기관지 천식 치료에서 구벤 핑촨 과립의 기전 탐구

요약

이 프로토콜은 네트워크 약리학, 분자 도킹, 그리고 생체 내에서 구벤 핑촨 과립의 작용 기전을 기관지 천식에서 조사합니다. 검증.

초록

본 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹, 실험적 검증을 통해 구벤 핑촨 과립이 기관지 천식 치료에 작용하는 기전을 조사합니다. 활성 성분과 대응하는 표적은 TCMSP, HERB, SymMap 데이터베이스를 사용하여 확인되었습니다. 기관지 관련 표적은 GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB에서 수집하였습니다. 중복되는 표적을 확인하고, 구성 요소-표적 및 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였습니다. 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 풍부화 분석은 거짓 발견률(FDR) 보정을 통해 수행되었습니다. 결합 친화도를 평가하기 위해 분자 도킹이 수행되었고, 이후 생체 내 검증이 진행되었습니다. 총 121개의 활성 성분과 234개의 약물 관련 표적이 확인되어 155개의 중복 표적이 발견되었습니다. 핵심 표적에는 TP53, AKT1, TNF, IL6가 포함되었습니다. KEGG 분석 결과, PI3K–Akt 신호 전달 경로의 유의미한 농축이 확인되었으며, 이는 실험적 검증을 위해 선정되었습니다. 분자 결합 결과, 코어 성분과 AKT1 사이에 강한 결합 친화력이 나타났습니다. 오알부민 유도 천식 쥐에서 구벤 핑촨 과립은 혈청 IL-4 및 IL-10 수치를 감소시키고, 폐 조직 내 FoxP3 발현을 증가시키며, PI3K 와 AKT mRNA 수치를 상향 조절했습니다. 이 발견들은 구벤 핑촨 과립이 PI3K–Akt. 신호 전달 경로를 조절하고 염증성 사이토카인을 조절하며 조절 T 세포 기능을 강화함으로써 기관지 천식을 완화한다는 것을 시사합니다.

서론

기관지 천식은 기도 염증, 기도 과민반응, 점액 과분비, 기도 재형성이 특징인 이질성 만성 호흡기 질환입니다^. 이 질환의 병인은 면역 세포 활성화, 염증 매개체, 다중 신호 경로 간의 복잡한 상호작용을 포함합니다. 임상적으로 천식은 반복적인 쌕쌕거림, 호흡곤란, 가슴 답답함, 기침으로 나타납니다. 기도 염증은 질병 발병과 진행의 중심 기전으로, IL-6, IL-4, IL-17, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 분비 증가, 호산구와 호중구 등 염증 세포의 침투, 기도 평활근 증식, 기저막 두꺼움, 점액선 과형성과 같은 구조적 변화가 특징입니다^2˒3. 이러한 병리학적 과정은 궁극적으로 기도 폐쇄와 공기 흐름 저하로 이어집니다.

천식 병태생리는 단일 기전이 아니라 여러 상호작용하는 신호 경로에 의해 조절됩니다. PI3K–Akt 신호 전달 경로는 FoxP3 발현을 조절함으로써 특히 Treg/Th17 축을 포함한 면역 균형을 조절하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이 경로는 또한 IL-17 및 TNF 신호 전달 경로와 상호작용하여 염증 반응과 기도 재형성을 증폭시키며, 질병의 이질성과 치료 저항성에 기여합니다 ^3,4. 역학 자료에 따르면 전 세계적으로 천식 유병률이 지속적으로 증가하고 있으며, 전 세계적으로 3억 5,800만 명 이상이 영향을 받고 있으며, 중국에서는 약 4,570만 명의 성인 환자가 있습니다 ^5,6. 현재 치료 전략은 주로 흡입 β₂-제작용제와 글루코코르티코이드에 의존하고 있습니다. 그러나 이러한 치료법들은 제한된 병리학적 기전을 표적으로 삼아 특정 환자에서 부작용과 글루코코르티코이드 내성을 초래할 수 있습니다. PI3K–Akt.와 같은 경로의 조절 장애는 치료 반응성 저하와 연관되어 있어 다중 표적 치료법의 필요성을 강조합니다 ^7,4.

