방법 논문

냉동 버피 코트 샘플에서 유도된 다능성 줄기세포주 재프로그래밍

DOI:

10.3791/70522

⸱

2026년 4월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

이 논문에서

요약

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현재 프로토콜은 제조사 지침에 따라 재프로그래밍이 어려운 환자 샘플의 말초혈 단핵세포(PBMC)에서 유도 다능성 줄기세포(iPSC) 유도 문제를 해결하는 절차를 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 냉동 버피 코트 샘플에 특이적이지만 정제된 PBMC 재프로그래밍에도 적용될 수 있습니다.

초록

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인간 다능성 줄기세포(hPSCs)는 질병 모델링에 유용한 도구입니다. 추가로 성체 체세포에서 재프로그래밍된 줄기세포는 유도다능줄기세포(iPSC)라고 부릅니다. iPSC 기술은 특정 연구 참가자와 집단을 평가하고 맞춤형 의학 분야로 진출할 수 있게 합니다. 혈액은 연구 목적으로 정기적으로 채취되어 냉동 보존됩니다. 이 샘플들은 백혈구와 혈소판이 포함된 혈액 샘플인 버피 코트(buffy coat)나 호산구, 호염기구, 혈소판, 적혈구가 없는 보다 정제된 백혈구 집단인 말초혈 단핵 세포(PBMC)로 처리됩니다. 두 방법 모두 재프로그래밍 가능한 체세포를 쉽게 구할 수 있고 비교적 비침습적인 공급원입니다. 여러 보고서는 PBMC에서 재프로그래밍을 상세히 다루는 반면, 냉동 버피 코트에서 이 과정을 설명한 것은 단 한 편뿐입니다. 최근 경험에 따르면, 문헌과 제조사에서 제공하는 PBMC 재프로그래밍 프로토콜이 냉동 버피 코트 샘플에 적용되었을 때 성공하지 못하는 경우가 많아 여기서 설명한 적응과 문제 해결 전략이 필요하다는 것이 밝혀졌습니다. iPSC 기술을 사용하는 많은 연구자들에게 특히 환자 샘플에 소수의 세포만 포함되어 있거나 긴 시간 간격으로 채취되거나 제한된 참여자 풀에서 나오거나 기타 매우 가치 있는 경우에는 성공률이 높은 철저한 프로토콜이 필수적입니다. 여기서는 인간 냉동 버피 코트나 정제된 PBMC 재프로그래밍 가능성을 높이기 위한 체크포인트와 문제 해결 전략이 확인됩니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 연구자들이 재프로그래밍 성공 예측 요인을 파악하고 iPSC 유도 성공 가능성을 높이기 위한 대체 전략을 수립할 수 있게 할 것입니다.

서론

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인간 다능성 줄기세포(hPSC) 기술은 신체 내 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 쉽게 확장되고 재생 가능한 인간 세포 공급원으로, 연구자들이 환자에게 접근하기 어렵거나 접근하기 어려운 세포 및 조직 유형을 조사할 수 있게 합니다. 또한, 유도 다능성 줄기세포(iPSCs)는 환자의 체세포로부터 직접 유래할 수 있습니다. 이를 통해 환자별 관심 세포 유형을 구분할 수 있게 되어, 질병 모델링과 신약 개발에 매우 귀중한 도구입니다. 따라서 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 엄격하고 재현 가능하며 성공적인 방법이 매우 중요합니다.

섬유아세포, 소변 세포,혈액 세포 2,3은 각각 한계가 있지만, iPSC 유도에 가장 자주 사용되는 체세포 원료 중 하나입니다. 섬유아세포는 역사적으로재프로그래밍에 가장 인기 있는 선택이었으나, 쉽게 구할 수 없어 다소 침습적인 피부 생검이 필요합니다. 재프로그래밍 가능한 세포는 소변 샘플에서 유래할 수 있으며, 이는 쉽게 얻고 비침습적이지만, 재프로그래밍 과정은

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프로토콜

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이 프로토콜은 조지아 대학교 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 모든 인간 대상 연구는 세계의학협회(World Medical Association)의 헬싱키 선언 지침에 따라 수행되었습니다. 자기진술에 근거한 자원자들은 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환, 결핵, 천식, 당뇨병 또는 급성 기도 감염 등 다음 질환을 앓지 않았습니다. 18세에서 50세 사이의 남녀 자원봉사자들이 모집되었습니다. 임산부는 연구에서 제외되었습니다.

