자가 조립된 간엽 줄기세포 집합체에서 유래한 세포외 소포의 분리 및 치료적 적용

요약

이 프로토콜은 자가 조립된 줄기세포 집합체에서 대형 세포외 소포(LEVs)를 효율적으로 분리하고 하악골 재생에 대한 치료적 응용을 상세히 설명합니다.

초록

세포외 소포(EV)는 세포 간 소통의 중요한 매개체이자 재생 의학에 유망한 세포 자유 인제입니다. EV 하위 집단 중에서, 대형 세포외 소포(LEV)는 재생 촉진 화물이 풍부해 조직 수리에 특히 적합합니다. 그러나 기능성 치과 줄기세포 유래 LEV를 생성하는 표준화되고 재현 가능한 방법은 후속 특성화 및 치료 평가에 한계가 있습니다. 첨단 유두에서 추출된 줄기세포의 뛰어난 골형성 잠재력을 활용하여 저접착 조건에서 3D 배양 모델을 개발하여 자기 조립 SCAP 집합체를 유도하였습니다. 이 모델은 생리적 중간엽 응축을 모방하여 세포 간 상호작용을 크게 증진하고 LEV 분비를 촉진합니다. 주요 배양 매개변수와 처리 노트가 제공되어 집단의 일관성을 개선하고 세포 생존력을 유지하면서 LEV 산출을 극대화합니다. 여기서는 3D 골재 생성, 차동 원심분리를 통한 분리, 나노입자 추적 분석(NTA) 기반 입자 크기 분포 및 농도 분석, 그리고 하악골 결손 수리를 위한 열가교 하이드로겔을 이용한 치료 전달을 포함하는 기능성 SCAP 기반 LEV의 효율적 생산을 위한 표준화된 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 두개안면 재생의 후속 기전 연구와 전임상 평가를 위한 LEV 생산을 간소화합니다. 이 최적화된 워크플로우는 일정한 수율과 농축된 친골제인 화물을 가진 생체 활성 LEV의 재현 준비를 보장하여, 기초 연구를 촉진하고 EV 매개 두개안면 재건의 임상 번역을 가속화합니다. 대표적인 응용에서는 하이드로겔 가재 LEV가 결함 부위에 국소적인 저장소를 제공하며 이식 시 편리하게 취급을 돕습니다. 이 방법은 SCAP 기반 LEV를 준비할 수 있는 확장 가능한 플랫폼을 제공하며, 표준화된 보고 및 중개 연구 설계에 대한 주요 고려사항을 강조합니다. 이 접근법은 두개안면 EV 실험실 전반에 걸쳐 더 넓은 도입을 지원합니다.

서론

세포외 소포(EV)는 세포에서 방출되는 막에 결합된 나노입자로, 단백질, miRNA, 지질과 같은 생체 활성 화물의 전달을 통해 세포 간 통신을 매개^합니다. EV 하위 집단 중에서 큰 세포외 소포(LEV)는 세포막에서 직접 방출되고 재생 촉진 분자의 고유 농축이 특징으로, 조직 수리와 재생에 매우 적합합니다 ^4,5. 재생 의학에서 중간엽 줄기세포(MSC)에서 유래한 전기(EV)는 전세포 치료에 대한 실질적인 세포 없는 대안으로 점점 더 인정받고 있습니다 ^6,7,8. 이들은 부모 MSC의 파라크린 재생 효과를 재현하면서도 직접 세포 이식의 한계인 낮은 착착 효율, 면역원성, 배치 변이성 ^7,8,9,10을 피합니다. MSC 원천 중 첨단 유두에서 유두의 줄기세포(SCAPs)는 우수한 골^{형성 및 치}수 분화 잠재력을 보이며^, SCAP 유래 줄기세포는 구강안면 뼈 및 치과^{조직 수리에} 특히 매력적입니다.