전통 중의학(TCM)은 천식을 '샤오 증후군'으로 분류하며, 폐, 비장, 신장 기능 저하와 외부 병원성 요인이 결합된 상태를 의미합니다. TCM 제형은 다성분, 다중 표적 특성 때문에 천식 관리에 널리 사용되어 왔습니다 ^8,9. 단일 표적 약리학적 약물과 달리, TCM 화합물은 여러 생물학적 경로를 조절하여 천식의 복잡한 병태생리와 일치하여 치료 효과를 발휘합니다^. 네트워크 약리학은 약물 성분, 표적, 질병 경로 간의 상호작용을 분석하는 시스템 수준 접근법을 제공하여 주요 생리활성 화합물과 분자 메커니즘을 식별할 수 있게 합니다¹¹. 분자 도킹은 소분자와 표적 단백질 간의 결합 친화도를 평가함으로써 이 접근법을 더욱 보완합니다.

구벤 핑촨 알갱이는 에 페드라 시니카(Ephedra sinica ), Psoralea corylifolia 과일, 프 루누스 아르메니아카 씨앗(살구씨), Pseudostellaria heterophylla 뿌리, Perilla frutescens, Eriobotrya japonica 잎(Loquat 잎), Lilium brownii 구근, Epimedium brevicornum 등 8가지 허브 성분으로 이루어진 전통 중국 약용 제제입니다. 이 제형은 전통적으로 활력을 강화하고 가래를 해소하며 쌕쌕거림을 완화하는 데 사용됩니다. 이전 임상 연구들은 기관지 천식에서 치료 효능이 입증되었으며, 기존 치료법에 비해 더 높은 반응률을 보였습니다¹².

작용의 근본 기전을 밝히기 위해, 네트워크 약리학, 분자 도킹, 생체 내 실험 검증을 결합한 통합 접근법이 적용되었습니다. 네트워크 약리학은 기관지 천식과 관련된 활성 성분과 잠재적 표적을 식별하는 데 사용됩니다. 분자 도킹은 주요 화합물과 표적 단백질 간의 상호작용을 평가하는 데 사용됩니다. 이후 동물 모델에서 실험적 검증이 수행되어 특히 PI3K–Akt. 경로에 대한 중요한 신호 전달 경로에 대한 조절 효과를 평가합니다. 이 접근법은 구벤 핑촨 과립의 다목표 치료 효과에 대한 기전적 통찰을 제공하고 기관지 천식 치료에 적용을 지원하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 랴오닝중의학대학교 동물윤리위원회(승인 번호: 21000042023058)의 승인을 받았으며, 기관 지침에 따라 시행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 연구 도구들은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 데이터베이스 및 소프트웨어

1. 다음 데이터베이스와 소프트웨어에 접근하세요: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt, 그리고 Cytoscape(버전 3.9.1).

2. 구성 목표물 획득

1. TCMSP 데이터베이스에서 에페드라 허브, 살구, 가이도스텔라리아 뿌리, 페릴라 열매, 로쿼트 잎, 백합 속, 에피미디엄의 화학 성분을 검색하세요¹³. HERB와 SymMap 데이터베이스에서 Psoralea 화합물을 검색하세요.
2. 경구 생체이용률(OB ≥ 30%)과 약물 유사성(DL ≥ 0.18^)을 이용해 활성 화합물을 선별^합니다.
3. TCMSP를 이용해 표적 유전자를 예측합니다. UniProt 데이터베이스를 사용하여 Homo sapiens를 선택하여 모든 표적을 표준화하세요. 비인간 항목, 주석이 없는 단백질, 구식 식별자 등 중복 및 유효하지 않은 표적을 제거하세요.

3. 기관지 천식 표적 획득

1. "기관지 천식" 키워드를 사용해 GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB를 검색하세요. GeneCards 관련성 점수를 >4로 설정하세요. 회수된 모든 대상을 병합하고 중복 대상을 제거하세요.

4. 교차점 목표물 식별

1. 약물 표적과 질병 표적을 온라인 벤 분석 도구로 가져오세요. 겹치는 표적을 식별하고 총 수를 기록하여 후속 분석을 수행하세요.

5. 구성 요소-목표 네트워크 구축

1. 교차 타겟을 Cytoscape 3.9.1로 가져오기. 컴포넌트-타겟 네트워크를 구성합니다. 그 정도 값에 따라 노드 크기와 색상을 조정하세요.

6. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축

1. 교차점 목표를 STRING 데이터베이스에 업로드하세요. 호모 사피엔스를 선택하고 신뢰도를 ≥0.900으로 설정하세요. 네트워크를 내보내서 Cytoscape로 가져오세요.
2. 위상학적 매개변수(차수 중심성, 간도 중심성, 근접성 중심성)를 계산합니다. 중앙값 임계값과 차수 >20을 사용하여 핵심 목표를 식별합니다.

7. GO와 KEGG 농축 분석

1. 겹치는 타겟을 DAVID 데이터베이스에 업로드하거나 R 패키지 clusterProfiler를 사용해 분석할 수 있습니다.
2. 생물학적 과정, 세포 구성 요소, 분자 기능 범주에 대한 유전자 온톨로지(GO) 풍부화 분석을 수행합니다.
3. KEGG 경로 농축 분석을 수행하세요. 거짓 발견률(FDR) 보정을 적용하고 유의성 임계값을 FDR < 0.05로 설정합니다.
4. 바 플롯이나 버블 플롯을 사용해 상위 풍부 항을 시각화하세요.

8. 분자 도킹

1. PubChem에서 코어 화합물의 2D 구조를 다운로드하세요. ChemOffice를 사용해 3D 구조를 생성하고 mol2 파일로 저장하세요.
2. RCSB PDB 데이터베이스에서 단백질 구조를 다운로드하세요. PyMOL을 사용해 물 분자와 리간드를 제거합니다.
3. AutoDock Vina를 사용해 분자 도킹을 수행합니다. 그리드 박스 매개변수를 정의하고 도킹 시뮬레이션을 실행하세요.
4. 결합 에너지(kcal/mol)와 주요 상호작용 잔기량을 기록하세요. 분자 모델링, 시각화 및 시뮬레이션 플랫폼을 사용하여 도킹 결과를 시각화할 수 있습니다.

