루시퍼레이제 기반 생존 가능성 분석법을 이용한 인간 대장 오가노이드의 카드뮴 독성 평가를 위한 표준화된 프로토콜

요약

이 프로토콜은 인간 대장 오가노이드를 확립하고, 카드뮴 유발 독성을 감지하기 위한 루시페라제 기반 ATP 생물발광 분석법을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 검사는 오가노이드 생존성의 용량 및 시간 의존적 변화를 정량화하여 검사의 실현 가능성과 민감도를 평가합니다.

초록

카드뮴(Cd)은 1그룹 발암물질로 분류되며 심각한 전 지구적 환경 문제를 이루고 있습니다. 본 연구는 인간 대장항장 오가노이드 모델을 구축하고, 루시페라제 기반 ATP 생물발광 분석법이 대장 오가노이드(CO)의 Cd 노출에 대한 독성 반응을 감지하는 타당성과 민감도를 평가하는 것을 목표로 했습니다. 줄기세포는 인간 대장 조직에서 분리되어 3차원 저저막 기질 내에서 배양하여 CO를 생성했습니다. 오르가노이드는 다양한 노출 시간에 따라 단계별 Cd 농도로 처리되었습니다. 발광성 시약을 같은 부피 비율로 첨가하고, 상온에서 부드럽게 흔들어 용해와 시약 침투를 촉진한 후, 생물발광 반응이 진행되도록 배양했다. 루미네센스는 다중 모드 마이크로플레이트 리더기에 발광 모드로 기록되었습니다. 용량-반응 곡선 적합을 사용하여 최대 억제 농도의 절반 크기 계산과 생존 가능성 또는 상대적 생존력 변화를 평가하였습니다. 1차 줄기세포는 인간 대장 조직에서 성공적으로 분리되어 CO를 생성하는 데 사용되었습니다. Cd 노출은 용량 의존적 및 시간 의존적 오가노이드 대사 활동 감소를 일으켰습니다; 선량-반응 분석을 통해 오가노이드의 생존 곡선과 IC50 값을 산출하였습니다. 이 연구는 환경 중금속 독성학 연구에서 인간 CO를 활용하는 방법론적 지침과 실질적 통찰을 제공합니다.

서론

CD는 자연적으로 존재하는 중금속으로, 1그룹 발암물질로 분류되며 전 세계적인 환경 문제로 자리 잡^{았습니다.} 인간의 CD 노출은 주로 흡입과 식이 섭취를 통해 이루어집니다. 만성 저용량 노출은 다양한 건강 부작용과 연관되어 있지만, 사용과 환경 방출을 크게 줄이는 것은 여전히 어려운 과제입니다 ^2,3. 전통적인 2차원 배양은 평평한 기질 위에서 자라며 조직 구조, 세포 극성, 종양 미세환경이 부족합니다. 따라서 이들은 체내에서 이질성과 카드뮴 노출에 대한 진정한 독성학적 반응을 재현하는 능력이 제한^{적입니다.} 이러한 시스템은 세포 간 상호작용, 기질 의존적 성장, 또는 약물 내성 발달의 생물학적 과정을 충분히 모델링할 수 없습니다^. 환자 조직에서 유래한 3차원 오가노이드 시스템은 기존의 2차원 세포주에 비해 생리학적으로 더 중요한 플랫폼을 제공합니다^. 오가노이드는 1차 조직의 유전체 특징, 조직학적 조직, 기능 상태를 유지합니다. 이로 인해 종양 성장, 진화, 카드뮴 독성에 대한 민감도를 보다 정확하게 모델링할 수 있게 되어 질병 모델링 및 독성학 연구에 명확한 이점을 제공합니다⁷. CO는 복잡한 3차원 구조, 세포 이질성, 그리고 자기 갱신과 자기 조직화를 위한 내재적 능력을 가지고 있습니다 ^8,9. CO를 수혜자 쥐에 이식하면 장 내 줄기세포 자기갱신을 촉진하고 숙주 면역 미세환경을 조절하여 보호 효과를 낼 수 있습니다^. 2009년 Sato 등은 단일 성체 Lgr5⁺ 장 줄기세포가 자발적으로 자기조직화하고 분화하여 모든 장 세포 계통을 아우르는 crypt-villus 구조를 형성할 수 있음을 처음으로 입증했다¹⁰.