특히, 전기차의 생기생성과 기능은 세포 미세환경의 깊은 영향을 받습니다^14,15. 기존의 2차원(2D) 단층 배양은 원래 조직 맥락에서 크게 벗어나 재생 능력이 저하된 EV를 자주 낳는다 ¹⁸. 반면, 3차원(3D) 자기조립된 MSC 집합체는 생리학적 중간엽 응축의 핵심 측면을 재현하는데, 이 발달 단계는 높은 세포 밀도, 집중적인 세포 간 접촉, 그리고 구조적 지지를 제공하고 세포 부착, 이동, 운명 결정을 조절하는 생화학적 및 기계적 신호를 전달합니다 ^19,20,21. 이 생체 모방 3D 미세환경은 세포 간 소통과 파라크린^{신호를 향상시킬} 뿐만 ^아니라, 더 높은 수율과 향상된 생체 활성 화물 프로필을 가진 전기차 분비를 촉진합니다^24,25,26. 따라서 3D 자기조립 MSC 집합체를 활용하는 것은^{재생 응용 분야에서} 기능적으로 강력한 전기차를 얻는 매우 유망한 전략으로 떠오릅니다.

집합체 기반 전기차의 명확한 장점에도 불구하고, 3D 시스템과의 격리 및 특성 분석을 위한 표준화된 프로토콜은 아직 미흡합니다. 차동 원심분리와 같은 현재의 EV 격리 방법론은 잘 확립되어 있으며 EV 생산을 위한 확장 가능한 프레임워크를 제공합니다²⁷. 마찬가지로, 2D 배양 세포에서 비타민 C에 의해 세포가 말리고 응집하는 경우가 많아 MSC 응집체 생성 방법도 보고되었다²⁸. 그러나 이러한 비타민 C 유도 응집체 내의 ECM 구조는 여전히 자연 간엽 조직의 공간적으로 조직된 응축 형태 미세환경과는 다를 수 있습니다. 반면, 저접착 조건에서 스캐폴드 없는 자기 조립은 중간엽 응축의 핵심 특징을 근사하는 조밀하고 구형 응집체 형성을 용이하게 합니다^19,29. 현재로서는 이러한 저접착 유도 3D SCAP 집합체에서 전기를 분리하고 적용하는 체계적이고 재현 가능한 워크플로우가 부족합니다. 실용적인 관점에서 기존 2D SCAP 배양에서 LEV 생산은 나노입자 추적 분석(NTA)에 따르면 일반적으로 ~¹¹ 입자/mL 범위에 해당하며, 3D 저접착 집합은 LEV 출력을 몇 배 증가시키면서도 후속 응용에서 재현성을 유지할 것으로 기대됩니다. 이 격차를 해소하기 위해, 우리는 SCAPs의 고유한 골형성/치병 기능을 활용하고 3D 저접착 집집을 통해 MSC 미세환경을 최적화하는 포괄적인 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 고품질 LEV의 신뢰성 높은 생산을 가능하게 하여, 두개안면 의학에서 세포 없는 재생 치료를 발전시키는 표준화된 도구를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 제4군사의과대학 동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 받았으며, ARRIVE 지침을 준수하여 수행되었습니다. 인체 샘플 채취 및 사용은 제4군사의과대학 윤리위원회(승인 번호)의 승인을 받았습니다. IRB-REV-2022187). 샘플 채취 전에 모든 기증자로부터 서면 동의를 받았으며; 미성년자이거나 동의를 제공할 수 없는 기증자의 경우, 법적 보호자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 모든 시약은 멸균 여과되었으며, 세포 배양 절차는 멸균을 유지하기 위해 생물안전 캐비닛 안에서 진행되었습니다(재료 표 참조). 모든 인간 유래 물질(치아, 조직, 1차 세포, 조건 배지, EV 제제)을 잠재적 감염성 물질로 간주하세요. 인간 샘플과 관련된 모든 절차를 인증된 생물안전 캐비닛 안에서 적절한 개인 보호 장비(PPE, 예비 가운, 장갑, 안구 보호구)를 사용하여 시행하세요. 생물안전 및 폐기물 처리를 위해 기관 BSL-2 지침을 준수하십시오: 모든 인체 유래 물질과 오염된 일회용품을 BSL-2 생물학적 위험 폐기물로 취급; 사용 후에는 기관에서 승인한 소독제로 표면/장비를 오염 제거하세요. 액체 생물학적 위험 폐기물을 라벨이 붙은 용기에 수집하고, 폐기 전에 승인된 방법으로 비활성화하세요. 샤프는 즉시 승인된 샤프 용기에 버리세요(뚜껑 교체 금지). 동물 조직/사체와 마취/화학 잔류물을 규제된 생물학적 위험/화학 폐기물로 취급하고, 관련 규정에 따라 기관 서비스를 통해 처리합니다.

