방법 논문

네트워크 약리학과 통합된 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS를 이용한 IgA 신병증에 대한 Yiqi Qingjie 공식의 물질적 근거 규명

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DOI:

10.3791/70541

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2026년 5월 19일

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 초고성능 액체 크로마토그래피와 하이브리드 쿼드러폴-오비트랩 고해상도 질량분석법(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)을 결합하여 네트워크 약리학 및 분자 도킹을 결합하여 IgA 신병증(IgAN) 치료를 위한 Yiqi Qingjie 공식(YQQJ)의 물질적 기반을 예측하고 검증하는 방법을 설명합니다.

초록

본 연구는 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS를 사용하여 YQQJ의 수분 추출 및 혈액 흡수 성분을 특성화합니다. 네트워크 약리학과 분자 도킹을 추가로 적용하여 YQQJ가 IgAN에 대해 치료 효과를 미치는 중요한 근거를 예측하고 검증합니다. YQQJ의 수용성 추출물과 혈청 샘플은 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS를 사용해 화학 성분을 특성화하고 혈액 흡수 화합물을 규명하였습니다. 화합물 식별은 참고 데이터베이스, 출판된 문헌, 그리고 보존 시간, 전구체 이온 질량 정확도, MS/MS 분화 패턴, 동위원소 분포에 대한 종합적인 평가를 바탕으로 수행되었습니다. 프로토타입 혈액 흡수 화합물의 잠재적 표적은 표적 예측 데이터베이스를 사용하여 예측했으며, IgAN과 관련된 표적은 통합 생물정보학 플랫폼에서 수집되었습니다. 핵심 목표물은 PPI 네트워크 분석을 통해 선별되었습니다. 주요 성분을 식별하기 위해 '화합물–표적–경로–질병' 네트워크가 구축되었고, 핵심 화합물과 표적 간 상호작용을 평가하기 위해 분자 도킹이 수행되었습니다. YQQJ의 물 추출물에서 총 185개의 화합물이 확인되었습니다. 그중 28종의 화합물이 프로토타입 형태로 혈류에 들어갔다. PPI는 IgAN에서 YQQJ의 치료 효과와 관련된 42개의 핵심 표적을 확인했습니다. KEGG와 GO 농축 분석은 세포 증식, 염증, 세포자멸사에 관여하며, PI3K-Akt, MAPK, JAK-STAT와 같은 여러 주요 경로에서의 농축이 있음을 보여주었습니다. 분자 도킹 분석은 6개의 핵심 표적(CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB, PIK3CA)과 세 가지 주요 혈액 흡수 화합물인 데아세틸라스페룰로시딕산, 제니포시딕산, 디오신 사이에서 결합 에너지가 일관되게 낮은 결합 에너지를 예측하여 잠재적 상호작용을 시사했습니다. 이 통합 분석은 YQQJ가 여러 성분과 여러 표적을 통해 IgAN에 대해 치료 효과를 발휘한다는 것을 밝혀냅니다. 디아세틸라스페룰로시딕산, 제니포시딕산, 디오신이 이러한 효과에 기여하는 주요 활성 성분으로 제안됩니다.

서론

IgA 신병증(IgAN)은 전 세계적으로 가장 흔한 원발성 사구신염 중 하나입니다. 임상 증상은 매우 이질적이며, 일반적으로 미세하거나 대략적인 혈뇨로 나타나고, 다양한 수준의 단백뇨, 고혈압, 신장 기능 장애를 동반합니다. 초기 연구들은 진단 후 20년 이내에 최대 40%의 환자가 신부전으로 진행된다고 제안했으며, 그러나 최근 증거에 따르면 예후가 현저히 낮아져 대부분의 환자가 10년에서 15년 이내에 신부전을 겪고, 소수만이 평생 신장 기능을 유지하며 진행 없이 유지된다는 2,3,4. 표적 치료제가 최근 IgAN 관리에서 임상적 진전을 이루었음에도 불구하고, 높은 비용과 비교적 느린 효능 발현은 여전히 주요 과제이며, 임상적 이익과 위험 균형은 여전히 논쟁 중입니다 5,6.

전통 중의학(TCM)은 복잡한 질병 치료에서 독특한 이점을 보여줍니다. 이 방법은 안정적인 치료 효능, 상대적으로 낮은 부작용 발생률, 그리고 다중 표적 시너지 효과를 특징으로 합니다7. 단일 표적 약리학적 약물과 달리, TCM 조제는 일반적으로 다양한 생물학적 경로를 동시에 조절할 수 있는 여러 생리활성 성분을 포함하고 있습니다. 이러한 다성분 및 다중 표적 작용 기전은 IgAN8과 같은 복잡한 질환 치료에 잠재적인 치료적 이점을 제공합니다. 한의학 이론에서 IgAN은 특정 질병명이 없으며, 일반적으로 '혈뇨', '부종', '요통', '신장풍', '결핵성질환'으로 분류됩니다. 대부분의 학자들은 그 핵심 병인을 폐비장 기 결핍으로 간주하며, 이는 방어적 기 조절 상실로 이어지고, 바람, 습기, 열, 독소의 침입으로 이어져 궁극적으로 신장에 손상을 준다고 본다. 신장이 주요 관여 기관이지만, 심장, 간, 비장, 폐도 영향을 받을 수 있습니다. 9. 이러한 이해를 바탕으로 수많은 연구가 IgAN10,11의 임상 치료를 위해 기강화, 외부 응고, 열 제거, 해독, 습기 해소 특성을 가진 한방 약물과 처방을 규명하는 데 집중되었습니다.

Yiqi Qingjie Formula(YQQJ)는 저희 병원 신장학과에서 Igan 치료를 위해 사용되는 효과적인 경험적 처방입니다. 이 조제법은 황기(황기), 일본의 흰 나무(Jinyinhua), 흰 팔마탐 L.(다황), 백나무 흰나무(Baihuasheshecao), 디오스코레아 니포니카 마키노(Zhuanshanlong), 스파톨로부스 수베렉투스 던(Jixueteng), 플랜타고 아시아티카 L. 등 일곱 가지 허브로 구성되어 있습니다. (체키안차오). YQQJ는 기(氣)를 강화하고, 외부를 고집하며, 열을 정화하고, 해독하며, 혈액순환을 활성화하고, 이뇨 촉진 등의 치료 기능을수행합니다. 임상 연구들은 YQQJ가 IgAN 환자의 단백뇨와 혈뇨를 유의미하게 감소시키고, 신장 기능을 개선하며, 점막 면역 관련 증상을 완화시키며, 안전성 프로필도 긍정적으로 보임을 입증했습니다12,13.

