. VTN 용액은 DPBS로 대체하여 37°C, 5%_CO2 에서 한 달간 보관할 수 있습니다. 분할될 우물에서는 DPBS를 흡입하고 1 mL hPSC 배지로 교체합니다.
   3. 웰에서 배지를 흡입해 분리한 후 1mL DPBS로 한 번 세척합니다. DPBS를 흡인하고 500 μL 0.5 mM EDTA 해리 완충제(500 mL DPBS에 0.9 g NaCl 조제 및 여과기 멸균)를 추가합니다¹⁵. 37°C, 5%_CO2 에서 2분간 배양하며, 군집이 느슨해지고 각 군체 내 세포들이 서로 떨어져 나가기 시작할 때까지 기다립니다.
   4. 인큐베이터에서 플레이트를 분리하고 EDTA 해리 완충제를 흡인하세요. p1000 피펫을 사용해 1mL hPSC 배지로 세포를 부드럽게 위아래로 움직이며 콜로니가 완전히 분리되고 약간 부서질 때까지 채취합니다. 1mL의 배지와 세포를 1mL의 신선한 hPSC 배지를 포함한 새로운 6-웰에 옮깁니다. 이 첫 번째 분할은 1:1 분할 비율로 이루어지며, 원래 판의 모든 셀이 새 판으로 옮겨집니다.
   5. 세포를 인큐베이터에 37°C,_CO2 5%, 산소 20%에_{넣습니다.} 우물이 합류하여 분할 준비가 될 때까지 매일 iPSC를 공급하세요.
      참고: 줄기세포 형태가 나쁜 경우(그림 4B), 분할 프로토콜을 조정하는 등 조기 분할, EDTA 적립 시간 단축, 분할 비율 조정 등으로 완화할 수 있습니다.
   6. 10cm 접시로 확장하세요.
      1. 세포가 6웰 플레이트의 각 웰에 합류하면, 10cm 접시에 VTN(7 mL DPBS와 70 μL VTN(500 μg/mL 스톡에서 5 μg/mL)을 코팅하고, RT에서 1시간 배양합니다.
      2. 이번에는 6-웰에서 10cm 조직 배양 접시로 확장하여 분할 프로토콜을 반복합니다(분할 비율 1:1). 10cm 접시당 7–10mL의 hPSC 배지를 사용하세요.
      3. 10cm 접시 내 세포들이 합류하면 이 분할 과정을 반복합니다(통과). 각 지문마다 지문 번호를 기록하세요. 분할 비율은 세포 형태와 밀도에 따라 달라집니다. 일반적인 비율은 1:10으로, 원래 판의 셀의 10분의 1이 새 판으로 옮겨집니다.
2. 프리즈백 및 스톡 조리
   1. 약 3회 통로 후 초기 통과 스톡을 위해 10cm 조직 배양 접시 4개로 확장하세요. 10cm 접시의 세포들이 합류하면 냉동 준비가 됩니다.
   2. 냉동병을 준비해서 냉동실에 넣어 식히세요. 라벨에 세포주, 클론, 통과 번호, 동결 날짜가 반드시 포함되어야 합니다.
   3. 냉동 배지를 준비하세요: 90% hPSC 배지와 10% DMSO, 바이알당 1mL(10cm 접시당 냉동 바이알 3개)가 필요합니다.
   4. 평소처럼 10cm 접시당 4mL 0.5 mM EDTA 해리 완충제를 사용하여 분할 프로토콜을 수행합니다.
   5. EDTA 인큐베이트 후에는 EDTA를 흡인하세요. 접시에 10mL의 hPSC 매개체를 부드럽게 넣으세요.
   6. 배지를 피펫으로 부드럽게 접시에서 씻어내세요. 세포들은 접시 바닥에서 쉽게 떨어져 배지에 섞일 수 있습니다. 피펫은 2–5회만 사용해 군락을 부드럽게 분해하되 단일 세포로 분리되는 것을 방지합니다.
   7. RT 200 x g 에서 5분간 원심분리. 상원액을 흡입하고 세포 펠릿을 냉동 배지에 재현탁합니다.
   8. 단열재를 하고 즉시 -80°C에서 냉동하세요. 냉동 바이알을 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관하세요.
   9. 특성화가 완료된 후에는 같은 방식으로 더 많은 재고를 동결하세요.