1. 인간 SCAP의 격리 및 배양

참고: P/S는 생체 활성 항생제 혼합물이며 피부/눈 자극이나 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 개봉 시 BSL-2 생물안전 캐비닛 안에 손잡이가 있습니다; 장갑과 안경 보호구 착용; 에어로졸 생성 방지; 그리고 기관의 화학 폐기물 지침에 따라 폐기물을 처리합니다. 콜라게나제 1형(용액)은 생체 활성 효소로 피부나 눈 자극이나 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. BSL-2 생물안전 캐비닛 내 손잡이; 장갑과 안경 보호구 착용; 피펫팅 중 튀김과 에어로졸 발생을 피하고; 그리고 기관 절차에 따라 유출물을 신속히 제염합니다. 보관 및 사용 중 콜라겐제 I형을 빛으로부터 보호하세요(재료표 참조).

1. 건강한 기증자(16–21세)로부터 미성숙 첨단이 있는 제3대금니를 채취하고, 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 인산 완충 식염수(PBS)로 꼼꼼히 헹군다( 재료표 참조).
2. 멸균 안다 핀셋과 가위를 사용해 뿌리 꼭대기에서 유두 끝 조직을 해부한 후 작은 조각(<1 mm³)으로 잘게 다집니다.
3. 모든 조직 조각을 15mL 원심분리관으로 옮깁니다. 조각을 37°C에서 1시간 동안 1시간 동안 소화하고, 15분마다 부드럽게 흔듭니다.
4. 소화를 멈추려면 완전한 α 최소 필수 배지(α-MEM)를 같은 부피로 첨가합니다(재료 표 참조).
   참고: 콜라겐제 제1형의 소화 시간은 고정되어 있지 않으며 조직 소화 상태에 따라 달라집니다. 조직이 반쯤 침식되면 배지를 추가해 소화를 중단하세요. 과도한 소화는 세포 생존력을 저하시킬 수 있습니다.
5. 세포 현탁액을 100 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버리고 2mL의 완전한 α-MEM에 다시 부탁합니다.
6. 소화된 조직 현탁물을 10cm 페트리 접시에 씨앗 뿌리고 완전한 α-MEM 8mL를 10mL 용량으로 최종 부피로 만듭니다.
7. SCAPs는 5% CO₂를 사용한 가습 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다.
   참고: 배양 상태를 지속적으로 모니터링하세요. 세포는 일반적으로 조직 조각에서 이동하여 방사형 패턴으로 접시에 부착됩니다. 조직 생존성이 낮거나 5일 이내에 세포 이동이 관찰되지 않으면 20% 혈청을 보충한 완전 α-MEM으로 전환합니다.
8. 세포 통과 시에는 세포가 80–90% 합류율에 도달하면 잔류 배지를 제거하기 위해 5mL의 PBS로 세척했습니다. 이후 0.25% 트립신-1 mM EDTA 2mL와 37°C에서 2분간 배양하였습니다( 재료표 참조).
   참고: 트립신-EDTA는 자극제이며 피부와 눈을 손상시킬 수 있습니다. 장갑과 안구 보호구를 착용하고, 물보라와 에어로졸 형성을 피하며, 접촉이 발생하면 즉시 충분한 물로 씻어내세요. 트립신 함유 액체 폐기물은 기관 지침에 따라 처리해야 합니다.
9. 세포가 현미경으로 둥글어져 세포 간 접합부가 파손되면 과도한 구조적 손상 없이 부드럽게 접시에서 세포를 분리합니다. 완전 α-MEM 4mL를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다.
10. 세포를 부드럽고 반복적으로 피펫팅하여 신선한 15mL 원심분리관에 채취합니다. 100 × g 에서 5분간 원심분리한 후, 상원액을 버리고 세포 펠릿을 완전한 α-MEM에 재현탁합니다. 재현탁된 세포를 신선한 배양 접시나 웰 플레이트에 씨를 뿌리세요. 매체는 이틀에 한 번씩 교체하세요.
    참고: 집단 배양에 사용되는 SCAP가 5번째 통과 안에 있는지 확인하세요. 통각 수^30,31이 증가할수록 줄기와 집단 용량이 감소하여 집합 형성 효율과 기능 수행 능력이 저하될 수 있습니다.