장 상피는 섭취 후 CD 독성에 대한 첫 번째 방어선을 형성합니다. 실제로 Cd의 경구 생체이용률은 일반적으로 5% 미만입니다. CD 유발 장 독성은 세포 간 접합부의 붕괴, 세포 간 투과성 증가, 염증 반응 유도로 특징지어집니다. 더 나아가, Cd는 장 내 면역 기능을 교란시키고 장내 미생물군의 구성과 항상성을 변화^{시킵니다.} 노출 용량과 지속 기간에 따라 Cd는 세포 주기 조절 이상을 일으켜 일부 상황에서는 암성 표현형을 촉진하고 다른 경우에는 세포자멸사를 유도할 수 있습니다. CD는 간접적으로 ROS(활성산소종) 생성을 자극하여 산화 스트레스와 산화환원 불균형을 유발할 수 있습니다. 수용체, 키나아제, 인산분해효소, 프로테아제, 접착 분자, 전사 인자의 기능은 산화환원 신호를 통해 조절될 수 있습니다. Cd는 또한 신호 전달 연쇄 반응을 교란하여 ERK1/2, JNK(c-Jun N-말단 키나아제), p38 MAPK(p38 미토겐 활성화 단백질 키나아제)의 활성화 상태를 여러 세포 유형에 걸쳐 변화시킵니다¹². MAPK 계단에서 ERK1/2를 활성화함으로써 Cd는 세포 증식과 생존을 촉진하고, 프로그램된 세포 사멸을 억제하며, 비정상적인 과증식에 기여할 수 있습니다¹³. CD는 주요 효과 단백질의 발현과 활성을 직접적이든 간접적으로 조절할 수 있습니다. 예를 들어, 종양 억제 단백질인 p53을 하향 조절하고 Bcl-2, Bcl-xL과 같은 항세포자멸성 단백질을 상향 조절하여 궁극적으로 세포자멸사와 세포주기 항상성을 방해합니다^.

Cd의 세포독성 효과를 평가하는 데 사용되는 CO 모델에서는 ATP 함량 측정이 오가노이드 생존 가능성을 평가하는 데 널리 사용됩니다. 에너지 대사의 중심 분자인 ATP는 오가노이드의 전반적인 대사 상태와 생존 가능성을 직접 반영합니다. CO에 카드뮴이 노출되면 Cd는 주로 미토콘드리아 기능 장애를 유발하고, 산화 스트레스를 악화시키며, 오가노이드 에너지 항상성을 방해합니다. 이러한 사건들은 ATP 생산을 저해하고 궁극적으로 오가노이드 생존력을 저하시킵니다. 따라서 ATP 수치 변화는 카드뮴 유발 세포독성에 대한 강력한 기능적 판독 신호가 됩니다. 기존의 세포독성 분석법에는 비도 MTT/CCK-8 분석, 생사염색, 유세포분석 기반 분석이 포함됩니다. 이러한 방법들과 비교할 때, ATP 기반 분석법은 3차원 오가노이드 시스템에서 뚜렷한 이점을 제공합니다. 오가노이드의 구조적 복잡성과 뚜렷한 공간적 이질성 때문에, 전통적인 염색 및 영상 방법은 조직 침투 부족과 정량적 정확도 저하로 인해 종종 제한됩니다. 반면, ATP 분석은 루시퍼레이스 매개 생물발광 반응에 의존하여 오가노이드 구조를 파괴하지 않고 직접 정량화할 수 있습니다. ATP 측정은 높은 감도와 넓은 동적 범위를 보입니다. 이를 통해 초기 대사 억제부터 오가노이드 사살에 이르기까지 연속적인 생물학적 반응을 감지할 수 있어, 다양한 카드뮴 농도에서 정확한 용량-반응 분석을 가능하게 합니다. ATP 수치는 오가노이드의 전반적인 기능 상태를 포괄적으로 반영하며, 형태학적 평가나 단일 분자 표지자에 의존하는 접근법보다 우수한 성능을 보입니다. 따라서 이 분석법은 고처리량 독성 스크리닝에 특히 적합하여 안정성과 재현성을 향상시킵니다.

