에피트랜스크립트 해독: 유방암에서 m6A 조절 네트워크에 대한 실 리코 통찰

Summary

이 프로토콜은 암 게놈 아틀라스(TCGA), 유전자형-조직 발현(GTEx) 프로젝트, 마이크로어레이 플랫폼의 공개 데이터셋을 활용하여 돌연변이 프로필, 복제수 변화, 유전자 발현, 임상 결과를 통합하여 m6A 변형 조절자의 실 리코 유전학적, 분자적, 예후 분석을 수행하는 접근법을 제시합니다.

Abstract

N6-메틸아데노신(m6A)은 진핵생물 전사체에서 가장 풍부한 내부 RNA 변형으로, RNA 대사, 유전자 발현, 세포 항상성에 중요한 역할을 합니다. "작가", "지우개", "리더"를 포함한 m6A 조절자의 조절 장애는 점점 더 암 생물학과 연관되어 있습니다; 그러나 이들이 유방암에서 어떤 포괄적인 역할을 하는지는 아직 이해되지 않았습니다. 이 방법 논문의 주요 목적은 생물정보학 초보자들에게 공개된 암 데이터셋을 활용해 돌연변이 분석을 수행하고, 유전자 발현 변화를 평가하며, 환자 생존과의 연관성을 조사하는 단계별 프레임워크를 제공하는 것입니다. 사례 연구로, 유방암에서 m6A 조절인자를 Cancer Genome Atlas(TCGA), 유전형-조직 발현(GTEx) 프로젝트, 마이크로어레이 플랫폼의 데이터셋을 사용하여 분석하였습니다. 전사체 프로필을 체계적으로 분석하여 유방암에서 m6A 조절 구성 요소의 예후적 관련성을 평가하는 워크플로우를 입증하였습니다. 이 분석 틀을 사용하여 주요 m6A 조절자 간 유전적 변이와 차별 발현의 뚜렷한 패턴이 확인되었습니다. METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1, RBMX 등 여러 조절 요인이 더 나은 환자 생존율과 연관되어 있었고, YWHAG는 전체 생존율이 낮음과 연관되어 있었습니다. 이 연구는 유방암에서 m6A 조절 유전자에 대한 포괄적인 시스템 유전체학 개요를 제공하며, 실용적이고 재현 가능한 웹 기반 생물정보학 워크플로우를 시연합니다. 이 발견들은 유방암에서 후생전사체 조절에 대한 이해를 진전시키고, 새로운 m6A 기반 진단 및 치료 전략 개발의 토대를 제공합니다.

Introduction

에피전사체체 변형은 전사 후 유전자 조절의 중요한 층을 나타내며, 다양한 세포 과정과 질병 상태에 기여합니다. 지금까지 확인된 170개 이상의 RNA 변형 중 N6-메틸아데노신(m6A)은 진핵생물 mRNA에서 가장 흔하고 잘 알려진 수변^입니다. METTL3/METTL14 같은 '작가' 복합체에 의해 설치되고, FTO와 ALKBH5 같은 '지우개'에 의해 제거되며, YTH 및 IGF2BP 계열 구성원을 포함한 '리더' 단백질에 의해 해석되는 m6A는 RNA 접합, 안정성, 수송 및 번역을 조율하여 발달, 분화, 스트레스 반응 등 주요 생물학적 과정에 영향을 미칩니다 ^2,3.

m6A 조절 성분의 변화는 광범위한 악성 종양 전반에서 보고^{되었습니다.} 많은 암에서 이상한 m6A 활성이 악성 표현형을 유발합니다; 예를 들어, METTL3의 발현 증가는 헤지혹 경로와 MYC RNA 메틸화를 조절하여 전립선암의 시작과 진행을 촉진합니다 ^5,6. 급성 골수성 백혈병에서 종양성 영향과 관련이 있는 것으로 처음 밝혀졌으나, FTO는 간, 폐, 대장암에서 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났습니다 7,8,9,10. 그러나 FTO와 ALKBH5의 맥락 의존적 역할이 확인되어 m6A 매개 조절의 이중 특성이 드러나며, 이는 종양 억제 신호 전달을 촉진할 수 있습니다 11,12,13,14. YTHDF1/2/3 등 M6A 리더기, 이질적인 핵 리보핵단백질(hnRNP), 인슐린 유사 성장인자-2 mRNA 결합 단백질(IGF2BP1-3)도 발암과 연관된 것으로 밝혀졌습니다 15,16,17.