9. iPSC의 특성 분석:

1. 어간 마커의 표현. 최소 10개의 통로 확장 후, 24개의 웰 내 군락이 분할 준비가 되면 4% 파라포름알데히드로 고정하고 면역조직화학으로 염색하여 줄기 마커 NANOG를 사용합니다. 콜로니가 센다이 바이러스(SeV) 음성이 되려면 최소 10번의 통과가 필요하며, 이는 면역형광(그림 4C)으로 확인할 수 있습니다.
2. 다능성 능력 테스트: 세 가지 생식층 분화. iPSC 다능성은 세 가지 생식층 각각으로 성공적으로 분화됨을 통해 확인됩니다. 각 분화는 우수한 hPSC 형태를 보이는 합류 10cm 접시에서 시작됩니다(그림 4A).
   1. 엑토덤¹⁶
      1. 분화 시작 전날(1일차): 2.6 × 10⁵ cells/^{cm 2} 의 밀도로 hPSC 배지에 Y-27632(최종 10 μM 농도)와 XAV-939(2 μM 최종 농도)를 사용하여 매트릭스 코팅된 24웰 플레이트에 종자 iPSC를 시상합니다.
      2. 0일차–1일차: LDN(최종 농도 100 nM), SB(최종 농도 10 μM), XAV(최종 농도2 μM)를 포함한 1 mL/웰 분화 염기를 공급합니다.
      3. 2일차부터 7일차까지: LDN(최종 농도 100 nM)과 SB(최종 농도 10 μM)를 포함한 1 mL/웰 분화 염기를 공급합니다. d3에서는 격일로 먹이세요.
      4. 8일차: 4% 파라포름알데히드와 면역조직화학으로 외배엽 마커 PAX6¹⁷ 을 염색하여 다능성 마커 NANOG 손실을 확인했습니다(그림 4D).
   2. 중배엽¹⁸:
      1. 분화가 시작되기 전날(1일차): 2.5 ×^{10 5} cells/^{cm 2} 의 밀도로 hPSC 배지에 Y-27632(최종 농도 10 μM)를 사용하여 매트릭스 코팅된 24웰 플레이트에 종자 iPSC를 부착합니다.
      2. 0일차: DMEM/F12에 L-아스코르브산(최종 농도 64 μg/mL), 셀레나이트나트륨(최종 농도 13.6 ng/mL), 홀로트랜스페린(최종 농도 10 μg/mL), 화학적으로 정의된 지질 농축액(100x), CHIR(최종 농도 5 μM)을 투여합니다.
      3. 1일차: DMEM/F12와 L-아스코르브산(최종 농도 64 μg/mL), 셀레나이트 나트륨(최종 농도 13.6 ng/mL), 홀로트랜스페린(최종 농도 10 μg/mL), 화학적으로 정의된 지질 농축액(100x), 헤파린(최종 농도 0.6 U/mL)을 투여합니다.
      4. 2일차: 4% 파라포름알데히드로 고정하고 면역조직화학으로 염색하여 BRACHYURY-T¹⁹ 를 확인하고, 다능성 지표 NANOG 손실을 확인했습니다(그림 4E).
   3. 내배엽²⁰
      1. 분화 시작 전날(1일차): hPSC 배지에 1.0 ×^{10 5} cells/^{cm 2} 밀도로 매트릭스 코팅된 24웰 플레이트에 Y-27632(최종 농도 10 μM)와 함께 씨앗을 부착합니다.
      2. 0일차부터 4일째: d0 시절에는 DPBS로 세척하고 RPMI로 L-글루타민 대체물(100x), FBS(최종 농도 0.5%), 액티빈 A(최종 농도 100 ng/mL)를 사용해 먹입니다. d0에서 매일 같은 매체로 먹이세요.
      3. 5일차: 4% 파라포름알데히드로 고정하고 면역조직화학으로 염색하여 내배엽 표지 SOX17²¹ 을 확인하고, 다능성 표지 NANOG 손실을 확인했습니다(그림 4F).
         참고: 구분은 이전에 발표된 프로토콜에 따라 이루어졌습니다. 저희 경험상 매트릭스 코팅은 서로 교환 가능할 수 있습니다.