1. 버피 코트 또는 PBMC 추출 및 냉동 보존

결정 기준: 샘플이 오랜 기간 보관될 경우 옵션 2를 선택하는 것이 가장 좋습니다. PBMC 정제용 시약이 구할 수 없거나 샘플이 짧은 기간 보관될 경우 옵션 1이 적합합니다.

  1. 옵션 1: 버피 코트 추출
    1. WHO 모범 사례12 에 따라 정맥 천혈(정맥 천공)을 시행하고, 항응고제 코팅 혈액 채취관에 7–10 mL 전혈을 투여하세요. 샘플을 얼려 보관하세요.
    2. 15mL 원뿔 튜브에 전혈 7–10 mL를 옮깁니다. 브레이크를 끄고 ....

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결과

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이 프로토콜의 성공 여부는 여러 단계에서 추적할 수 있습니다. 표 1은 이 프로토콜이 수행된 샘플들의 요약을 제공합니다. 시작 샘플은 1주일간 보관된 냉동 보존된 버피 코트나 해동 시 샘플 품질이 우수하고 세포 확장 후 6/7회 성공적으로 재프로그래밍된 형태학적 특징을 가진 냉동 보존 PBMC입니다(표 1, 카테고리 1). 비슷한 조건에서 채취 및 보관된 두 개의 버피 코트 샘플은 유사한 품질과 형태를 보였으나, 재프로그래밍이 아닌 다른 분석법 확립을 위해 채취되었다. 또는 오랜 기간 보관된 얼린 버피 코트(> 6년)부터 해동 후 품질과 상관없이 체세포 확장 후 재프로그래밍 가능한 형태를 보이지 않아 성공적으로 재프로그래밍되지 못합니다(표 1, 범주 2). 자원을 보존하기 위해, 확장 후 재프로그래밍 가능한 형태를 보이지 않는 샘플은 변환하지 않아야 합니다(표 1,.......

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토론

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iPSC 기술은 질병 기전 발견, 맞춤형 의학, 그리고 "접시 내 임상시험"과 관련하여 생의학 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다22,23. 혈액 샘플에서 iPSC 재프로그래밍을 위한 효율적이고 유연한 프로토콜은 iPSC 기술의 큰 잠재력을 발휘하는 핵심입니다. iPSC는 쉽게 채취할 수 있고 바이오뱅크에서 쉽게 구할 수 있기 때문입니다. 정제된 PBMC에서 재프로그래밍을 상세히 다룬 많은 프로토콜이 있지만, 이 프로토콜은 정제가 부족한 혈액 샘플(예: 냉동 버피 코트)에서 재프로그래밍을 상세히 하며, 재프로그래밍 시간 흐름의 체크포인트를 식별하여 성공 여부를 쉽게 평가하여 시간과 자원 낭비를 최소화합니다.

성공적인 재프로그래밍을 위한 첫 번째 중요한 단계는 고품질 시작 샘플을 확보하는 것입니다(

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공개 사항

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우리는 이 연구가 잠재적 이해 충돌로 해석될 수 있는 상업적 또는 금융적 관계 없이 수행되었음을 선언합니다.