ATP 생물발광을 이용해 CO의 Cd 노출 민감도를 평가하는 핵심 원리는 반딧불이 루시페라제가 ATP, Mg²⁺, O₂가 존재하는 상태에서 D-루시페린을 산화시켜 옥시루시페린을 생성하고 광자를 방출한다는 점입니다. 방출되는 빛의 세기는 정의된 선형 범위 내에서 샘플 내 측정 가능한 ATP 함량에 비례합니다. 따라서 발광은 세포 대사 활동이나 생존 가능성에 대한 간접적인 정량적 대체물 역할을 합니다. 오가노이드는 세포외 기질 내에 내재되어 있으며 다층 3차원 구조를 가지고 있습니다. 이를 수용하기 위해 ATP 분석제 시약은 최적화된 용해 완충 조성과 절차를 특징으로 합니다. 이러한 최적화는 내부 오가노이드 세포의 교란을 개선하고, ATP 방출을 촉진하며, 생물발광 신호를 안정화합니다^. 중요한 점은 ATP 생물발광이 정확한 세포 수가 아니라 대사 활동을 보고한다는 것입니다. 예를 들어, 미토콘드리아 억제제는 세포가 생존하는 동안에도 짧은 기간 동안 세포 내 ATP 수치를 현저히 감소시킬 수 있습니다. 반대로, 일부 초기 세포 사살 형태는 일시적으로 비교적 높은 ATP 수치를 보존할 수 있습니다.

카드뮴(Cd) 독성 평가에서 생리학적 관련성이 우수함을 입증함에도 불구하고, 대장직장 오가노이드 모델은 몇 가지 실질적 한계를 제시합니다. 전통적인 2차원(2D) 세포주와 비교할 때, 오르가노이드 배양은 더 많은 시간과 비용이 많이 듭니다. 더불어, 동물 유래 행렬에 의존하기 때문에 배치별 변동성이 발생하여 대규모 고처리량 독성 스크리닝에서의 활용도를 제한합니다. 이 모델들은 중금속이 장 상피에 미치는 직접적인 독성학적 영향을 평가하는 데 매우 적합하지만, 전신 독성이나 복잡한 독성 작용을 평가하는 생체 내 모델을 완전히 대체할 수는 없습니다.

이 연구에서는 인간 대장 조직을 원료로 사용하여 대장암 줄기세포를 분리하고 시험관 내에서 CO를 확립하였습니다. 오가노이드는 다양한 농도와 다양한 노출 시간 동안 Cd에 노출되었습니다. 그 후 발광 감지 모드의 다중 모드 마이크로플레이트 리더기를 사용해 발광을 측정했습니다. 특정 마이크로플레이트 리더의 운영 소프트웨어를 사용하여 세포 생존성 또는 IC50 값을 계산하고 시각화하였습니다.

프로토콜

이 실험은 쑤저우 직업보건대학 윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. SWYXLL202516) 그리고 의료 윤리 기준에 따라 진행되었습니다. 본 연구의 모든 대상자는 서면 동의서를 제공하였습니다.

1. 인간 대장 조직 분리 및 COs 형성

1. 조직 샘플의 운송 및 보존
   1. 실험 전에 기저막 매트릭스를 4°C에서 천천히 해동하고, 필요한 배양지를 실온에 맞게 평형으로 만듭니다.
   2. 임상 시술로 얻은 인간 대장 조직을 즉시 미리 냉각된 조직 보존용액(2–8 °C)에 넣습니다.
      참고: 운송 중 조직이 완전히 잠긴 상태를 유지해야 합니다. 샘플을 실험실로 옮겨.
2. 생물안전 캐비닛 아래에 조직을 6cm 배양 접시에 넣어 평가합니다. 상피 성분은 유지하면서 메스와 겸자를 사용해 보이는 지방 조직과 근육층을 조심스럽게 제거하세요.
3. 조직을 3 mL의 인산염 완충 생리식염수(PBS)와 300 μL 항생제를 보충한 6cm 접시에 옮깁니다. 조직을 2mm × 5mm 조각으로 잘라내세요.
4. 조직 조각을 50mL 원심분리관으로 옮깁니다.
5. 튜브에 미리 냉각된 PBS 10mL와 0.5 M EDTA(최종 농도 ~10 mM) 200 μL 첨가합니다.
6. 튜브를 실온에서 셰이커에 올려놓고 0.072g으로 15분간 부드럽게 저어줍니다.
7. 겸자를 사용해 조직을 배양 접시로 옮기고 현미경으로 검사합니다. 납골당 구조물이 보이거나 분리되기 시작하면 다음 단계로 넘어가세요.
   참고: EDTA 처리 후 미세한 관찰에서 납골 구조가 보일 때, 소화가 충분히 이루어져 납골 섬을 분리할 수 있게 되고, 납골당은 느슨해진 상피 조직 조각에서 분리되기 시작합니다. 온전한 납골당은 일반적으로 명확한 선원형 또는 관 형태와 명확한 중앙 내강을 유지하지만, 과도한 소화는 다수의 해리된 단일 세포와 괴사 잔해를 생성합니다.
8. 수많은 온전한 지하 납골당이 보이고 조직 조각이 느슨하고 반투명해 보이면 소화를 중단하여, 부드러운 피펫팅으로 납골당을 쉽게 방출할 수 있습니다.
   참고: 장기간 EDTA 배양은 크립트 무결성을 방해하고 세포 잔해 축적을 증가시키며, 장 줄기세포의 생존력을 감소시켜 이후 오가노이드 형성 효율을 감소시킵니다.
9. 항생제 보조제 PBS 15mL를 추가하여 EDTA 소화를 멈추세요. 부드럽게 섞으세요.
10. 샘플을 300 × g에서 4 °C에서 3 분간 원 심분리합니다.
11. 상정액을 제거하세요.
12. 완전 세포 배지 1mL를 추가하고 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
13. 300 × g 에서 3분간 원심분리한 후 상청액을 버리세요.
14. 1.5mL 마이크로 원심분리관에 기저막 매트릭스 500 μL을 넣고 잘 섞습니다.
15. 혼합 시 실온 노출을 최소화하고, 기저막 매트릭스는 얼음 위에 올려 조기 굳어지지 않도록 하세요.
16. 혼합물을 24웰 플레이트의 각 웰에 각각 25 μL씩 떨어뜨려 방울을 만듭니다.
17. 24웰 플레이트를 뒤집어 37°C에서 5% CO₂와 함께 20분간 배양합니다.
18. 각 웰에 600 μL CO배양지를 추가합니다.
19. 상업용 대장유기체 배양 배지와 해리 시약을 구입하여 제조사 지침에 엄격히 따라 사용하세요.
20. 완전한 세포 배양지를 준비하기 위해 500mL의 DMEM 기저 배지를 태아 소 혈청(FBS) 50mL와 페니실린-스트렙토마이신 5mL를 보충합니다. 용액을 부드럽게 뒤집어 완전히 섞으세요.