결과

이 프로토콜의 성공 여부는 여러 단계에서 추적할 수 있습니다. 표 1은 이 프로토콜이 수행된 샘플들의 요약을 제공합니다. 시작 샘플은 1주일간 보관된 냉동 보존된 버피 코트나 해동 시 샘플 품질이 우수하고 세포 확장 후 6/7회 성공적으로 재프로그래밍된 형태학적 특징을 가진 냉동 보존 PBMC입니다(표 1, 카테고리 1). 비슷한 조건에서 채취 및 보관된 두 개의 버피 코트 샘플은 유사한 품질과 형태를 보였으나, 재프로그래밍이 아닌 다른 분석법 확립을 위해 채취되었다. 또는 오랜 기간 보관된 얼린 버피 코트(> 6년)부터 해동 후 품질과 상관없이 체세포 확장 후 재프로그래밍 가능한 형태를 보이지 않아 성공적으로 재프로그래밍되지 못합니다(표 1, 범주 2). 자원을 보존하기 위해, 확장 후 재프로그래밍 가능한 형태를 보이지 않는 샘플은 변환하지 않아야 합니다(표 1,...

토론

iPSC 기술은 질병 기전 발견, 맞춤형 의학, 그리고 "접시 내 임상시험"과 관련하여 생의학 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다^22,23. 혈액 샘플에서 iPSC 재프로그래밍을 위한 효율적이고 유연한 프로토콜은 iPSC 기술의 큰 잠재력을 발휘하는 핵심입니다. iPSC는 쉽게 채취할 수 있고 바이오뱅크에서 쉽게 구할 수 있기 때문입니다. 정제된 PBMC에서 재프로그래밍을 상세히 다룬 많은 프로토콜이 있지만, 이 프로토콜은 정제가 부족한 혈액 샘플(예: 냉동 버피 코트)에서 재프로그래밍을 상세히 하며, 재프로그래밍 시간 흐름의 체크포인트를 식별하여 성공 여부를 쉽게 평가하여 시간과 자원 낭비를 최소화합니다.