2. SCAP 집합체의 자기 조립

1. 수확 3–5 SCAPs는 트립신 처리, 100 × g 에서 5분간 원심분리기, 그리고 10% EV 소 소 혈청(FBS)과 1% P/S를 보충한 α-MEM에 재현탁합니다( 재료표 참조).
   참고: EV 고갈된 FBS는 150,000 g × 4°C에서 밤새 원심분리하여 EV와 기타 불^{순물을 제거}하세요.
2. 헤모사이토미터를 사용해 세포를 세고, 초저부착 24웰 플레이트에 웰당 ×10개⁵ 개의 세포를 시드합니다. 매질 부피를 우물당 500 μL로 조절하여 현탁 상태를 유지하세요.
3. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂와 함께 72시간 배양하고, 배양지를 48시간마다 교체합니다.
4. 매일같이 역광학 현미경으로 골재 형성 상태를 모니터링하세요. 집합체가 직경 200–400 μm에 도달하고 조밀하고 매끄러운 가장자리 구조를 보일 때 EV를 수집하세요.
   참고: 하나의 생산 "배치"를 같은 날 같은 세포 통과에서 씨앗을 받은 SCAP 골집체에서 추출한 풀링 배지에서 분리된 LEVs로, 단일 채집 창(72시간) 내에 동일한 배양 조건에서 유지된 LEV로 정의합니다. 각 배치는 원심분리를 통해 독립적으로 가공합니다. 씨앗 후 48시간에 배양지를 교체하고 같은 양의 신선한 배지를 보충하세요. LEV 생산의 경우, 파종 후 48시간과 72시간에 각각 조절된 배지를 수집하고, 수확된 배지를 한 배치(0–48시간 분획, 48–72시간 분획)를 한 배치로 모으세요. 냉각된 배지를 4 °C로 유지하고 LEV 분리를 위해 처리합니다.