이 공식은 임상 효능이 긍정적임을 입증했지만, TCM 제형에는 다양한 화학 성분이 포함되어 있어 약리학적 활성 물질의 근거는 여전히 밝히기 어렵습니다. 크로마토그래피 또는 질량분석법 분석만을 기반으로 한 화학 프로파일링은 조성의 전체 화학 조성을 밝혀낼 수 있습니다; 그러나 어떤 화합물이 전신 순환계에 흡수되어 치료 효과에 직접적으로 기여하는지 규명할 수는 없다14. 또한, 기존 네트워크 약리학 연구는 주로 데이터베이스 기반 예측에 의존하며, 경구 생체이용률과 약물 유사성 같은 매개변수를 이용해 후보 화합물을 선별합니다. 이 접근법은 실제로 생체 내에서 약리학적 활성을 발휘하는 화합물을 간과할 수있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 최근 연구들은 초고성능 액체 크로마토그래피와 하이브리드 쿼드러폴-오비트랩 고해상도 질량분석법(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), 혈청 약리화학 및 시스템 약리학을 결합한 통합 분석 전략을 TCM 연구에서 점점 더 채택하고 있습니다16,17. 혈청 약리화학은 투여 후 전신 순환에 진입하는 화합물을 식별하여, 잠재적 생리활성 성분을 선별하는 데 약물동학적으로 중요한 증거를 제공합니다18. 한편, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS는 복잡한 허브 매트릭스 내 화학 성분의 매우 정확한 검출과 구조적 특성 분석을 가능하게 합니다.

화학 프로파일링이나 이론적 표적 예측에만 의존하는 접근법과 비교할 때, 이 연구에서 적용된 통합 워크플로우는 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 기반 구성 요소 식별, 혈청 약리화학 스크리닝, 네트워크 약리학 분석, 분자 도킹 검증을 포함해 여러 방법론적 이점을 제공합니다. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS는 복잡한 화학 성분의 포괄적이고 정확한 식별을 가능하게 합니다. 혈청 약리화학은 후보 화합물을 실제로 전신 순환에 흡수되는 화합물로 제한하여 이후 네트워크 분석의 생물학적 타당성을 높입니다. 실험적으로 확인된 흡수 화합물을 기반으로 한 네트워크 약리학 분석은 다중 표적 메커니즘을 시스템 단위로 탐구할 수 있게 하며, TCM 공식의 전체론적 약리학적 특성을 더 잘 반영합니다. 분자 도킹은 예측된 화합물-표적 상호작용의 예비 계산 검증을 제공하며, 이후 실험적 검증을 위한 후보 분자의 합리적 우선순위 지정을 지원합니다. 이 통합 워크플로우는 YQQJ와 같은 복잡한 한방 조제법의 물질적 기초와 메커니즘을 밝히는 신뢰할 수 있고 효율적이며 생리학적으로 적합한 전략을 제공합니다.

이 워크플로우는 동물 또는 인간 약물동학 연구에서 생체 내 흡수 데이터를 얻을 수 있을 때, 복잡한 한방 제형의 약리학적 활성 물질 기초와 메커니즘을 조사하는 데 특히 적합합니다. 특히 임상 효능이 확립되었으나 활성 성분이 명확하지 않은 조제에 적용됩니다. 그럼에도 불구하고 몇 가지 한계점이 인정되어야 합니다. 첫째, 목표 예측의 정확도는 공개 데이터베이스의 품질과 완전성에 달려 있습니다. 둘째, 워크플로우는 순환 중 검출된 프로토타입 화합물에 초점을 맞추며, 생체 내에서 생성된 생체 활성 대사산물은 고려하지 않습니다. 셋째, 네트워크 약리학 분석에서 도출된 예측은 추가적인 실험적 검증이 필요합니다. 이러한 한계에도 불구하고, 이 워크플로우는 TCM 공식의 기전적 연구에서 가설 생성과 표적 우선순위 지정에 효율적이고 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.

따라서 본 연구는 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS를 사용하여 YQQJ의 수용성 추출물 성분과 순환 화합물을 체계적으로 특성화하여 잠재적 활성 성분에 대한 비교적 포괄적인 데이터베이스를 구축합니다. 이 데이터셋을 바탕으로 네트워크 약리학 분석과 분자 도킹 검증을 결합하여 IgAN 치료에 YQQJ의 잠재적 약리학적 활성 성분을 예측하고, 이후 기전 연구의 기초를 제공합니다.

프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 중국 동물복지위원회가 발행한 실험동물 관리 및 사용 지침을 준수하였습니다. 본 연구의 모든 절차는 광안먼 병원 동물실험센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 동물 및 약물 관리

  1. 6주 된 수컷 Sprague–Dawley(SD) 쥐 12마리, 무게 200–230g을 사용하세요.
  2. 모든 동물은 실험동물 센터에 보관됩니다.
    참고: 주거 온도는 20–26 °C, 상대 습도는 40–70% 유지하세요. 12시간/12시간의 밝고 어둠 주기를 사용해 자연스러운 생체 리듬을 시뮬레이션하세요.
  3. 실험 전에 동물을 7일간 표준 조건에서 자유롭게 먹이와 물을 섭취할 수 있도록 적응시키세요. 쥐를 무작위로 두 그룹(n=6개)으로 나누는데, 대조군과 약물 치료 그룹입니다.
  4. 인간과 동물 간 체면적에 따른 등가 용량을 참고하세요20. 약물 치료 그룹에 경구 개비지(24.68 mL/(kg·day)의 YQQJ 농축 추출물을 투여합니다. 동기화된 처리를 위해 대조군에 동등한 양의 증류수를 동시에 투여합니다.
  5. 투여를 하루 동안 계속하세요. 총 하루 용량을 세 번의 균등한 투여(예: 08:00, 13:00, 18:00)로 나누어 1일 이내에 완전한 용량을 섭취하도록 하세요.
    참고: 마지막 가베지 전 12시간 동안 단식하며, 물은 자유롭게 사용할 수 있습니다.
  6. 최종 투여 후 2시간과 8시간에 혈액 샘플을 채취하세요. 쥐에게 복막 내 1% 펜토바르비탈나트륨(50mg/kg) 주사를 투여하여 마취합니다. 복부 대동맥에서 혈액을 채취하세요.
  7. 혈액 샘플을 실온에 1시간 세운 후, 450 × g에서 4°C에서 5 분간 원 심분리합니다. 상정액(혈청)이 투명하고 용혈이 없는지 확인하세요. 상청액 혈청을 옮겨 –80 °C에서 보관하여 추가 분석을 마칩니다.