유방암에서는 m6A 조절인자가 자주 조절 장애를 겪으며 종양 아형, 면역 관련 특징 및 임상 결과와 연관될 수 있음을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다^18,19. 여러 기전 연구에서 METTL3가 유방암에서 자주 상향 조절되는 종양 유발 인자로 위치하고 있습니다. METTL3 매개 m6A 설치는 증식, 상피-간엽 전이(EMT), 전이 및 화학요법 저항성을 촉진하는 전사체의 번역을 안정화하거나 향상시킬 수 있습니다²⁰. METTL3는 또한 Bcl-2를 표적으로 하여 유방암 진행을 촉진하는 것으로 나타^{났습니다.} ALKBH5는 NANOG 및 기타 줄기 관련 분자를 통해 암 줄기성 프로그램 조절에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 그 영향력은 종양 맥락에 따라 다를 수 있다²².

최근 몇 년간 m6A 조절제 목록이 계속 확대됨에 따라, 새로 확인된 조절 요인들이 유방암에서 어떻게 조절 장애를 일으킬 수 있는지에 대한 업데이트가 필요합니다. 표 1은 m6A 변형의 라이터, 리더, 지우개를 포함한 m6A 조절기 목록을 제공합니다. 또한, LRPPRC와 YWHAG를 포함한 새로운 m6A 조절제가 암 진행에 영향을 미치는 것으로 확인되었습니다^{23, 24, 25}. 따라서 생물정보학 배경이 제한된 연구자들도 활용할 수 있는 도구를 사용하여 유방암에서 알려진 모든 m6A 조절자에 대한 포괄적인 유전학 및 분자 특성 분석이 수행되었습니다.

이 방법 논문의 목적은 공개된 암 유전체 자원을 활용하여 유방암에서 m6A 조절자를 분석하는 단계별 플랫폼 기반 생물정보학 프로토콜을 제시하는 것입니다. 암 게놈 아틀라스(TCGA)(www.cancer.gov/tcga), Genotype Tissue Expression(GTEx) 프로젝트²⁶, cBioPortal과 UCSC Xena와 같은 웹 기반 분석 플랫폼의 데이터셋을 사용하여 이 프로토콜은 돌연변이 프로필, 유전자 발현 변화, 환자 생존과의 연관성을 재현 가능한 워크플로우로 입증합니다. 이 시각화되고 접근 가능한 접근법은 암 생물정보학에 처음 입문한 연구자들이 후생전사체 데이터 분석을 도입할 수 있도록 돕기 위한 것입니다.

Protocol

참고: m6A 메틸화 조절자를 암호화하는 유전자(작가, 리더, 지우개)의 목록은 표 1에 제시되어 있습니다. 모든 유전자는 돌연변이, 발현 패턴 및 전체 생존 기간에 대한 후속 분석에 포함되었습니다. 이 연구에 사용된 모든 소프트웨어와 도구는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. m6A 조절자에서 유전적 변이의 확인