3. SCAP 집합체에서 EV의 분리 및 특성 분석

1. 대형 LEV 격리를 위한 차동 원심분리
   1. SCAP 응집체가 포함된 배양지를 15mL 원심분리관에 수집합니다.
   2. 800 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 온전한 골집과 큰 세포 이물질을 제거합니다.
   3. 상원액을 새로운 15 mL 튜브로 옮기고 2,500 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리하여 잔여 혈소판과 작은 세포 조각을 제거합니다.
   4. 상원액을 멸균된 1.5mL 원뿔관에 조심스럽게 옮기고, 16,800 × g 에서 4°C에서 30분간 원심분리하여 LEV를 펠릿으로 만듭니다.
      참고: LEV 수율을 높이기 위해 1.5 mL 원뿔 튜브를 사용하세요.
   5. 상청액을 버리고 펠릿을 1mL의 무균 PBS에 재현탁한 후, 고정각 로터(표준 벤치탑 원심분리기 사용 가능)를 사용해 4°C에서 16,800 × g 에서 30분간 원심분리하여 LEV를 펠릿으로 만듭니다.
   6. 감속/브레이크를 '느리게' 또는 '낮게' 설정(일반적으로 브레이크 레벨 1 또는 2)으로 설정하여 최종 감속 단계에서 LEV 펠릿이 재현각되는 것을 방지합니다.
   7. 상청액을 버리고 최종 LEV 펠릿을 멸균 PBS 50 μL에 재현탁합니다. 현탁액은 즉시 사용하시거나(24시간 이내) 또는 4 °C에서 보관하세요. 생체 활성 손실을 최소화하기 위해 냉동을 피하세요.
      참고: 일반적인 하류 실험에 충분한 LEV를 확보하기 위해 약 80개의 골재 우물을 준비하십시오. LEV 샘플은 장기 보관보다는 즉각적인 특성 분석이나 치료적 적용을 위해 권장됩니다. 더 긴 저장이 필요하다면, 반복적인 온도 변화와 동결-해동 사이클을 방지하기 위해 LEV 현탁(예: 튜브당 5–10 μL)을 분리하여 보관합니다. 드라이아이스 위에 급동식 얼리코트를 만들어 −80 °C에서 단기 장기간 보관(예: 최대 1–3개월)으로 보관합니다. 얼음 위에 한 번 해동한 후 바로 사용하세요. 냉동은 생체 활성을 감소시키고 입자 회수/크기 분포에 변화를 줄 수 있음을 유의하세요; 따라서 가능하다면 신선하게 준비된 LEV를 사용하여 기능적 연구를 수행하십시오. 보관 후 품질 관리를 위해 입자 농도와 크기 분포를 NTA를 사용해 재측정하고, 값이 미리 정의된 수용 범위 내에 있을 때만 진행하세요. 또한, 이 프로토콜에서는 단백질 기반 검사법인 BCA와 관련된 소포 손실을 방지하기 위해 NTA 입자 농도를 주요 정량 방법으로 사용하여 후속 적용에서 수확량을 극대화합니다.
2. 입자 크기와 농도에 대한 NTA
   참고: NTA는 크기, 분포, 입자 농도를 평가하기 위해 상용 나노입자 추적 분석기(재료 표 참조)를 사용하여 수행됩니다.
   1. LEVs 현탁액 1 μL(섹션 3.1, 6단계)을 멸균 1.5 mL 원뿔 튜브 내 멸균 PBS 1,499 μL에 희석하여 충분히 혼합합니다.
   2. 호환 소프트웨어를 실행하고 샘플 셀에 초순수 10mL를 채웁니다. 시스템이 깨끗한지 확인하려면 프레임당 배경 입자 수가 < 10개인지 확인하세요(재료 표 참조).
   3. 준비된 표준 용액으로 기기를 보정하세요. 소프트웨어 매개변수를 감도 70, 셔터 70, 최소 영역 5, 최소 밝기 20으로 설정하세요. "자동 정렬"을 수행하여 레이저가 초점을 맞췄는지 확인하세요. 표준 희석도를 소프트웨어에 표시된 입자 수가 50–400(가능하면 ~200)이 될 때까지 조정한 후 보정 프로그램을 실행하세요.
      참고: 표준 용액은 1 mL의 증류수에 1 μL 보정 구슬을 재구성하여 1차 용액을 만듭니다. 1차 용액 100 μL을 증류수 25mL에 희석(1:250,000 희석)하여 4 °C에서 최대 1주일간 보관합니다.
   4. 분석 전에 샘플 셀을 5mL 증류수로 헹구세요.
   5. 채널을 1mL의 증류수로 세척하고 검출 인터페이스의 입자 수가 <10인지 확인하세요.
   6. 희석된 LEV 샘플 1mL를 멸균 1mL 주사기를 사용하여 0.5 mL/s의 일정 속도로 주입합니다.
      주의: 주사기를 수동으로 조작하여 안정적인 주사 속도를 유지하세요.
   7. 입자 분석을 수행하고 보고서를 생성하세요. 소프트웨어에서 새 측정값을 만들고 크기/농도 모드를 선택하세요. 획득을 3단계와 동일한 검출 매개변수(감도 70, 셔터 70, 최소 영역 5, 최소 밝기 20)를 사용해 25 °C에서 3번의 녹화, 각 녹화당 60초로 설정하세요.
   8. 획득을 시작하고 화면 내 입자 수가 프레임당 50–400 입자(가능하면 ~200) 이내로 유지되는지 확인하세요; 이 범위를 벗어나면 샘플 희석도를 정지하고 조정한 후 6단계를 반복합니다. 획득 후 평균 크기, 모드 크기, D10/D50/D90, 입자 농도(입자/mL)를 분석합니다. 그 후 결과 및 크기 분포 그래프를 .csv 및 .pdf(또는 이에 상응하는 보고서 형식)로 내보내고, 측정 파일을 기록용으로 저장하세요.