9. 실험적 검증

1. 동물
   1. 수컷 스프래그-도울리 쥐 48마리(9주, 220–240g)를 확보하세요. 20–25°C, 습도 55%–60%의 가정 동물을 표준 조건에서 키우는 것.
2. 약물 및 시약
   1. 에페드라 허브, 프소랄리아, 살구씨, 세우도스텔라리아 뿌리, 페릴라 열매, 로파 잎, 백합, 에피미디엄으로 만든 구벤 핑촨 알갱이를 준비하세요.
   2. 재료표에 기재된 덱사메타손, 오브알부민(OVA), 수산화알루미늄, ELISA 키트, RNA 추출 키트, 항체를 준비하세요.
3. 악기
   1. 마이크로플레이트 리더, 전기영동 시스템, 파라핀 미세토름, 영상 시스템 등 표준 실험실 장비를 준비하세요.
4. 동물 분류 및 처리
   1. 쥐를 무작위로 6개 그룹(n = 8)으로 배정한다: 빈 대조군, 모델 그룹, 덱사메타손 그룹(0.3 mg/kg), 저용량 한의학 그룹, 중용량 중의학 그룹, 고용량 중의학 그룹.
   2. 1일, 7일, 14일째에는 모델 그룹, 저용량 한의학군, 중용량 중의학군, 고용량 중의학군, 덱사메타손군 내 쥐들에게 10% OVA + 10% Al(OH)₃ 1mL 복막내 주사를 투여하여 감작을 시행합니다.
   3. 1일, 7일, 14일째에 무 대조군 쥐에게 0.9% 생리적 식염수 1mL 복막 내 주사를 투여합니다.
   4. 15일부터 21일까지는 매일 20분간 네뷸라이드 흡입 자극을 시행합니다. 모델 그룹, 저용량 한의학 그룹, 중용량 한의학 그룹, 고용량 중의학 그룹, 덱사메타손 그룹의 쥐에게 5% OVA 네밙화 흡입을 투여했습니다.
   5. 빈 대조군 쥐에게 15일부터 21일까지 0.9% 생리적 식염수 네발 흡입을 투여합니다.
   6. 지정된 치료 그룹에 따라 22일부터 36일까지는 하루 1회 경구 개베이지로 치료를 투여합니다.
   7. 실험 기간 내내 매일 체중과 전반적인 상태를 모니터링하세요. 실험 일정은 표 1에 요약되어 있습니다.
5. 조직병리학
   1. 폐 조직을 채취하세요. 수정, 임베드, 섹션 샘플. 헤마톡실린-에오신 염색을 수행하세요.
   2. 콜라겐 침착을 평가하기 위해 매슨 염색을 수행하세요.
6. RT-PCR 분석
   1. 폐 조직에서 총 RNA를 추출하세요.
   2. 초저온 조건에서 동결된 폐 조직을 균질화합니다. 샘플을 무게 재고 나서 액체 질소가 포함된 미리 냉각된 모르타르에 빠르게 옮겨 분말로 분쇄합니다.
   3. 분말 샘플을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 50–100mg 조직마다 1mL TransZol UP와 0.2mL RNA 추출 시약을 첨가합니다. 튜브를 실온에서 5분간 흔들어 주세요.
   4. 샘플을 1000 × 2–8 °C에서 15분간 원심분리합니다. 무색 수상을 새로운 원심분리관으로 옮깁니다.
   5. 1 mL TransZol UP를 0.5 mL 이소프로판올에 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 10분간 배양하세요.
   6. 샘플을 1000 × g에서 10분간 원심분리합니다. 75% 에탄올 1mL를 넣고 다시 5분간 원심분리합니다.
   7. 상정액을 버리고 침전물을 실온에서 5분간 자연 건조시킵니다. 침전물을 50–100 μL RNA 용액에 녹인 후 10분간 배양합니다.
   8. 장기 보존을 위해 샘플은 −70 °C에 보관하세요.
   9. cDNA를 합성하고 정량적 PCR을 수행하여 PI3K 및 AKT 발현을 측정합니다.
7. 엘리사
   1. 혈청 샘플을 4°C에서 해동하세요. 제조사 지침에 따라 ELISA 키트를 사용하여 IL-4 및 IL-10. 수치를 측정하세요.
8. 면역조직화학
   1. 4% 파라포름알데히드로 고정된 폐 조직을 파라핀에 박고, 슬라이스, 왁싱 제거, 수분 공급.
   2. 항원 회수, 차단, 항체 배양을 수행합니다. FoxP3 면역조직화학 키트, DAB 염색 용액에 따른 염색 및 양성 발현은 갈색 노란색 또는 짙은 갈색 염색으로 나타납니다.
   3. 현미경으로 관찰하고 사진을 찍으며, FoxP3 발현의 정량적 통계 분석을 위해 Image J 소프트웨어를 사용하세요.
9. 통계 분석
   1. 샤피로-윌크 검정을 사용한 검정 데이터의 정규성과 레벤 검정을 사용한 분산 동질성.
   2. 필요에 따라 일원 ANOVA 또는 비모수 검정을 사용하여 데이터를 분석하세요. 데이터를 표준편차± 평균으로 표현하세요.
   3. p < 0.05를 통계적으로 유의미하다고 정의하자. ★★대 조군 과 비교해 < 0.01, ★< 0.05; ◆◆p < 0.01 및 ◆p < 0.05 대 모델 그룹; ##p < 0.01, #p < 0.05와 덱사메타손 그룹과 비교했습니다.

표 1: 실험 연대표. 감작, 도전 및 치료 절차의 일정. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

활성 성분 선별
TCMSP 데이터베이스에서 목표 활성 활성 성분을 필터링한 후 총 121개의 활성 성분이 확인되었습니다. 여기에는 에페드라 허브 23, Psoralea에서 7, 살구씨 19, Pseudostellaria 뿌리 8, Perilla 과일 16, 비파 잎 18, 백합 7, 에피미디엄 23 성분이 포함된다. (표 2). 루테올린, 케르세틴, β-시토스테롤, 캐프페롤, 스티그마스터롤, (+)-카테킨 등 16가지 일반적인 성분이 확인되었습니다. 표준화 후 총 234개의 약물 관련 표적이 확보되었습니다. 또한 1,059개의 천식 관련 표적이 확인되었으며, 약물과 질병 사이에 155개의 중복 표적이 포함되어 있습니다(그림 1).