2. 해의 준비

  1. 시험 용액 준비
    1. YQQJ의 모든 조잡한 약초를 공식에 따라 수집하세요. 정제된 물 4부피를 증빙 냄비에 넣고 20분간 담가세요.
      참고: 허브에는 정제수가 4:1(v/w) 비율로 첨가되었습니다.
    2. 혼합물을 끓인 후 약한 불에서 30분간 다시 구제합니다. 거즈로 걸러서 여과액을 수집하세요. 잔여물을 4부피의 물로 다시 30분 더 증액한 후 다시 여과하세요.
    3. 두 여과물을 합치세요. 60 °C의 수조 온도에서 회전식 증발기를 사용해 혼합 용액을 농축하여 3 g/mL(w/v, 조잡한 약용 물질에 해당)의 농도에 도달합니다.
    4. 농축된 추출물이 눈에 띄는 침전물이 없는 어둡고 점성이 있는 액체인지 확인하세요. 나중에 사용하기 위해 4°C에서 보관하세요.
  2. 기준 해의 준비
    1. 다음 참조 화합물의 정확한 계량: 디아세틸라스페룰로시딕산, 제니포시딕산, 로가닉산, 모로니사이드, 클로로겐산, 스웨로사이드, 플랜타고구아니딘산, 라인-8-O-β-D-글루코피라노사이드, 제니스틴, 아피게닌-7-글루코사이드, 디오스메틴-7-O-β-D-글루코피라노사이드, 칼리코신, 프로토디오신, 제니스타인, 디오스메틴, 의사프로필토디오신, 포르모네틴, 3-하이드록시-9,10-디메톡시프터카르판, 알로이모딘, 라인, 디오신.
    2. 각 화합물을 메탄올에 녹인 후 혼합물을 1분간 소용돌이로 처리한 후, 상온에서 10분간 초음파 처리하여 완전히 용해되도록 합니다.
    3. 각 용액을 메탄올로 희석하여 각 표준체별로 최종 농도인 10 μg/mL에 도달합니다.

3. 샘플 준비

  1. YQQJ 추출물 샘플의 제제
    1. YQQJ 수용 추출물 100 μL 피펫을 1.5 mL 원심분리관에 넣습니다. 메탄올 300μL를 추가하고 1분간 소용돌이를 돌립니다. 원심분리기 온도는 1800 × g, 4 °C에서 10분간 진행됩니다. 결과된 상원액이 투명하고 부유 입자가 없는지 확인하세요.
    2. 상청액 100 μL을 100 μL 초순수수와 섞어 1:1 희석을 만듭니다. 부드럽게 소용돌이를 보내고 오토샘플러 바이알로 옮겨 분석하세요.
  2. 약물 함유 혈청 샘플의 제조
    1. 1.5 mL 원심분리관에 혈청 100 μL을 피펫 주입합니다. 메탄올 300 μL을 추가하고 10분간 소용돌이를 통해 단백질 침전을 보장합니다. 원심분리기 온도는 1800 ×, 4 °C에서 10분간 진행.
    2. 상정액 270 μL를 채취하여 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 진공 원심 농련기를 120 × g, 37 °C에서 4시간 동안 증발시켜 고체 잔류물이 형성될 때까지 가열합니다.
    3. 잔류물을 50% 메탄올 수용액 90μL로 재구성합니다. 잔여물을 완전히 녹이기 위해 1분간 소용돌이를 사용한 후, 다시 1800 × g, 4 °C에서 10분간 원심분리합니다.
    4. 최종 투명 상청액 80 μL을 채취하여 분석을 위해 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.

4. 해석적 조건

  1. 크로마토그래피 조건
    1. 크로마토그래피 컬럼이 장착된 UHPLC 시스템을 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행합니다.
    2. 이진 이동상(상A: 0.1% 개미산이 함유된 물; B상: 아세토니트릴). 표 1에 나타난 것처럼 0.3 mL/min의 유량으로 구배 용출 프로그램을 적용합니다. 컬럼 온도를 40 °C, 주입 부피를 6.0 μL로 설정합니다.
      참고: 컬럼 사양은 2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm 입자 치수입니다.
  2. MS 질환
    1. 가열 전기분무 이온화(HESI) 분사 프로브가 장착된 쿼드러폴-오비트랩 질량분석기를 사용하여 시료를 분석합니다.
    2. 매개변수를 다음과 같이 설정: 이온화 전압: 3.7 kV (양극 모드) / 3.5 kV (음극 모드); 모세혈관 온도: 320 °C; 칼집 가스 압력: 30 psi; 보조 가스 압력: 10 psi; 용해수 온도: 300 °C; 피복 가스와 보조 가스인 질소; 충돌 가스: 질소, 1.5 mTorr.
    3. 풀 스캔/dd-MS2 모드에서 데이터를 획득하세요. 전체 스캔 매개변수는 다음과 같이 설정: 해상도 70000, 자동 게인 제어 타겟 1×106, 최대 격리 시간 50ms, m/z 스캔 범위 100 – 1500.
    4. dd-MS2 데이터를 수집하는데, 해상도 17500, 자동 이득 제어 타겟 1×105, 최대 격리 시간 50 ms, 파편화를 위한 가장 강한 모 이온 선택(최대 n≤10) 및 동적 배제 메커니즘, 격리 창 m/z 2, 충돌 에너지 10 V, 30 V, 60 V, 강도 임계치 1×105.

5. MS 데이터 처리

  1. 수집된 MS 데이터는 전문 데이터 처리 소프트웨어를 사용하여 처리합니다. 데이터 가져오기 모듈로 이동해 원시 데이터 파일을 업로드하세요.
  2. 피크 피킹 모듈을 실행하고 피크 디컨볼루션을 수행하여 부가 이온을 그룹화하고 복합 특징을 생성합니다.
  3. 후보 화합물 식별을 위해 참고 화합물 데이터베이스, 표적 예측 데이터베이스, 관련 출판 문헌을 검색하세요.
  4. 고해상도 MS 데이터를 기반으로 한 두 가지 상호 보보적인 식별 전략을 사용하여 화합물을 식별합니다.
    1. 참조 표준 일치를 기반으로 식별합니다. 진짜 기준과 비교하여 화합물을 확인하세요. 다음 모든 기준이 충족될 때만 식별을 수락합니다:
      1. 질량 정확도: 전구체 이온과 조각 이온의 질량 오차는 ± ppm 이내여야 합니다.
      2. 스펙트럼 유사성: 실험용 MS/MS 스펙트럼과 기준 표준의 MS/MS 스펙트럼 간의 코사인 유사도 점수는 ≥ 0.85여야 합니다.
      3. 동위원소 분포: 동위원소 패턴 매칭 점수는 ≥ 90%여야 합니다.
      4. 크로마토그래피 거동: 검출된 화합물과 기준 표준 사이의 보존 시간 편차는 0.2분< 되어야 합니다.
        참고: 위의 모든 기준을 충족하는 화합물은 MSI 레벨 1로 주석이 달려 있으며, 이는 구조 식별이 확인되었음을 나타냅니다.
    2. 고해상도 MS 데이터와 실리코 스펙트럼 예측을 기반으로 한 식별. 참조 표준이 없는 화합물의 경우, 정확한 질량 측정과 계산적 스펙트럼 예측을 기반으로 추정 식별을 수행합니다. 다음 기준이 충족될 때만 주석을 허용합니다:
      1. 질량 정확도: 전구체 이온의 질량 오차는 ±5 ppm 이내여야 하며, 조각 이온의 질량 오차는 ±10 ppm 이내여야 합니다.
      2. 스펙트럼 유사성: 실험 MS/MS 스펙트럼과 Progenesis QI 알고리즘을 사용해 복합 SMILES 구조에서 생성된 이론적 MS/MS 스펙트럼을 비교합니다. 코사인 유사도 점수가 0.60인 매칭을 ≥ 받아.
      3. 동위원소 분포: 동위원소 패턴 매칭 점수는 ≥ 90%여야 합니다.
      4. 크로마토그래피 거동 예측: 실험 보존 시간과 머신러닝 예측 보존 시간 간의 차이는 1.0분< 되어야 합니다.
        참고: 보존 시간 예측 모델은 동일한 크로마토그래피 조건에서 분석된 2000개 이상의 참조 화합물에서 실험적 크로마토그래피 데이터를 사용하여 학습되었습니다. 이 기준을 충족하는 화합물은 MSI 레벨 2로 주석이 달려, 구조적 신뢰도를 높인 것으로 추정되는 화합물을 나타냅니다.