2. Cd에 노출된 CO의 민감도 분석법

1. 96웰 플레이트에서 CO를 도금 및 배양하기
   1. 각 웰에서 배양 배지를 버리고 500 μL의 오가노이드 해리 용액을 추가합니다. 부드럽게 위아래로 피펫을 움직여 기저막 매트릭스를 분산시키세요.
   2. 처리된 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 소화하고, 초기 소화 시간은 10분입니다.
   3. 24웰 플레이트의 각 웰에서 소화 용액을 15mL 원심분리관에 모아 10mL의 완전 세포 배양지를 추가합니다.
   4. 300 × g 에서 원심분리기로 3분간 오가노이드를 수집하고 상청액을 버립니다.
   5. 완전 세포 배양 배지 1mL를 추가하고, 피펫으로 충분히 혼합한 후 현탁액을 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
   6. 300 × g 에서 3분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   7. 기저막 매트릭스 100 μL를 첨가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.
   8. 오가노이드를 해리시키고 현미경으로 단일 세포 수를 추정한 후 우물당 약 3,000–5,000개의 단일 세포를 시딩합니다.
   9. 모든 실험군에서 비교적 일관된 시딩 밀도를 유지하여 오가노이드 성장과 실험 결과를 재현 가능하게 합니다.
   10. 오가노이드 해리 후 현미경 평가와 이전에 보고된 조건을 바탕으로 시딩 범위를 조정합니다.
   11. 96웰 플레이트의 각 웰 중앙에 혼합물을 6μL씩 추가합니다. 총 30개의 우물을 사용하고, 세 개의 기술적 복제를 사용하세요.
   12. 플레이트를 뒤집어 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 15분간 배양하세요.
   13. 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL 오가노이드 배양지를 추가합니다.
   14. 파종 후 정확히 7일 후에 카드뮴 처리를 시작하세요.
       참고: 이 7일간의 배양 기간은 단일 세포가 구조적으로 완전한 CO로 완전히 발달할 수 있게 해줍니다.
2. CD 농도 희석
   1. 3.67 mg의 염화카드뮴 분말을 2 mL의 멸균 초순수수에 용해하여 최종 부피 2 mL의 10 mM 스톡 용액을 만듭니다.
   2. 10 mM 카드뮴 용액 2mL를 0.22 μm 필터를 통과시켜 멸균합니다.
   3. 멸균된 카드뮴 용액을 1.5mL 원심분리관에 분리하여 4°C에서 빛으로부터 보호하여 보관합니다.
   4. 실험 내내 실험복, 보호 장갑, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요.
   5. 노출 위험을 최소화하기 위해 화학 연기 후드 내에서 모든 관련 작업을 수행하세요.
   6. 카드뮴 보조 배양 배양지, 피펫 팁, 원심분리관, 배양 접시 등 모든 CD 함유 폐기물을 유해 화학 폐기물로 분류 및 관리합니다.
   7. 이 물질들은 지정된 중금속 액체 또는 고체 폐기물 수거 용기에 버려야 합니다.
   8. 모든 폐기물은 기관 지침과 지역 환경 규정에 엄격히 따라 처리해야 합니다.
   9. CD 폐기물을 일반 실험실 쓰레기처럼 취급하거나 싱크대에 버리지 마세요.
   10. 24웰 플레이트의 뚜껑을 4, 3, 2, 1, 0으로 라벨링하세요.
       참고: 최종 농도인 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 0 μM에서 오가노이드를 Cd로 처리하십시오. 카드뮴 정액의 희석은 표준 공식으로 계산되었습니다:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. 20 μM 작업 농도 4 mL를 준비하기 위해, 10 mM 스톡 용액 8 μL를 3992 μL 완전 배양지에 첨가합니다. 용액을 충분히 섞어 균일하게 분포하세요.
   1. 라벨이 붙은 웰 4에 배양지 1.4mL를 추가하고, 나머지 웰마다 700 μL의 배양지를 추가합니다.
   2. 라벨링된 웰 4에서 5.6 μL 배양지를 제거하고 5.6 μL 카드뮴 용액을 추가합니다. 충분히 섞으세요.
   3. '4' 웰에서 '3' 웰로 700 μL 용액을 옮기고 완전히 혼합합니다.
   4. 각 우물에서 다음 낮은 번호의 우물('3'에서 '2', '2'에서 '1', '1'에서 '0'까지)으로 이송 및 혼합 과정을 반복하며, 각 단계에서 철저히 혼합합니다.
      참고: 0으로 표시된 웰에서는 어떤 연산도 수행하지 마십시오.
   5. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 기존 배양지를 버립니다.
   6. 96웰 플레이트의 뚜껑을 왼쪽에서 오른쪽으로 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM, 0 μM으로 라벨링합니다.
   7. 각 표지된 웰에 100 μL 카드뮴 함유 배양지를 추가합니다.
   8. 접시를 인큐베이터에 넣으세요.