성공적인 재프로그래밍을 위한 첫 번째 중요한 단계는 고품질 시작 샘플을 확보하는 것입니다(

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 표준 조직 배양 접시	팔콘	353003
12개의 웰 플레이트	팔콘	353043
15 mL 원뿔관	피셔	7200886
24개의 웰 플레이트	코닝	7200740
4% 파라포름알데히드 용액	써모 사이언티픽	J19943-K2
6개의 웰 플레이트	피셔 사이언티브	FB012927
accuSpin1R	피셔 사이언티브	75003449
액티빈 A	바이오테크네	338-AC
AF488-donkey & alpha; 염소	인비트로젠	A11055
AF555-당키 & 알파; RBT	인비트로젠	A31572
AF647-당키와 알파; m	인비트로젠	A31571
AF647-당키와 알파; RBT	인비트로젠	A31573
항생제-항균제(100X)	피셔	15 240 096
바식스 폴리스티렌 혈청 피펫	피셔	14955233 14955234 14955235 14955236
BD 투버쿨린 주사기	피셔	14-826-87
BD 바큐테인 유리 단핵전지 준비(CPT) 튜브	피셔 사이언티브	02-685-125	PBMC가 혈액 수집관을 분리하는 방식
BD  K2EDTA를 사용하는 진공 플라스틱 혈액 채취관: 혈가드 폐쇄	피셔 사이언티브	02-657-32	항응고물질 코팅 혈액 수집관
B-머캅토에탄올	피셔	21 985 023
소 젤라틴	시그마	G1393
브라큐리-T 항체 다클론 염소 IgG	R& D	AF2085
셀드롭 BF	데노빅스	셀드롭 BF
원심분리기 5702	에펜도르프	EP022628102-1EA
화학적으로 정의된 지질 농축물	피셔	NC9022744
키르 99021	R& D	4423
CO2 인큐베이터	산요	MCO-20AIC
냉동 보존 저장 시스템	맞춤형 바이오제닉 시스템	V-1500AB
크라이오스타 CS10	줄기세포 기술	100-1061	대체 냉동 매체
CytoTune-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트	피셔	A16517
덱사메타손	시그마	D2915
DMEM	피셔	11965118
DMEM/F12	피셔	11330057
DMSO	피셔	BP231-1
DPBS 1X 없이, CA MG와 NBSP;	피셔	MT21031CM
EDTA	피셔	AM9262
적혈구생성(EPO)	바이오-테크네	287-TC-500
에센셜 6 미디엄 (E6)	피셔	A1516401	미분 기초
에센셜 8 미디엄 (E8)	피셔	A1517001	hPSC 기저 매체
EVOS FL 현미경	열학	AMF4300
태아 소 혈청	VWR	45000-734
FGF 기본 (FGF2)	바이오테크네	233-FB/CF
겔트렉스	피셔	A1413202	매트릭스 코팅
Gibco MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)	피셔	11140050
글루타맥스	피셔	35050061	L-글루타민 대체물
헤파린	줄기세포 기술	7980
히스토파크 1077	시그마	10771	밀도 구배 해법 1
홀로트랜스페린	시그마	T0665
인간 줄기세포 인자(SCF)	페프로텍	300-07-100UG
인슐린과 같은 성장인자 1(IGF1)	페프로텍	100-11-100UG
인터루킨-3(IL-3)	페프로텍	200-03-2UG
아이소템프 210 수욕	피셔 사이언티브	210
녹아웃 혈청 대체 요법(KSR)	피셔	10828028	FBS 무료 보충제
L-아스코르빈산	시그마	A4544-100G
LDN193189	스템젠트	04-0074
L-글루타민	피셔	25030081
림프홉렙	줄기세포 기술	7801	밀도 구배 해법 2
마트리젤	코닝	CB-40234	매트릭스 코팅
마우스 배아 섬유아세포	피셔	A34964
나노그 다클론 염소 IgG	R& D	AF1997-SP
Nunc 바이오뱅킹 및 세포 배양 냉동 튜브	피셔 사이언티브	12-565-163N
페니실린/스트렙토마이신	피셔	15140122
정제 항-팍스-6 항체 토끼 다클론 IgG	바이오레전드	901301
QBSF-60 무혈청 미디엄	퀄리티 바이오컬리컬	160-204-101	EM 베이스
회복 세포 배양 냉동 배지	써모피셔 사이언티브	12648010	대체 냉동 매체
rh비트론넥틴 (VTN)	피셔	A31804
RPMI 1640 미디엄	피셔	11875093
SB431542	R& D	1614
센다이 바이러스 HN 단일클론 항체 마우스 IgG2a	인비트로젠	14649482
셀레나이트 나트륨	시그마	S5261
Sox17 항체 다클론 염소 IgG	R& D	AF1924
StemSpan 적혈구 확장 보충제	줄기세포 기술	2692	대체 상업용 확장 미디엄 보충제
스템스판 SFEM II 매체	줄기세포 기술	9605	대체 상업용 확장 매체
초저온 냉동고	써모피셔 사이언티브	TSX60086A
유니버설 피펫 팁 - 필터링	VWR	76322-132< > 76322-134< > 76322-150< > 76322-156
XAV939	바이오테크네	3748/10
Y-27632 이하이드로클로라이드	바이오젬	1293823