6. 네트워크 약리학

  1. 혈액 흡수 성분 및 IgAN과 관련된 표적 식별
    1. YQQJ의 프로토타입 혈액 흡수 성분을 표적 예측 데이터베이스에 가져오세요. "호모 사피엔스"를 목표 종으로 선택하고 잠재적 표적을 얻으세요. 이들을 YQQJ의 혈액 흡수 화합물 표적 집합으로 기록하세요.
    2. "IgA Nephropathy" 키워드를 사용하여 통합 생물정보학 플랫폼에서 IgAn 관련 질병 표적을 검색하세요. 여러 출처의 결과를 통합하여 편향을 최소화하세요.
      참고: 일관성을 위해 모든 추출된 표적을 유전자 심볼 형식으로 변환하려면 단백질 데이터베이스를 사용하세요.
  2. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축 및 핵심 표적 식별
    1. YQQJ 혈액 흡수 화합물 표적 집합과 IgAN 질병 표적 집합을 병합하여 그 교차점을 추출합니다.
    2. 교차하는 표적을 PPI 플랫폼21에 업로드하세요. 설정을 설정하세요: 생물을 호모 사피엔스로 설정하고, 신뢰도는 0.90으로 설정하며, 모든 분리된 노드를 버리세요.
    3. PPI 데이터를시각화 소프트웨어로 가져오세요. 위상 분석 플러그인을 실행하세요. 정도 중심성(DC)23, 간간중심성(BC)24, 근접성(CC)25를 계산합니다.
    4. 위상 매개변수값(DC, BC, CC)이 중앙값을 초과하는 노드를 필터링하여 YQQJ의 핵심 치료 표적을 IgAN에 대해 선별합니다.
  3. "YQQJ–혈액 흡수 성분–표적–경로–질병" 통합 네트워크의 구축 및 분석
    1. node 속성 파일을 준비하세요: 두 개의 열로 구성된 스프레드시트를 만듭니다. 첫 번째 열에는 노드 이름 , 두 번째 열에는 노드 타입을 명명하세요. 각 노드에 다섯 가지 범주(공식, 혈액 흡수 성분, 교차 표적, 경로, 질병) 중 하나를 할당하세요.
    2. 네트워크 상호작용(엣지) 파일 준비: 노드 간 연결을 정의하는 스프레드시트를 만드세요(예: 혈액 흡수 성분과 교차 목표 연결). 매핑 오류를 피하려면 모든 노드 이름이 노드 속성 파일의 이름과 일치하는지 확인하세요.
    3. 네트워크 가져오기 및 구축: 네트워크 시각화 소프트웨어를 실행하세요. 파일 > 네트워크에서 가져오기 로 이동> 엣지 파일을 불러오세요. 미리보기 창에서 열을 소스 노드 와 대상 노드 로 매핑한 후 확인 버튼을 눌러 초기 그래프를 생성합니다.
    4. 맵 노드 속성 및 세트 비주얼 스타일: 노드 속성 파일을 파일 > Import > Table을 통해 가져오세요. 스타일 패널을 열고 노드 타입 열을 노드 모양, 채우기 색상, 크기 등 특정 시각적 속성에 매핑하세요.
    5. 위상 분석 실행: 네트워크 분석 도구를 > 탐색 하여 위상 계산을 수행하세요. 단계 값을 기준으로 핵심 활성 화합물과 주요 치료 목표를 필터링하고 식별합니다.
      참고: 코어 노드 식별의 일관성을 보장하기 위해 6.2단계에서 설명한 동일한 위상 파라미터를 사용하세요.
    6. 네트워크 이미지 내보내기: 네트워크 레이아웃을 최종 확정하세요. 최적화된 시각화를 저장하려면 파일 > 네트워크> 이미지 로 내보내기로 이동하세요.
  4. GO 농축 및 KEGG 경로 분석
    1. 유전자 목록을 제출하세요: 웹 기반 함수 주석 플랫폼을 엽니다. Step 1: 유전자 목록 제출 영역으로 이동하여 이전에 필터링된 핵심 대상 유전자 목록26을 업로드하세요.
    2. 종 선택: 2단계: 종으로서 입력 , 3단계: 종으로서 분석의 드롭다운 메뉴에서 H . sapiens. (인간)를 선택하여 분석이 올바른 생물학적 맥락에서 수행되는지 확인하세요.
    3. 사용자 지정 분석 설정: 사용자 지정 분석 모드를 선택하세요. 풍부화 카테고리에서는 다음 데이터베이스를 확인하세요: 유전자 온톨로지(GO) 분자 기능(MF), GO 생물학적 과정(BP), GO 세포 구성 요소(CC), 그리고 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로.
    4. 유의성 임계값을 설정하세요: P값 컷오프를 < 0.01, 최소 풍부도를 ≥ 1.5, 최소 중복을 ≥ 3으로 설정하세요. 다른 모든 매개변수는 기본 설정으로 유지하세요.
    5. 분석 실행: 풍부 분석 버튼을 클릭하여 작업을 제출하고 계산이 완료될 때까지 기다리세요.
    6. 결과 조회 및 내보내기: 생성된 분석 보고서 페이지에 접속하세요. 다운로드 버튼을 클릭하면 상세한 농축 데이터를 스프레드시트 형식으로 내보내고, 해당 막대 차트와 히트맵도 함께 내보낼 수 있습니다.