1. 암 유전체학을 위한 cBioPortal에 접속하세요. cBioportal 웹사이트로 이동하세요 (www.cbioportal.org)^27,28. 홈페이지에서 "쿼리" 탭을 선택하여 새로운 분석을 시작하세요.
2. 적절한 암 연구와 코호트를 선택하세요.
3. "시각화 및 분석을 위한 연구 선택" 검색창에서 "Breast Invasive Carcinoma"를 입력하고 "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, 범암 지도)"를 선택하세요.
4. 하단에서 "유전자 쿼리"를 선택하세요.
   중요: 선정된 코호트(996개 샘플)에 돌연변이 및 복제수 변형(CNA) 데이터가 모두 포함되어야 합니다.
5. 유전적 쿼리를 정의하세요. "유전자 입력" 에 HUGO 유전자 기호를 입력하면 조사 중인 m6A 조절자 전체 목록을 확인할 수 있습니다.
   참고: 유전자는 공백으로 구분된 리스트로 입력할 수 있습니다. "유전체 프로필 선택" 항목에서 다음 두 가지 데이터 유형을 확인하세요: 돌연변이와 복사수 변경.
6. "환자/사례 세트 선택 아래에서, 모든 프로필 사례가 포함된 코호트에 해당하는 기본 표본 세트를 선택하세요.
7. 파란색 "문의 제출" 버튼을 클릭하세요.
8. 유전 변형 데이터를 검색하고 해석하세요. 제출 시 결과가 "요약" 탭에 로드됩니다. 중앙의 "OncoPrint" 시각화는 코호트 내 모든 조회 유전자에 걸친 유전적 변형을 즉시 보여주며, 다운로드할 수 있습니다.
9. OncoPrint 옆에 "암 유형 요약" 플롯을 찾으세요. 이는 유방암 아형별 변이를 정량적으로 분석할 수 있게 합니다.
10. 범암 분석을 수행하세요. cBioPortal 홈페이지로 돌아가 "Query" 탭에서 "TCGA PanCancer Atlas Studies"를 선택하세요.
11. 유전자 입력 박스에 동일한 m6A 조절 유전자 목록을 입력하세요.
12. "쿼리 제출" 을 클릭하고 결과 페이지에서 "암 유형 요약" 탭으로 이동하세요. 이것은 범암 관점을 제공합니다.

2. UCSC Xena를 이용한 m6A 조절자의 비교 전사체 분석.

1. UCSC 제나 플랫폼에 접속하세요. UCSC Xena 웹사이트로 이동하세요 (https://xena.ucsc.edu)²⁹.
2. 홈페이지에서 "제나 실행" 버튼을 클릭하여 메인 분석 브라우저에 들어갑니다.
3. Xena 브라우저에서 "DATA SETS"를 클릭하세요.
4. 데이터셋 중에서 "TCGA TARGET GTEx"를 선택하세요. 여기에는 TCGA 및 GTEx 프로젝트의 정상 조직에서 균일하게 처리된 RNA-Seq 데이터가 포함되어 있습니다.
5. 다음 페이지에서 "시각화"를 클릭하세요.
6. 표현형(샘플 그룹) 변수를 정의하세요. "첫 번째 변수 선택"에서 표현형 데이터 타입의 "메인 카테고리"를 선택하세요.
7. "TO SECOND VARIABLE"을 클릭하세요. 그 다음 유전체 데이터 타입에서 데이터셋의 "유전자 발현"을 체크하세요. "유전자 또는 위치 추가" 박스에 유전자 목록을 추가하세요. "완료"를 클릭하세요.
8. 히트맵으로 표정 패턴을 시각화하세요.
9. 유방(TCGA+GTEx) 샘플을 TCGA TARGET GTEx에서 분리하려면 "Breast"를 입력하고 필터 옵션을 사용하여 샘플을 보관하세요.
10. 히트맵은 이제 볼 수 있으며 PDF로 다운로드할 수 있습니다.
11. 개별 유전자에 대한 비교 박스 플롯을 생성하세요. 특정 유전자의 발현 차이를 정량화하고 시각화하려면 "차트로 보기"를 사용하세요. 이 옵션을 사용하면 데이터를 박스 플롯, 점플롯, 바이올린 플롯으로 볼 수 있으며, 두 표본 그룹 간의 표현 분포를 비교할 수 있습니다.
12. "PDF로 다운로드" 옵션을 사용해 차트를 다운로드하세요.
13. 통계적 유의성(p-값)은 "STATISTICS"를 클릭하면 얻을 수 있습니다.