토론

기관지 천식은 호흡기과에서 흔한 질환입니다^. 이 질환은 알레르겐과 기도 과민반응에 의해 발생하는 폐쇄성 기도 질환입니다^. 임상적으로 발생률이 높고 재발이 잦고 치료가 어려워 환자의 건강과 삶의 질에 큰 영향을 미칩니다. 2025년 글로벌 천식 이니셔티브(GINA)는 흡입 글루코코르티코이드 치료가 천식에 효과적이라고 보고^{했습니다.} 하지만 장기간 사용하면 준수율이 떨어질 수 있습니다. 일부 환자는 용량 감량 또는 중단 후 재발하며, 시상하부-뇌하수체-부신 축 억제가 발생할 수 있어 부분적인 글루코코르티코이드 반응성을 초래할 수 있습니다¹⁹.

최근 몇 년간 전통 중의학(TCM)이 천식 치료에 주목받고 있습니다. 천식은 한의학에서 샤오정(쌕쌕거림)으로 분류되...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
qPCR Kit	노보젠(Novogene)	NQ-001, 2×1mL	표적 유전자의 상대적 mRNA 발현 검출
알루미늄 수산화물 Al(OH)3	상하이 위보 바이오테크놀로지 유한공사	YB-AL001, 500g	항원 면역 반응을 증강하는 면역학적 보조제
BCA 단백질 농도 시험 키트	포드 바이오테크놀로지 유한공사	FD2001, 1박스당 100개	샘플 로딩을 표준화하기 위한 총 단백질 정량
화학발광 이미징 시스템	타논(Tanon)	5200Multi	WB 밴드 이미징, 겔 및 블롯 이미지 수집 및 분석
컬러 미리 염색된 단백질 마커	바이올라이보 테크놀로지 유한공사	BL005, 10-180kDa, 500μL	전기영동 실험을 위한 단백질 분자량 참조
강화된 RNA 추출 키트	온전한 황금 가지	ET111-01v2, 1박스당 50개	조직 및 세포에서 전체 RNA의 추출 및 정제
효소 연결 면역흡착 분석기 리더	미국 바이오텍 회사	Epoch/바이오텍	시료의 사이토카인 및 단백질 함량 정량 검출
FOXP3 일차 항체	비윈 티안 바이오테크놀로지 유한공사	AG5002, 50ul/개	면역 분석을 위한 FOXP3 단백질에 대한 표적 결합
겔 급속 준비 키트	상하이 야메이	PG212, 30세트	전기영동을 위한 분리 겔 및 스태킹 겔의 급속 준비
마손 염색 키트	솔라바오 바이오테크놀로지 유한공사	G1340, 100정	조직 콜라겐 섬유 및 섬유증 관찰을 위한 특이 염색
OVA	베이징 보아오토다 테크놀로지 유한공사	OVA-10g, ≥98%	알레르기 동물 모델 확립을 위한 고전적 알레르겐
일차 항체 희석 용액	비윈 티안 바이오테크놀로지 유한공사	P0256-100ml	일차 항체 희석, 활성 유지 및 비특이적 결합 감소
쥐 IL-10ELISA 키트	앤디 바이오	E-30649, 96T	쥐 IL-10 항염증 인자의 정량 검출
쥐 IL-4ELISA 키트	앤디 바이오	E-30623, 96T	쥐 Th2 염증 인자 IL-4의 정량 검출
역전사 키트	바오리 메디컬 테크놀로지 유한공사	E047-01A	후속 유전자 분석을 위한 RNA의 cDNA로의 역전사
포화 오일 레드 O 키트	솔라바오 바이오테크놀로지 유한공사	G1261, 50mL×2병	조직 지방 방울의 특이 염색 및 검출
상양 항-토끼 이차 항체	프로테인텍 바이오로지컬 유한공사	SA00001-2, 1mL	WB 색상 반응을 위한 토끼 일차 항체에 결합
TBST 버퍼	우한 세웰 바이오테크놀로지 유한공사	G2150, 1L / 병	웨스턴 블롯에서 멤브레인 세척 및 항체 희석을 위한 버퍼
전송 전기영동 시스템	상하이 징칸스 정밀 기계 유한공사	파워팩 베이직	단백질 전기영동 및 웨스턴 블롯 멤브레인 전송에 사용
초저온 냉동고	중커 매링	MDF-382	시약, 단백질 시료 및 조직의 저온 동결 보존
수직 전기영동 탱크	바이오-레드	JY-ZY5	단백질 및 핵산 시료의 수직 전기영동 분리

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