7. 분자 도킹 검증

  1. 구조생물학 데이터베이스에서 코어 표적의 고해상도(< 2.50 Å) 3D 단백질 구조와 코어 혈액 흡수 성분의 2D 화학 구조를 다운로드하세요.
  2. 분자 도킹 소프트웨어를 실행하고 다운로드한 구조물을 가져오세요.
  3. 다음 전처리 단계를 순차적으로 실행하세요: 편집 탐색 > 물 분자 제거; 비표준 잔기물을 버리려면 편집 > 헤테로원자 제거 를 선택하세요.
  4. 극성 수소 원자를 추가하려면 > 수소 편집> 극성 전용> 추가 하세요. 처리된 구조를 파일 > 저장 > 쓰기 PDBQT를 통해 PDBQT 형식으로 저장하세요.
  5. Grid > Grid Box 도구를 사용해 도킹 지점을 정의하세요. 그리드 박스 크기는 예측된 결합 영역을 완전히 커버하기 위해 적응적으로 조정되었습니다(20–100 Å).
  6. 도킹 매개변수 초기화: 도킹 > 마크로분자를 통해 수용체를 선택> 리지드 파일네임 설정을 한 후 도킹 > 리간드 > 열어. 도킹 매개변수는 다음과 같이 설정되었습니다: 소총 = 32, 에너지 범위 = 3 kcal/mol, 최대 10개의 결합 모드를 유지했습니다. 공동결정화된 리간드를 가진 단백질의 도킹 그리드 박스는 8.0 Å 확장된 리간드 중심체에 위치했으며, 공동결정 리간드가 없는 단백질의 경우 결합 포켓을 DoGSiteScorer를 사용해 약 90% 커버리지를 예측했습니다.
  7. 검색 전략으로 라마르크 유전 알고리즘(LGA)을 선택하세요. 도킹을 통해 시뮬레이션을 실행 > AutoDock을 실행하세요.
  8. 계산된 결합 에너지(도킹 점수)를 바탕으로 결합 친화도를 평가합니다28.
    참고: 결합 에너지가 낮을수록 단백질-리간드 복합체의 생체 활성 예측이 더 강하고 구조적 안정성이 높아집니다. 결합 안정성을 판단하기 위해 일반적으로 ≤ -5.0 kcal/mol의 임계값을 사용합니다.

결과

YQQJ 수용성 추출물 내 성분 분석
YQQJ 수성 추출물의 성분 분석은 프로토콜 4에서 정해진 조건 하에 수행되었습니다. UHPLC-Q-Orbitrap HRMS는 양성 및 음의 이온 풀스캔 모드 모두에서 YQQJ의 수성 추출물을 프로파일링하기 위해 사용되었으며, 얻어진 Base Peak Ion 크로마토그램(BPI)은 그림 1에 나타났습니다. 이를 바탕으로 자체 구축한 화학 성분 데이터베이스와 MS/MS 스펙트럼 특성 분석을 결합하여 수용성 추출물에서 185개의 화합물을 성공적으로 식별할 수 있었으며, 자세한 정보는 보충 표 1에 요약되어 있습니다. 화합물 식별에 사용되는 대표적인 MS/MS 스펙트럼 매칭 및 단편화 패턴은 보충 그림 1에 나와 있습니다. 화합물 분류에 대한 통계 분석 결과, YQQJ에서 플라보노이드와 테르페노이드가 주요 성분으로 94개 화합물을 차지하며 가장 풍부한 비율을 차지했습니다.

YQQJ의 혈액 흡수 성분
생체 내 직접적인 생리활성 물질을 명확히 하기 위해 YQQJ 투여 후 채취한 혈청 샘플을 분석하였습니다. 공백 혈청의 BPI 크로마토그램(그림 2)은 약물 유래 화합물과 내인성 혈청 성분을 구분하기 위해 포함되었습니다. 약물 함유 혈청의 BPI(그림 3)를 바탕으로, 혈류에 흡수된 총 28종의 프로토타입 성분이 확인되었으며, 주로 플라보노이드, 테르페노이드, 스테로이드가 포함됩니다. YQQJ 추출물, 빈 혈청, 약물 함유 혈청에 걸쳐 대표적인 화합물의 추출 이온 크로마토그램(EIC)을 통해 유통 중인 약물 유래 성분의 존재가 확인되었습니다(보충 그림 2). 이 중 10개의 화합물은 Spatholobus suberectus Dunn에서, 7개는 Dioscorea nipponica Makino에서, 7개는 Astragalus membranaceus에서, 6개는 Hedyotis diffusa Willd.에서, 6개는 Lonicera japonica Thunb.에서, 4개는 Plantago asiatica L.에서, 4개는 Rheum palmatum에서 유래했습니다.L., 보충표 1에 요약되어 있다.

IgAN과 관련된 YQQJ의 혈액 흡수 성분 표적 예측
혈류에 유입된 총 28개의 프로토타입 성분이 표적 예측 데이터베이스에 입력되어 459개의 잠재적 표적이 산출되었습니다. 한편, 통합 생물정보학 플랫폼에서 2779개의 IgAN 관련 표적이 회수되었습니다. 교차 분석에서 YQQJ와 IgAN 사이에 247개의 중복 표적이 확인되었습니다(그림 4).

PPI 네트워크의 구축 및 분석
247개의 교차하는 타겟이 PPI 플랫폼에 업로드되었고, 시각화 소프트웨어를 활용해 DC, BC, CC의 세 가지 위상 파라미터를 기반으로 코어 타겟을 스크리닝했습니다. 총 42개의 목표가 최종적으로 핵심 노드로 확인되었습니다. 이 핵심 목표들을 선별하는 데 사용되는 워크플로우는 보충 그림 3에 요약되어 있습니다. PPI 네트워크에서는 노드 크기와 색상이 매개변수 값에 따라 달라졌으며(그림 5), TP53, SRC, AKT1, ESR1, STAT3가 상위 5개 핵심 타깃 중 하나로 평가되었습니다.

"조제법-혈액 흡수 성분-핵심 표적-경로-질병" YQQJ 네트워크
YQQJ가 IgAN에 대해 가진 다성분 및 다중 표적 메커니즘을 체계적으로 밝히기 위해, 시각화 소프트웨어를 사용해 "공식-혈액 흡수 성분-핵심 표적-경로-질병" 상호작용 네트워크를 구축하였습니다. 네트워크는 96개의 노드와 459개의 엣지로 구성되었으며, 각 엣지는 두 노드 간의 관계 또는 상호작용을 나타냈습니다(그림 6).

GO 및 KEGG 농축 분석
42개 핵심 목표에 대한 GO 농축 분석에서 1162개의 BP 항, 52개의 CC 항, 92개의 MF 항이 발견되었습니다. 그림 7 은 BP, CC, MF 카테고리에서 가장 크게 풍부해진 GO 상위 10개 용어를 보여줍니다. KEGG 농축 분석은 이 핵심 표적과 관련된 182개의 경로를 추가로 확인했습니다. 그림 8 은 IgAN의 발병 기전과 밀접하게 관련된 상위 20개의 유의미하게 농축된 경로를 보여줍니다. 이 차트에서 더 깊은 빨간색은 더 강한 통계적 유의성을 나타내며, 더 큰 거품 크기나 긴 막대 길이는 각 경로 내에서 더 많은 농축된 표적을 나타냅니다.