3. 발광 생존 시약 첨가

1. −20 °C 냉동고에서 발광 생존 시약을 꺼내 실온에서 해동시킵니다. 발광 생존성 시약을 1:1 부피 비율로 추가하세요.
2. 일회용 시약 저장소에 2.5mL의 발광 생존성 시약을 추가합니다.
3. 대장항문 오가노이드 배양 배양액 2.5mL를 추가하고 피펫팅으로 완전히 혼합합니다.
4. 폐기물 흡입 시스템을 사용해 96웰 플레이트의 각 웰에서 오가노이드 배양 배지를 제거합니다. 우물에서 기저막 매트릭스를 흡입하는 것은 피하세요.
5. 일회용 시약 저장소에서 200 μL의 용액을 CO가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기고, 격렬한 피펫팅으로 완전히 혼합합니다. 피펫팅 중에 기포를 넣지 마세요.
6. 플레이트를 실온에서 25분간 부화시키세요. 빛을 차단한 실온에서 부양하세요.

4. 발광 생존 시약 측정

1. 특정 마이크로플레이트 리더기(보조 그림 1A)의 운영 소프트웨어를 열어라.
2. 지금 읽기(보조 그림 1B)를 클릭하세요.
3. 새 (보조 그림 1B)를 클릭하세요.
4. 클릭하여 읽기 (보조 그림 1C).
5. 선택된 발광(보조 그림 1D).
6. 선택: 루미네센스 섬유(보조 그림 1D).
7. 확인 버튼을 클릭하세요 (보조 그림 1D).
8. 전체 플레이트를 선택하세요 (보조 그림 1E).
9. 모두 삭제 버튼을 클릭하세요 (보조 그림 1F).
10. 목표 96웰 플레이트에서 해당 위치를 선택하여 총 15개의 웰을 얻습니다(보조 그림 1G).
11. 확인 버튼을 클릭하세요 (보조 그림 1G).
12. 96웰 플레이트를 기기에 삽입합니다(보조 그림 1H).
13. '뚜껑 사용'을 선택하세요 (보조 그림 1I).
14. 측정을 시작하려면 확인을 클릭하세요(보조 그림 1I).
15. 측정이 완료된 후에는 데이터를 엑셀로 내보내기 버튼을 클릭하세요(보조 그림 1J).