3. Kaplan-Meier 플로터를 이용한 m6A 조절기의 예후 유의성 평가.

1. Kaplan-Meier 플로터 도구를 사용하세요. Kaplan-Meier Plotter 웹사이트로 이동하세요 (https://kmplot.com/analysis)³⁰.
2. 홈페이지에서 "유방암" 탭을 선택하여 유방암 데이터셋에 특화된 분석을 시작하세요.
3. 유전자 쿼리를 단일 유전자에 대해 설정하세요.
4. 기본 입력 섹션에서 "유전자 심볼" 박스를 찾으세요.
5. 분석할 m6A 조절 유전자의 공식 기호(예: METTL3)를 입력합니다.
   중요: 유전자 입력 박스 바로 아래에서 "Only JetSet best probe set" 체크박스를 찾아 활성화하세요. 이로 인해 가장 신뢰할 수 있고 특이적인 마이크로어레이 프로브가 자동으로 유전자에 선택되어 데이터 품질과 재현성을 최적화합니다.
6. 생존 분석 매개변수를 정의하세요. "생존" 섹션에서 이 분석의 주요 평가 항목으로 "전체 생존(OS)" 을 선택하십시오. 이 설정을 선택하면 1880명의 유방암 환자 데이터를 자동으로 활용합니다.
7. "환자별로 나누기" 옵션이 "중앙값"으로 설정되어 있는지 확인하세요. 이 과정은 환자를 두 개의 동등한 그룹으로 나눕니다; 모든 샘플에서 조사된 유전자의 중앙값 발현값을 기준으로 고발현과 저발현을 구분합니다.
8. "추적 임계값" 은 추적 관찰 기간을 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 이 연구에서는 180개월이 선정되었습니다.
9. Kaplan-Meier 플롯을 생성하고 해석하세요.
10. "Kaplan-Meier 플롯 그리기" 버튼을 클릭하세요.
11. 새로운 창이 로드되어 생존 곡선이 표시됩니다.
12. 주요 줄거리 요소를 해석하고; X축은 개월 단위의 시간을, Y축은 전체 생존 확률을 나타내며, 두 개의 색 선은 고발현(빨간색)과 저발현(검은색) 환자군의 생존 곡선을 나타냅니다. 로그 랭크 P-값이 표시되어 두 생존 곡선 간 차이의 통계적 유의성을 나타냅니다.

Results

유방암에서 m6a 메틸화 조절자의 돌연변이 지형

TCGA 데이터셋의 유전체 분석에 관한 이전 연구에서는 DNA 메틸화 조절자를 암호화하는 여러 유전자에서 반복 돌연변이^{가 보고되었습니다}. 본 연구에서는 cBioPortal을 활용해 "유방 침습성 암종(TCGA, PanCancer Atlas)" 데이터셋을 분석하여 m6A RNA 메틸화의 작성자, 리더, 지우기 유전자의 돌연변이 프로필을 조사하였습니다. 이 분석은 유방암 환자들 사이에서 유전적 변이가 다양하게 나타나며, 유전자 간에 변이 빈도가 크게 달랐음을 밝혀냈습니다. CNBP와 RBM15B에서는 0.4%, VIRMA에서는 12%였습니다(그림 1A). 유전자 증폭이 가장 흔한 변이였으며, 추가 사건으로는 깊은 결실, 염기 치환, 그리고 여러 개의 동시 변이가 포함되었다. 특히 m6A 관련 기능을 조절하는 유...

Discussion

이 방법론의 논문은 암 연구에서 모든 유전자 서명의 체계적인 다중 오믹스 프로파일링과 임상 번역을 위한 포괄적이고 접근성 있으며 통합된 워크플로우를 제공하며, 유방암에서 m6A RNA 메틸화 조절자 분석을 통해 이를 입증합니다. 이 주요 공공 생물정보학 플랫폼을 결합함으로써, 연구자들은 고급 계산 전문 지식 없이도 유전체 발견에서 임상적으로 중요한 가설로 효율적으로 발전할 수 있습니다.

이 방법론의 주요 강점은 모듈형 가설 생성 파이프라인입니다. 이 프로토콜은 사용자를 논리적 순서대로 안내합니다; 먼저 cBioPortal을 사용해 유전적으로 변형된 유전자를 식별하고, 배치 교정 환경에서 발현 조절 이상을 평가하며(UCSC Xena를 사용), 마지막으로 해당 조절 이상이 환자 생존에 미치는 임상적 영향을 평가했습니다(Kaplan-Meier Plotter 사용). DNA에서 RNA에 이르기까지, 임상 결과에 이르는 단계별 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cBioPortal	기념 슬론-케터링 암 센터	https://www.cbioportal.org
유전자형-조직 발현(GTEx)	GTEx 컨소시엄	https://gtexportal.org
카플란-마이어 플로터	Gyorffy 연구소/A5 유전학 유한 회사	https://kmplot.com
암 게놈 아틀라스(TCGA)	국립 암 연구소(NCI)	https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena 브라우저	캘리포니아 대학교 산타크루즈	https://xenabrowser.net