분자 도킹 평가
본 연구에서는 IgAN 29,30,31,32 치료에서 YQQJ의 주요 표적 및 관련 경로를 분석한 이전 분석을 바탕으로, CASP3(PDB ID: 6X8I), IGF1R(PDB ID: 1JQH), JUN(PDB ID: 8RPP), STAT3(PDB ID: 6NJS), PRKCB(PDB ID: 8SE3), PIK3CA(PDB ID: 5FI4)를 포함한 6개의 핵심 표적이 분자 도킹을 위한 수용체 단백질로 선정되었습니다. IgAN의 핵심 TCM 발병기전인 '신장을 침투하는 병원성 바람, 습기 및 독소'로 정의됨에 대응하여, 열 제거, 습기 제거, 해독 특성을 가진 대표적인 활성 성분들이 리간드로 선정되었는데, Hedyotis diffusa Willd.의 Deacetylasperulosidic acid와 Geniposidic acid, Dioscorea nipponica의 Dioscin이 포함된다. 마키노. 도킹 결과는 그림 9에 나와 있습니다. 모든 리간드-수용체 조합 중에서 디오신은 모든 선택된 표적에서 현저히 낮은 결합 에너지를 보였으며, 이는 더 높은 결합 친화도를 예측할 수 있음을 시사합니다. JUN과 디아세틸라스페룰로시딕산/제니포시딕산 간의 상호작용을 제외하면, 다른 결합 쌍들도 유리한 결합 활성을 보였다. 대표적인 3D 도킹 구조는 그림 10에 시각화되어 있습니다.

figure-results-1
그림 1: YQQJ 수성 추출물의 베이스 피크 이온 크로마토그램. (A) 양성 이온 모드 BPI 크로마토그램. (B) 음이온 모드 BPI 크로마토그램. 크로마토그램은 확립된 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 조건 하에서 YQQJ 수성 추출물의 전체 화학 프로필을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-2
그림 2: 빈 혈청의 베이스 피크 이온 크로마토그램. (A) 양성 이온 모드 BPI 크로마토그램. (B) 음이온 모드 BPI 크로마토그램. 크로마토그램은 약물 유래 성분과 내인성 성분을 구분하기 위해 약물 함유 혈청과 비교하기 위한 대조군으로 사용되는 내인성 혈청 배경 프로필을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-3
그림 3: YQQJ 함유 혈청의 베이스 피크 이온 크로마토그램. (A) 양성 이온 모드 BPI 크로마토그램. (B) 음이온 모드 BPI 크로마토그램. 크로마토그램은 YQQJ 투여 후 혈청에서 검출된 혈액 흡수 성분의 프로필을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: YQQJ와 IgAN의 겹치는 표적들의 벤 다이어그램. 도표는 예측된 YQQJ 표적, IgAN과 관련된 표적 및 이들의 교차점을 보여주며, 치료 효과에 잠재적으로 관여할 수 있는 공유 표적을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-5
그림 5: 핵심 표적의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크. 노드는 단백질 표적을, 엣지는 표적 간 상호작용을 나타냅니다. 노드 크기와 색상 강도는 등급 값에 대응하며, 노드가 크고 어두울수록 네트워크 내 연결성이 높음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6: YQQJ 구성 요소, 표적, 경로 및 질병의 통합 네트워크. 이 네트워크는 공식, 혈액 흡수 성분, 핵심 표적, 경로, 그리고 IgAN 간의 관계를 보여줍니다. 삼각형은 질병을 나타내며; 원은 경로를 나타내며; V자형 노드는 YQQJ 공식을 나타내며; 다이아몬드는 약초를 의미하며; 육각형은 부품을 나타내며; 팔각형은 혈액 흡수 부품의 프로토타입을 나타냅니다; 직사각형은 표적을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-7
그림 7: 핵심 목표물의 GO 농축 분석. 막대 그래프는 BP, CC, MF 카테고리에서 상위 10개의 풍부 유전자 온톨로지 용어를 보여줍니다. x축은 GO 항을, y축은 −log10(p-값)을 나타내며 농축의 중요성을 나타냅니다. 약어: BP = 생물학적 과정; CC = 세포 성분; MF = 분자 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 8: 코어 타깃의 KEGG 경로 농축 분석. 버블 플롯은 상위 20개의 농축된 KEGG 경로를 보여줍니다. 점 크기는 풍부한 유전자의 수를 나타내며, 색상 구배는 −log10(p-값을 의미)을 나타내며, 빨간색이 더 높을수록 통계적 유의성이 높음을 나타냅니다. x축은 유전자 비율을 나타내고, y축은 경로 용어를 나열합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 9: 분자 도킹 결합 에너지 열지도. 히트맵은 핵심 표적과 주요 혈액 흡수 화합물 간의 결합 에너지(kcal/mol)를 나타냅니다. 결합 에너지 값이 낮을수록 예측되는 결합 친화력이 더 강함을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-10
그림 10: 대표적인 분자 도킹 구조. (A) CASP3와 디아세틸라스페룰로시딕산의 결합 구조. (B) 디오신과 STAT3의 결합 구조. (C) 제니포시딕산과 PIK3CA의 결합 구조. 이미지는 예측된 리간드-단백질 상호작용과 결합 방향을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 고해상도 MS/MS를 이용한 대표 화합물의 구조 확인. (A) 실험 스펙트럼(상단, 빨간색)과 참조 데이터베이스 스펙트럼(하단, 파란색) 간의 디아세틸라스페룰로시딕산의 머리부터 꼬리 스펙트럼 비교. (B) 디아세틸라스페룰로시딕산의 고해상도 MS/MS 분쇄 스펙트럼. (C) 제니포시딕산과 참조 데이터베이스의 머리부터 꼬리까지의 스펙트럼 비교. (D) 제니포시딕산의 실험적 MS/MS 단편화 스펙트럼. (E) 디오신과 참조 데이터베이스의 머리부터 꼬리 스펙트럼 비교. (F) 디오신의 고해상도 MS/MS 분편화 스펙트럼. 이 패널들은 화합물 식별에 사용되는 스펙트럼 매칭을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 샘플 전반에 걸쳐 대표적인 화합물의 추출된 이온 크로마토그램(EIC). (A) 데아세틸라스페룰로시딕산의 EIC. (B) 제니포시딕산의 EIC. (C) 디오신의 편집장. 각 패널에 대해 상단 미적은 YQQJ 수성 추출물(ZY), 가운데 미세는 빈 대조 혈청(KBX), 하단 미적은 YQQJ 투여 후 혈액 흡수 성분이 포함된 혈청 샘플(GYX)을 나타냅니다. 이 비교는 혈청 내 약물 유래 화합물의 존재를 강조합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 3: 핵심 목표 선별 워크플로우. 이 흐름도는 복합물 표적 예측, IgAN과 관련된 표적 수집, 교차 분석, PPI 네트워크 구축, 위상 파라미터에 기반한 코어 표적 스크리닝을 포함한 표적 식별의 단계적 과정을 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

시간 (분)이동 단계
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

표 1: UHPLC 경배 용출 프로그램. 표는 크로마토그래피 분리에 사용되는 이동상 조성과 구배 조건, 시간점과 해당 수용성(상 A상) 및 유기용매(상 B상) 비율을 제시합니다.