5. 데이터 처리 및 분석

1. 비선형 회귀가 가능한 오픈 통계 데이터 분석 소프트웨어입니다. (보충 그림 2A).
2. XY 데이터 테이블을 선택하세요(보조 그림 2A).
3. X를 숫자로 설정하세요 (보조 그림 2A).
4. Y를 입력하도록 설정하여 나란히 있는 하위 열에서 복제 값을 입력하고 3개의 복제를 입력하세요 (보조 그림 2A).
5. 데이터를 입력하세요(보조 그림 2B).
6. 클릭 분석(보조 그림 2C).
7. XY 분석을 클릭하세요 (보조 그림 2D).
8. 비선형 회귀(곡선 적합) (보조 그림 2D)를 클릭하세요.
9. 확인 버튼을 클릭하세요. (보조 그림 2D).
10. 선택 용량-반응 – 억제 (보충 그림 2E).
11. 로그 반응(억제제) 대 정규화 반응 – 가변 기울기 선택 (보조 그림 2E).
12. 분석을 실행하려면 확인을 클릭하세요(보조 그림 2E).
13. 파일 (보조 그림 2F)를 클릭하세요.
14. 내보내기(보조 그림 2F)를 클릭하세요.
15. 확인 버튼을 클릭하세요 (보조 그림 2G).

결과

인간 CO의 설립
우리는 조직 샘플에서 대장 납골당 구조를 성공적으로 분리했으며, 저배율 및 고배율 현미경 모두에서 전형적인 납골 지하 형태를 명확히 관찰하였습니다. 시험관 내 배양 과정에서 분리된 납골당은 점차 확장되어 질서 있는 형태학적 성숙 과정을 보였다(그림 1A,B). 배양 3일차와 6일차에는 구조적으로 온전한 대장항문 유기체가 형성되었으며, 주로 구형 또는 초기 출아 형태의 구조를 보였다(그림 1C,D).

CO의 CD 노출에 대한 민감성
CO는 96 웰 플레이트에 시딩되어 추가로 5일간 배양한 후, 0, 5, 10, 20, 40 μM 농도의 카드뮴 처리가 이루어졌습니다. 72시간 노출 후 ATP 기반 발광 분석법을 수행하여 상대 발광 단위(RLU)를 측정하고, 데이터를 분석 및 시각화하였습니다. 결과는 카드뮴 농도가 증가할수록 오가노이드 생존력이 용량 의존적으로 유의미하게 감소하는 것을 보여주었습니다(그림 2A). 10 μM, 20 μM, 40 μM 카드뮴에 노출된 CO는 RLU 값이 현저히 감소했습니다(그림 2B). 5 μM Cd에 노출된 대장 오가노이드에서는 유의미한 독성이 관찰되지 않았습니다. 생존 가능성 데이터와 일치하게, 형태학적 분석 결과 카드뮴 처리된 대장항문 오가노이드에서 오가노이드 크기 감소, 상피 구조의 심각한 붕괴, 점진적인 구조적 파편화 등 뚜렷한 구조적 변화가 확인되었습니다(그림 2C). 이 발견들은 대장항문 오가노이드가 카드뮴 유발 세포독성에 매우 민감함을 나타냅니다.

그림 1: 인간 대장암장 납골당 분리 및 대장직장 오가노이드 배양 확립. (A) 분리된 인간 대장항장 지하 묘지의 대표 이미지. (10×). (B) 단일 지하묘의 고배율 뷰 (20×). (C) 배양 3일 후 CO의 대표성 이미지 (4×. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: CO에서 Cd에 의해 유발된 세포독성 및 형태학적 변화. (A) 다양한 농도의 Cd에 노출된 CO의 상대적 선량-반응 곡선. x축은 Cd 농도를, y축은 상대적인 오르가노이드 생존도를 나타냅니다. (B) 다양한 농도의 Cd 처리 후 CO의 상대적 RLU 값. X축은 Cd 농도를 나타내고, Y축은 상대적인 RLU 값을 나타냅니다. 일원 ANOVA *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. (C) 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM 대역에서 처리되지 않은 0 μM과 Cd 처리된 CO의 대표적인 밝시야 이미지. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