감사의 글

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인간 대상자는 IRB 프로토콜 UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659, Emory# 000002114에 따라 헌혈에 대한 사전 동의를 제공하였습니다. 이 출판물에 보고된 연구는 국립보건원 산하 국립일반의학과학연구소의 지원으로 J. Art에게 5T32GM142623, V. Michopoulos에게 R01MH115174, N. Zeltner에게 R01NS114567을 지원하였습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립보건원(NIH)의 공식 입장을 대표하지는 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 표준 조직 배양 접시팔콘353003
12개의 웰 플레이트팔콘353043
15 mL 원뿔관피셔7200886
24개의 웰 플레이트코닝7200740
4% 파라포름알데히드 용액써모 사이언티픽J19943-K2
6개의 웰 플레이트피셔 사이언티브FB012927
accuSpin1R피셔 사이언티브75003449
액티빈 A바이오테크네338-AC
AF488-donkey & alpha; 염소인비트로젠A11055
AF555-당키 & 알파; RBT인비트로젠A31572
AF647-당키와 알파; m인비트로젠A31571
AF647-당키와 알파; RBT인비트로젠A31573
항생제-항균제(100X)피셔15 240 096  
바식스 폴리스티렌 혈청 피펫피셔14955233
14955234
14955235
14955236
BD 투버쿨린 주사기피셔14-826-87
BD 바큐테인 유리 단핵전지 준비(CPT) 튜브피셔 사이언티브02-685-125PBMC가 혈액 수집관을 분리하는 방식
BD  K2EDTA를 사용하는 진공 플라스틱 혈액 채취관: 혈가드 폐쇄피셔 사이언티브02-657-32항응고물질 코팅 혈액 수집관
B-머캅토에탄올피셔21 985 023  
소 젤라틴시그마G1393
브라큐리-T 항체 다클론 염소 IgGR& DAF2085
셀드롭 BF데노빅스셀드롭 BF
원심분리기 5702에펜도르프EP022628102-1EA
화학적으로 정의된 지질 농축물피셔NC9022744
키르 99021  R& D4423
CO2 인큐베이터산요MCO-20AIC
냉동 보존 저장 시스템맞춤형 바이오제닉 시스템V-1500AB
크라이오스타 CS10줄기세포 기술100-1061대체 냉동 매체
CytoTune-iPS 2.0 센다이 재프로그래밍 키트피셔A16517
덱사메타손시그마D2915
DMEM피셔11965118
DMEM/F12피셔11330057
DMSO피셔BP231-1
DPBS 1X 없이, CA MG와 NBSP;피셔MT21031CM
EDTA피셔AM9262
적혈구생성(EPO)바이오-테크네287-TC-500
에센셜 6 미디엄 (E6)피셔A1516401미분 기초 
에센셜 8 미디엄 (E8)피셔A1517001hPSC 기저 매체
EVOS FL 현미경열학AMF4300
태아 소 혈청VWR45000-734
FGF 기본 (FGF2)바이오테크네233-FB/CF 
겔트렉스피셔A1413202매트릭스 코팅
Gibco MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)피셔11140050
글루타맥스피셔35050061L-글루타민 대체물 
헤파린줄기세포 기술7980
히스토파크 1077시그마10771밀도 구배 해법 1 
홀로트랜스페린시그마T0665
인간 줄기세포 인자(SCF)페프로텍300-07-100UG
인슐린과 같은 성장인자 1(IGF1)페프로텍100-11-100UG
인터루킨-3(IL-3)페프로텍200-03-2UG
아이소템프 210 수욕피셔 사이언티브210
녹아웃 혈청 대체 요법(KSR)피셔10828028FBS 무료 보충제 
L-아스코르빈산시그마A4544-100G
LDN193189스템젠트04-0074
L-글루타민피셔25030081
림프홉렙줄기세포 기술7801밀도 구배 해법 2
마트리젤코닝CB-40234매트릭스 코팅
마우스 배아 섬유아세포피셔A34964 
나노그 다클론 염소 IgGR& DAF1997-SP
Nunc 바이오뱅킹 및 세포 배양 냉동 튜브피셔 사이언티브12-565-163N
페니실린/스트렙토마이신피셔15140122
정제 항-팍스-6 항체 토끼 다클론 IgG바이오레전드901301
QBSF-60 무혈청 미디엄퀄리티 바이오컬리컬160-204-101EM 베이스
회복 세포 배양 냉동 배지써모피셔 사이언티브12648010대체 냉동 매체
rh비트론넥틴 (VTN)피셔A31804
RPMI 1640 미디엄피셔11875093
SB431542R& D1614
센다이 바이러스 HN 단일클론 항체 마우스 IgG2a인비트로젠14649482
셀레나이트 나트륨시그마S5261
Sox17 항체 다클론 염소 IgGR& DAF1924
StemSpan 적혈구 확장 보충제줄기세포 기술2692대체 상업용 확장 미디엄 보충제
스템스판 SFEM II 매체줄기세포 기술9605대체 상업용 확장 매체
초저온 냉동고써모피셔 사이언티브TSX60086A
유니버설 피펫 팁 - 필터링VWR76322-132< > 76322-134< > 76322-150< > 76322-156
XAV939바이오테크네3748/10
Y-27632 이하이드로클로라이드바이오젬1293823

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Ray, A., et al. An overview on promising somatic cell sources ut....

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