보충표 1: YQQJ 수성 추출물의 화학 성분이 확인되었습니다. 표는 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS로 확인된 화합물(프로토타입 혈액 흡수 성분(A1–A28)과 그 분류, 한방 기원을 나열하고 있습니다. 약어: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = 디오스케레아 니포니카 마키노; DH = 류퓌 팔마툼 L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = 플랜타고 아시아티카 L.; JYH = 로니세라 자포니카. Thunb. 복합물류에는 A = 알칼로이드; Ald = 알데히드; F = 플라보노이드; N = 뉴클레오사이드; O = 기타; OA = 유기산; P = 페놀; PA = 페놀산; Phe = 페닐프로파노이드; Q = 퀴논스; S = 당류; Ste = 스테로이드; T = 테르페노이드; 탄 = 탄닌. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구에서는 "UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 식별 – 혈청 약리화학 분석 – 네트워크 약리학 예측 – 분자 도킹 검증"을 결합한 통합 전략을 사용하여 Igan 치료에서 YQQJ의 잠재적 물질적 기초와 메커니즘을 체계적으로 밝히는 데 사용되었습니다. 이전에 주로 MS를 이용해 한방 조제의 화학 성분을 분석하고 네트워크 약리학만으로 기전을 예측했던 것과달리, 혈청 약리화학은 "복잡한 한방 성분 – 혈액 흡수 성분 – 직접 생체 활성 물질 – 약리역학적 물질 기반"의 작업 흐름을 따릅니다. 투여 후 전신 순환에 진입하는 성분을 식별함으로써 이 접근법은 TCM 조제의 약리역학적 재료 기초를 규명하는 효과적인 전략으로 널리 인정받고 있습니다.

이 연구에서 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 분석을 통해 YQQJ에서 185개의 성분이 처음 확인되었으며, 이 중 28개가 혈액 흡수 화합물의 프로토타입으로 확인되어 이후 기전 연구를 위한 신뢰할 수 있는 화학적 기반을 제공하였습니다. 이 식별의 정확성은 보존 시간, 정확한 질량, MS/MS 파편화 정보를 포괄적으로 일치시키는 데 달려 있습니다. 혈청 약리화학 전략을 바탕으로, 이러한 원형 혈액 흡수 화합물을 네트워크 구축의 출발점으로 사용하여, 한방 성분과 실제 생체 내 효능 간의 관련성을 높였습니다. 복합병 교차 표적과 PPI 기반 핵심 림프절 스크리닝을 통합하고, GO 및 KEGG 농축 분석을 통해 IgAN과 관련된 주요 신호 전달 경로15개가 확인되었습니다. 분자 결합 결과는 주요 혈액 흡수 성분이 Hedyotis diffusa Willd. 와 Dioscorea nipponica Makino에서 유래한 것으로 나타났습니다.실험적으로 확인된 기능적 활성보다는 예측된 결합 친화도를 기반으로 코어 표적과 상호작용할 수 있습니다. 이러한 발견은 Deacetylasperulosidic acid, Geniposidic acid, Dioscin이 추가 실험적 검증이 진행되는 동안 YQQJ의 주요 약리학적 성분으로 작용할 수 있다는 가설을 뒷받침합니다.

기술적인 관점에서 샘플 전처리는 매우 중요했습니다. 혈청의 복잡성과 내인성 단백질(예: 호르몬 및 효소)의 존재로 인해 혈액 흡수 성분의 검출에 방해가 불가피합니다. 본 연구에서는 메탄올 침전을 적용하여 분석 물질을 농축하고 배경 간섭을 줄여 MS 분석의 감도와 정확성을 모두 보장했습니다34. 혈액 샘플링 시점과 관련해서는, 허브 조제액 내 다양한 성분들이 서로 다른 흡수 및 생체 내 변형 패턴을 보일 수 있어 혈청 내 검출 가능성에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 예비 시험을 바탕으로, 혈청 샘플은 최종 투여 후 2시간과 8시간에 채취하여 순환 성분의 범위 확대를 극대화하였습니다.

이 워크플로우의 성공적인 구현을 위해 특히 중요한 절차적 단계들이 있음이 밝혀졌습니다. 정확한 화합물 식별은 보존 시간, 고해상도 질량 정확도, 진단용 MS/MS 조각 이온의 통합 평가에 크게 의존합니다. 또한, 투여 후 다양한 단계에서 혈액 흡수 성분이 혈액 흡수 성분으로 나타날 수 있는 적절한 혈청 샘플링 시점은 필수적입니다. 따라서 복잡한 생물학적 매트릭스에서 프로토타입 화합물을 신뢰성 있게 검출하기 위해서는 샘플 전처리 및 크로마토그래피 분리 조건의 신중한 최적화가 필요합니다.

샘플 준비 및 MS 분석 과정에서 잠재적인 분석적 어려움이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 불완전한 단백질 침전은 이온화 효율을 억제하는 매트릭스 효과를 초래할 수 있으며, 과도한 배경 잡음은 검출 감도를 낮출 수 있습니다. 이러한 문제는 단백질 침전 중 용매 비율을 최적화하고, 크로마토그래피 분리 조건을 개선하며, MS 획득 매개변수를 조정함으로써 완화할 수 있습니다. 데이터 처리 중에 데이터베이스 매칭에만 의존할 때 거짓 양성 복합 주석이 발생할 수 있으며; 따라서 식별 신뢰성을 높이기 위해 MS/MS 단편화 패턴과 보존 동작에 대한 수동 검증이 권장됩니다.

이 작업에는 여러 방법론적 고려사항이 반영되었다. 첫째, 경구 생체이용률이나 약물 유사성 같은 기존의 기준을 적용하는 대신, 실험적으로 검증된 혈액 흡수 성분만을 표적 예측에 사용했습니다. 이 접근법은 미리 설정된 필터링 임계값으로 인한 활성 화합물 누락 가능성을 피하고, 생체 내에서 생체이용률이 없는 무관한 성분을 제거하여 네트워크 예측의 생리학적 관련성을 강화했습니다. 둘째, 결합용 활성 리간드 선정은 '바람 습기를 해소하고 열독소를 제거한다'는 기능을 가진 약초에서 유래한 주요 성분(Hedyotis diffusa Willd. 및 Dioscorea nipponica Makino.)에 초점을 맞추어, 한의학의 '신장 침투 풍습-열 독소' 개념과 현대 IgAN의 병리학적 특징 사이에 기전적 다리를 놓았다. 이는 공식-패턴 상관관계에 관한 한의학 이론을 뒷받침하는 예비 증거를 제공합니다. 셋째, 데이터베이스 간 데이터 크기와 품질 차이를 고려하여 여러 플랫폼을 통합하여 대상 범위를 넓히고 단일 데이터베이스가 초래하는 편향을 줄였다35.