보조 그림 1: 특정 마이크로플레이트 리더의 운영 소프트웨어를 활용한 RLU 검출을 위한 상세한 16단계 워크플로우. (A) 소프트웨어 아이콘. (B) 소프트웨어 런칭 인터페이스. (C) 설정 메뉴. (D) 분석 선택 인터페이스. (E) 접시 레이아웃 구성 메뉴. (F) 기본 플레이트 배치. (G) 실험용 플레이트 배치에 따라 우물 위치를 구성합니다. (H) 마이크로플레이트 장전. (I) 기기가 RLU 측정을 시작합니다. (J) 데이터 내보내기. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 이후 데이터 내보내기, 데이터 처리 및 통계 분석이 통계 데이터 분석 소프트웨어에서 수행됩니다. (A) 홈 화면. (B) 데이터 입력 테이블. (C) 분석 대화. (D) 분석 매개변수 메뉴. (E) 비선형 회귀 설정 메뉴. (F) 파일 옵션 메뉴. (G) 데이터 내보내기 대화 대화. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구는 CO를 이용한 카드뮴 노출 및 ATP 생존성 분석에 대한 표준화된 프로토콜을 수립하여 카드뮴이 오가노이드 생존력에 미치는 영향을 평가합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 해리 및 96웰 플레이트 단계를 최적화하여 실험적 재현성과 이후 ATP 분석의 안정성을 향상시킵니다. 현재 실험 프로토콜은 주로 Cd 독성 평가를 위한 3D 대장암 오가노이드 모델 구축에 초점을 맞추고 있지만, 광범위한 연구를 통해 전통적인 2D 세포 배양과 3D 오르가노이드 모델이 약물 반응, 세포 간 상호작용, 조직 구조, 독성학 프로필 면에서 크게 다르다는 것이 입증되었습니다. 2차원 단일층과 비교할 때, 오르가노이드는 종양의 공간 구조, 세포 이질성, 생체 내 미세환경을 더 충실히 재현하여 생리학적 관련성이 뛰어납니다. 복잡한 세포-세포 및 세포-세포외기질(ECM) 상호작용이 없기 때문에, 2D 배양이 중금속 노출에 반응할 때 실제 생체 내 독성학적 과정을 정확히 포착하지 못할 수 있습니다¹⁶. 반대로, 본 연구에서 확립된 CO 모델은 종양 조직의 3차원 성장 역학을 효과적으로 시뮬레이션하여 Cd 유발 독성 평가에 생리학적으로 매우 중요한 플랫폼을 제공합니다.

오가노이드 통과 과정에서 해리 시간은 약 10분으로 엄격히 유지되었다. 이 최적화는 불완전한 해리를 방지하여 과도한 세포 집합체를 방지하고, 과도한 단일 세포 수를 유발하는 과도한 해리를 방지합니다. 해리 정도를 정밀하게 조절함으로써 비교적 균일한 오가노이드 구조를 달성하여 이후 약물 치료와 ATP 생존성 검사의 일관성을 높였습니다.

우리는 고처리량 96웰 배양 시스템을 사용하고, 기저막 매트릭스 플레이트 부피를 웰당 6 μL로 표준화했습니다. 이 표준화는 모든 우물에서 일관된 오가노이드 밀도와 성장 특성을 보장함으로써 우물 간 변동성을 최소화하여 궁극적으로 실험적 재현성과 데이터 비교 가능성을 향상시킵니다. ATP 발광 분석법과 통계 데이터 분석 소프트웨어를 이용한 선량-반응 곡선 분석을 결합하여, 우리는 Cd 노출 후 오가노이드 생존 능력 변화에 대한 견고한 정량적 평가를 달성했습니다. 이 연구는 환경 독성학 및 중금속 노출에서 오르가노이드 모델을 적용하기 위한 매우 재현 가능한 실험 프로토콜을 확립합니다.

COs 배양 과정에서는 크립트 펠릿과 기저막 매트릭스를 철저히 혼합하는 것이 적절한 COs 형성과 안정적인 성장을 보장하는 데 매우 중요합니다. 기저막 매트릭스의 비율은 70% 이상으로 유지해야 하며(기저막 매트릭스 부피는 70% >). 권장되는 기저막 매트릭스 부피는 96웰 플레이트의 경우 웰당 6 μL, 48웰 플레이트의 경우 웰당 20 μL, 24웰 플레이트의 경우 웰당 25 μL입니다. 매트릭스 중합 후에는 웰에 다음 부피를 추가합니다: 96웰 플레이트는 웰당 100 μL, 48웰 플레이트는 300 μL, 24웰 플레이트는 500 μL입니다. 배지를 기저막 매트릭스 돔에 직접 피펫팅하는 것은 삼차원 구조를 방해할 수 있으므로 주의해야 합니다. 표현형 및 유전적 안정성을 유지하기 위해 이 연구는 대장항문 오가노이드 사용을 최대 4회로로 제한했습니다.