4. 하악골 재생에서 LEV의 치료적 적용

1. LEV 가중 하이드로겔의 제제
   1. 플루로닉 F-127 스톡(20% w/v)을 준비하세요. Pluronic F-127 분말을 멸균된 PBS에 최종 농도인 20%(w/v)로 첨가한 후, 4°C에서 하룻밤 동안 완전히 용해되고 균질해질 때까지 저어줍니다( 재료표 참조). 조기 겔화를 방지하기 위해 준비 내내 용액을 4 °C로 유지하세요.
      참고: 20% (w/v) 플루로닉 F-127은 4 °C에서 액체이며, ~20–25 °C에서 열겔화를 일으킵니다(튜브/방에 따라 다르며); 37 °C에서 안정적인 겔이 됩니다.
   2. 추운 조건에서 LEV를 적재하세요. 튜브, 피펫 팁, 하이드로겔을 4°C까지 미리 냉각하세요. 50 μg LEV(24웰 골재판 두 장에서 LEV와 동등한 용량)와 1mL 20% 플루로닉 F 127을 부드러운 피펫팅과 짧은 저속 소용돌이 처리로 혼합하여 균일한 분포를 보장합니다. 착상할 때까지 얼음 위나 4 °C 온도에서 혼합물을 유지하세요.
   3. 재현성을 위한 취급/사용 안내. 얼음 위에서 빠르게 주사기/팁 장전을 하세요. 혼합물이 ~20–25 °C 이상으로 가열되면 점도가 증가하여 겔화가 시작될 수 있습니다; 이 경우 재료가 완전히 유동성이 될 때까지 4 °C로 되돌려 사용하세요. 결손부에 삽입 후에는 체온(37°C)에서 제자리에서 겔화가 일어나도록 합니다.
2. 마우스 하악골 결손 모델 확립
   1. 8주 된 C57Bl/6 마우스(수컷 또는 암컷)를 펜토바르비탈 나트륨(50 mg/kg) 복막 내 주사로 마취합니다(재료 표 참조).
      주의: 펜토바르비탈 나트륨은 강력한 진정제/마취제이며, 실수로 주입, 섭취 또는 흡입 시 인간에게 독성이 있습니다. 안전한 날카로운 사용법(바늘을 다시 캡하지 않고, 즉시 용기에 버리기), 장갑과 안구 보호구 착용, 피부 접촉 피하기, 기관 통제 약물 정책에 따라 보관/기록 사용. 쥐의 마취가 적절한지 확인하려면 각막 반사가 없는지, 발 패드를 눌렀을 때 팔다리가 철수하지 않는지 확인하세요. 각막 건조를 방지하기 위해 보호용 안과 연고를 바르세요.
   2. 왼쪽 하악부 털을 면도하고 10% 포비돈-요오드와 75% 에탄올로 번갈아 소독하세요.
      주의: 75% 에탄올은 매우 가연성이 높습니다; 점화원에서 떨어진 곳에서 사용하고 좋은 환기를 유지하세요. 포비돈-요오드는 피부/눈 자극이나 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다; 장갑을 끼고, 눈과 점막 접촉을 피하며, 흘린 물은 즉시 청소하세요.
   3. 하악 가장자리를 따라 1cm 길이의 절개를 하고 연조직을 무딘 채로 해부하여 하악각을 노출시킵니다.
   4. 열 손상을 방지하기 위해 치과 드릴과 연속 식염수 관개를 사용해 직경 2mm의 원형 골결손을 만듭니다(재료 표 참조).
      주의: 수술 중 출혈을 면밀히 관찰하고, 작은 솜뭉치로 출혈을 조절하여 수술 부위를 깨끗하게 유지하며 감염 위험을 줄이세요. 드릴로 주변 연조직에 닿지 않도록 엉킴을 방지하세요.
3. LEV 가재 하이드로겔 이식
   1. LEV-하이드로겔 혼합물을 멸균 주사기에 주입하여 뼈 결손부에 주입하여 완전한 충전을 보장합니다.
      참고: 마우스당 1~10 μg LEV를 투여하세요. n=5마리 마우스 실험을 위해 충분한 LEV를 얻으려면 24웰 SCAP 골재판 두 개가 필요합니다.
   2. 대조군의 경우, LEV 없이 같은 부피의 플루로닉 F-127 하이드로겔을 주입합니다.
   3. 절개 부위를 4-0 흡수성 봉합사로 봉합하고, 수술 후 통증을 완화하기 위해 피하 진통제(카프로펜, 5 mg/kg)를 투여합니다(재료 표 참조).
      주의: 카프로펜은 약물적으로 활성 NSAID이며, 실수로 주사하거나 피부/눈에 닿으면 해로울 수 있습니다. 장갑을 착용하고, 날카로운 부상을 피하며, 바늘/주사기는 날카로운 용기에 버리고, 기관 의약품 폐기물 절차에 따라 사용하지 않는 약물과 오염된 물질을 폐기하세요.
   4. 마취에서 회복할 때까지 쥐를 데워밍 담요 위에 올려놓은 후, 음식과 물을 자유롭게 사용할 수 있는 개별 우리로 옮기세요.
      참고: 쥐가 의식을 회복해 흉골 누워 있을 수 있을 때까지 방치하지 마세요. 쥐는 완전히 회복된 후에만 집단 사육장으로 돌려보내세요.