기존 전략이 모든 검출된 화학 성분에 네트워크 약리학을 직접 적용하는 것과 달리, 현재의 워크플로우는 실험적으로 검출된 혈액 흡수 성분을 기반으로 한 근거 기반 화합물 우선순위 지정을 강조합니다. 이 단계별 필터링 과정은 계산 분석에 들어오는 후보 화합물 수를 줄이고 화합물-표적 상호작용 네트워크의 해석 가능성을 향상시킵니다. 또한, 주로 내인성 대사 교란을 포착하는 대사체학 중심 연구와 달리, 현재 전략은 한방 약물에서 유래한 외인성 프로토타입 화합물에 초점을 맞추어 특정 한방 성분에 대한 약리학적 활성을 보다 직접적으로 귀속시킬 수 있게 합니다.

실용적인 방법론적 관점에서 이 워크플로우는 복잡한 한방 제형을 조사하는 데 여러 이점을 제공합니다. HRMS와 혈청 약물화학의 통합은 생체이용률 성분의 신뢰성 있는 식별을 가능하게 하며, 네트워크 약리학과 분자 결합의 결합은 화학 증거와 기전 예측을 연결하는 계층적 분석 프레임워크를 구축합니다. 또한, 네트워크 구축을 실험적으로 검증된 화합물로 제한하면 네트워크 복잡성이 줄어들고 핵심 화합물-표적 상호작용의 명확한 식별이 용이해집니다.

이 연구에도 한계가 있습니다. 첫째, 네트워크 약리학과 분자 도킹은 예측 계산 접근법입니다. 강한 결합 친화도가 반드시 생체 내 생물학적 조절로 이어지지는 않는데, 분자 결합은 단백질 역학, 세포 맥락, 또는 하위 신호 전달을 설명하지 않기 때문입니다. 더불어, 현재의 도킹 프로토콜에는 공동결정 리간드를 이용한 재도킹 검증이나 알려진 억제제에 대한 벤치마킹이 포함되어 있지 않아 도킹 정확도 평가가 제한될 수 있습니다. RMSD 기반 검증, 분자 동역학 시뮬레이션, 실험 분석법을 포함한 향후 연구들은 이러한 예측의 신뢰성을 더욱 강화할 것입니다. 현재 우리 연구팀은 디오신이 JAK2/STAT3 경로를 통해 작용한다는 기전적 검증을 완료했으며, 이는 예측의 신뢰성을 어느 정도 강화하고 본 연구에서 확인된 주요 표적에 대한 부분적인 실험적 근거를 제공하지만, 다른 성분-표적 상호작용은 아직 확인이 필요합니다36. 둘째, 허브 간 비례 적합성과 용량 관계의 영향은 현재 분석에 반영되지 않았습니다. 향후 연구에서는 임상 처방 관행을 더 잘 반영하기 위해 용량-효과 가중 네트워크 모델을 도입할 수 있습니다37.

결론적으로, 현재의 워크플로우—고해상도 MS 기반 혈액 흡수 성분 확인, 네트워크 약리학 기반 표적 및 경로 중심 분석, 분자 결합 검증—은 복잡한 한방 공식에서 활성 물질 기저와 작용 표적을 효율적으로 좁힐 수 있게 합니다. 이는 후속 생물학적 검증을 위한 명확한 실험 방향을 제공하며, TCM 공식의 기전적 연구를 가속화합니다. 앞으로 공간 대사체학, 오가노이드 모델, 다중 오믹스 기술을 통합함으로써 생리학적·병리학적 조건을 보다 밀접하게 재현하는 시스템에서 현재 발견의 동적 3차원 검증과 확장이 가능해져, TCM 공식의 과학적 근거를 밝히는 데 더 견고한 증거를 제공할 수 있을 것입니다.

공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국국립자연과학기금(보조금 번호 81973675), 고수준 중국 의학병원 진흥 프로젝트(보조금 번호)의 지원을 받았습니다. HLCMHPP2023039), 그리고 베이징 자연과학재단(보조금번호 7252259)을 지원했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
오토독 4.2.6스크립트 연구소-
크로마토그래피 컬럼워터스 코퍼레이션액퀴티 UPLC HSS T3
고속 냉장 원심분리기헤티히 연구소 기술Mikro 220R
통합 생물정보학 플랫폼Weizmann   연구소 및 nbsp; of  과학-GeneCards 데이터베이스 (https://www.genecards.org/)
통합 생물정보학 플랫폼그는; 존스와 nbsp; 홉킨스와 nbsp; 대학   학교   of  의학-OMIM 데이터베이스 (https://omim.org/).
LC-MS/4 L 아세토니트릴써모피셔 사이언티브A955-4
LC-MS/4 L 메탄올써모피셔 사이언티브A456-4
LC-MS/4 L 워터써모피셔 사이언티브W6-4
LC-MS/50 mL 포믹산써모피셔 사이언티브A117-50
질량분석법 데이터 처리 소프트웨어워터스 코퍼레이션-프로제네시스 QI 3.0 소프트웨어
분자 도킹 소프트웨어올슨 연구소오토독 4.2.6
PPI 플랫폼STRING 데이터베이스 회사-STRING 온라인 플랫폼 (https://string-db.org)
단백질 데이터베이스유럽 생물정보학 연구소; 스위스 생물정보학 연구소; 단백질 정보 자원-UniProt 플랫폼 (https://www.uniprot.org/)
쿼드루폴 오비트랩 질량분석기써모피셔 사이언티브IQLAAEGAAPFALGMAZR
참고 화합물 데이터베이스TCM 프로 2.0, 베이징 헥신 테크놀로지 유한회사.-
회전 증발기상하이 타이탄 과학 유한회사TR-3L
구조생물학 데이터베이스.브룩헤이븐 국립연구소-RCSB PDB 데이터베이스 (https://www.rcsb.org/)
구조생물학 데이터베이스.국립 생명공학 정보 센터-PubChem 데이터베이스 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
타겟 예측 데이터베이스SIB 스위스 생물정보학 연구소-스위스타겟예측 데이터베이스 (https://www.swisstargetprediction.ch)
타겟 예측 데이터베이스상하이   연구소 및 nbsp; of  마테리아  메디카-TCMSP 데이터베이스 (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
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참고문헌

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