크립트나 CO가 약 600 μm 직경에 도달하거나 어두워지고 성장 정체가 나타나면, 후속 민감도 분석을 위해 신속히 통과시켜야 합니다. 효소 해리 과정에서는 현미경으로 소화를 관찰해야 합니다. CO가 충분히 소세포 군집이나 단일 세포로 분리되지 않으면, 오가노이드 크기와 해리 상태에 따라 소화 시간이 점차 연장될 수 있습니다. 과소화와 세포 생존력 상실 위험을 최소화하기 위해 한 단계로 장기간 소화되는 것은 피해야 합니다.

다음 식으로 각 우물의 상대적 생존 가능성을 계산하고, 각 농도별 반응 값으로 복제 우물의 평균 비율을 사용합니다

 

ATP 생물발광 분석법은 반딧불이 루시페라제에 의해 D-루시페린을 산화시키는 데 기반하며, 이는 광자 방출을 유도합니다. 높은 감도, 플레이트 기반 고처리량 포맷과의 호환성, 그리고 표준화된 상업용 키트의 가용성 덕분에, 이 방법은 오르가노이드 모델¹⁷에서 예비 독성 스크리닝에 널리 적용되고 있습니다.

여러 가지 교란 요인을 고려해야 합니다. 특정 화학물질은 화학적 간섭이나 효소 억제를 통해 루시퍼레이스 효소 반응을 직접적으로 억제하여 신호 소멸을 초래할 수 있습니다. 3차원 세포외 기질에서의 배경 발광, 오가노이드 크기와 밀도의 이질성, 그리고 불완전한 용해는 웰 간 및 배치 간 상당한 변동성을 초래할 수 있습니다. ATP 기반 발광만으로는 세포 사멸 양식을 정확히 구별하거나 근본적인 독성학적 기전을 밝힐 수 없다¹⁸.

방법론적 신뢰성을 높이기 위해 체계적인 품질 관리 조치가 권장됩니다. 제조사가 권장하거나 이전에 검증된 용해 버퍼를 사용하고, 필요할 경우 연장 용해 시간, 기계적 해리 또는 동결-해동 사이클을 사용하여 매트릭스 내 세포 용해 효율을 개선합니다. 둘째, 분석 최적화 중 ATP 스파이크인 회수 실험을 수행하여 시험 화합물 또는 용해 환경에 의한 발광 반응의 직접적 억제 가능성을 평가합니다. 셋째, ATP 표준 곡선을 사용해 선형 검출 범위를 확인하고, 시약 첨가, 배양, 플레이트 판독 사이의 타이밍을 엄격히 제어하여 기술적 변동성을 최소화합니다. 마지막으로, 각 분석법에 블랭크, 차량, 음성 대조군을 포함시키고, 경계 효과와 배치 관련 변동을 평가하고 보정할 수 있는 충분한 기술적 복제를 포함시켜야 합니다. 최근에는 용해 화학이 개선되고 신호 안정성이 향상된 여러 오가노이드 최적화 생존성 분석법이 개발되었으며, 이들 제형은 일반적으로 3차원 독성 분석에서 우수한 성능을 입증했습니다¹⁹. 요약하자면, 이 연구는 인간 CO를 환경 중금속 독성학의 시험관 내 모델로 사용하여 Cd 노출에 대한 오가노이드 감수성을 평가하기 위한 고처리량, 민감한 ATP 생물발광 기반 검사법을 확립하였습니다. 이 연구는 오가노이드 기반 연구 시스템에서 독성 평가를 위한 실질적인 실험 참고 및 방법론적 지침을 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL 원심분리기 튜브	BIOFIL	CFT011150
1mL 피펫 팁	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL 피펫 팁	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24웰 플레이트	Corning Incorporated	3524
50 mL 원심분리기 튜브	CLUXCELL	321050
96웰 플레이트	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	특정 마이크로플레이트 리더용 운영 소프트웨어.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	1:1 부피 비율의 발광 생존성 시약.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
포스핀	Beyotime	FS019
아이스 박스	Beyotime	FBX078
저온 고속 원심분리기	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	베이스먼트 멤브레인 매트릭스
오가노이드 분리 용액	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	오가노이드 분리 용액
페니실린-스트렙토마이신	Beyotime	C0222
인산염 완충 식염수(1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
피펫	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		특정 마이크로플레이트 리더용 운영 소프트웨어.
가위	Beyotime	FS001
조직 소화 용액	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S