결과

실험 워크플로우에 따르면, SCAP 분리, 집합체 형성, LEV 추출, 치료적 이식 등 주요 단계들이 성공적으로 수행되었습니다(그림 1). 기증자의 임상적 임팩트 3대치는 미성숙 첨단과 개방 근관 주변에 온전한 첨단 유두 조직이 부착되어 SCAP의 적절한 출처를 확인했습니다(그림 2A). 시험관 배양 시, 풍부한 세포 돌기를 가진 방추 모양의 SCAP가 첨단 유두 조직에서 이동해 3일 이내에 점차 합류하여 특징적인 소용돌이 같은 배열을 형성했습니다(그림 2B). 유세포검사 결과, CD90 양성 및 CD45 음성 SCAP 표현형이 확인되었습니다(그림 3A). 자체 갱신 능력은 CFU 설립과 EdU 설립으로 지원되었습니다(

토론

세포 없는 재생 치료에 대한 관심이 높아지면서, 중간엽 줄기세포 유래 LEV는 세포 기반 접근법의 위험 없이 생리활성 분자를 전달할 수 있는 능력 덕분에 전세포 이식의 유망한 대안으로 자리매김하고 있습니다. 그러나 LEV 기반 치료의 임상 번역은 LEV 기능을 완전히 보존하고 향상시킬 수 있는 생리학적으로 적합한 배양 시스템의 부재로 인해 제약을 받고 있습니다. 기존의 2D 단일층 배양은 생체 내 중간엽 줄기세포 기능을 지원하는 원래의 미세환경과 크게 다르며, 재생 가능성이 제한된 LEV를 낳는다^18,24. 이 한계를 해결하기 위해 자체 조립된 3D SCAP 집합체를 기반으로 한 프로토콜을 개발하여, LEV 수율을 높일 뿐만 아니라 임상 맥락에서의 기능적 관련성을 높이는 표준화되고 확장 가능한 워크플로우를 구축했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
바늘이 달린 1mL 주사기	BD	300841	마취
10cm 세포 배양 접시	코닝	353003	세포 배양
15 mL 폴리스티렌 원심분리관	코닝	352095	세포 배양
75% 에탄올 소독제	하이 시 하이 누오	HS-750	운행
흡수성 봉합사 4-0	진환 메디컬	R413	운행
벤치탑 원심분리기	위겐스	CE187	EV 절연
CO2 인큐베이터, 150리터, 범용 타입	서모피셔	51032874	세포 배양
콜라게나제형 I	서모피셔	17100017	세포 배양
코튼 볼	디로열	30-033	운행
곡선 작동 가위	JZ 외과 기구	J21040	운행
치과용 이동식 터빈 유닛	카보	S609C	운행
전자 저울	지커	ZK-DST	세포 배양
에펜도르프 튜브	에펜도르프	3810X	EV 절연
겸자, 괜찮아	JZ 외과 기구	JD1020	운행
제모 크림	베트	1.00097E+11	운행
고속 볼 버	덴츠플리 시로나	E0123	운행
고속 핸드피스	카보	KV-1-008-1644	운행
역현미경	Mshot	MF53-N	세포 배양
MEM 및 알파; (최소 필수 미디엄 & 알파;)	서모피셔	12561056	세포 배양
나노입자 추적 비디오 현미경 PMX-120	입자 메트릭스	제타뷰 PMX120	나노입자 추적 분석
페니실린-스트렙토마이신 (P/S)	서모피셔	15140122	세포 배양
펜토바르비탈 나트륨	시그마-올드리치	57-33-0	마취
인산염 완충 식염수(PBS)	서모피셔	10010023	세포 배양
플루로닉 F-127	시그마-올드리치	P2443	EV 이식
포비돈 요오드 용액	백스터와 nbsp;	PROSL500	운행
특수 태아 소 혈청 (FBS)	서모피셔	12664025	세포 배양
멸균 거즈 블록	우승	10-000-681	운행
탁상형 고속 마이크로 원심분리기	히타치	CT15E	EV 절연
트레핀 드릴	바이오멧 미세고정	01-9182	운행
트립신-EDTA	서모피셔	25200072	세포 배양
초저형 부착 24-웰 플레이트	코닝	3473	세포 배양
보텍스 믹서 지니	과학 산업	SI0425	EV 이식