Pectobacterium brasiliense에서 마커리스 유전자 결실 및 고밀도 Tn5 트랜스포존 돌연변이 유발을 위한 독소 기반 역선택 시스템

요약

여기서는 감자 검은다리병과 연성 부패를 일으키는 식물병원체인 Pectobacterium brasiliense에서 무표지 유전자 결손을 생성하고 유전체 전역 Tn5 삽입 돌연변이 라이브러리를 구축하는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 효율적인 역유전분석을 가능하게 하며, 이 유기체에서 병원성 관련 유전자의 기능적 특성 규명을 용이하게 합니다.

초록

펙토박테리움 브라질리엔세는 감자 덩이의 연부패, 검은다리, 공중 줄기 썩음을 일으키는 매우 병원성이 강한 박테리아입니다. 병리성 기전의 규명은 질병 방제에 필수적입니다; 그러나 이 생물에 대한 유전적 도구는 여전히 제한적입니다. 마커 없는 유전자 결실 및 고밀도 Tn5 트랜스포존 돌연변이 유발을 가능하게 하기 위해 독소 기반 역선택 시스템이 개발되었습니다. pLP12 플라스미드에서 유래한 vmi480 독소는 자살 벡터 pKV2를 구성하는 역선택 마커로 사용되었습니다. 이 시스템을 사용해 P. brasiliense SM 균주에서 recA 유전자가 성공적으로 삭제되었습니다. 그 결과 생성된 recA 돌연변이는 pKV2-LLtnp를 가진 RHO3 보조 균주와의 접합을 통해 12,000개 이상의 돌연변이로 구성된 Tn5 삽입 라이브러리 구축의 부모 균주 역할을 했습니다. 이 유도 플라스미드에서는 vmi480 독소가 극성 효과를 줄이기 위해 바깥쪽을 향한 LA 프로모터의 조절 하에 과활성 Tn5 전이효소로 대체되었습니다. 고처리량 덩이줄기 접종 분석법을 통해 식물 세포벽 분해 효소 분비를 매개하는 주요 병원성 결정인자인 유형 II 분비계 내 삽입 등 병원성 결핍 돌연변이를 식별할 수 있었습니다. 이 플랫폼은 기능적 유전체학을 지원하며, 경제적으로 중요한 병원체의 병원성 메커니즘 연구를 용이하게 합니다.

서론

P. brasiliense는 Pectobacterium 속 내에서 가장 공격적인 종 중 하나이며, 감자 연부패병, 검은다리병, 공중 줄기 썩음병의 원인 원인입니다^. 이러한 질병들은 세계에서 세 번째로 중요한 식량원이자 중국 농업 생산 시스템의 핵심 요소인 감자에서 약 30%의 수확량 손실을 초래합니다^. 경제적 영향에도 불구하고, P. brasiliense의 병원성을 조절하는 분자 메커니즘은 이 종에 대해 효율적이고 재현 가능한 유전적 조작 도구가 부족해 충분히 이해되지 못하고^{있습니다.}

많은 식물병리성 박테리아에서의 기능적 유전체 연구는 강력한 대립형유전자 교환과 트랜스포존 돌연변이 유발 시스템에 의존합니다; 그러나 P. brasiliense 에 대한 유사한 유전학적 도구는 여전히 제한적이거나 비효율적입니다. 특히, 이 종과 호환되는 효과적인 역선택 마커는 드뭅니다. sacB 유전자는 다양한 박테리아에서 유전자 결실의 역선택 마커로 널리 사용되지만, P. brasiliense 는 선택 과정에서 최대 50%의 자당에 이르는 높은 내성을 보일 수 있습니다⁵. 이러한 내성은 자당이 효소로 전환되어 당에 대한 감수성 부족을 반영하는 것으로 보입니다. 더 나아가, 높은 자당 농도는 해로운 삼투압 쇼크를 유발할 수 있습니다^. 또한, Tn5 트랜스포존 삽입 라이브러리 구축과 같은 효율적인 대규모 돌연변이 유발 방법은 아직 이 생물에 대해 잘 확립되지 않았습니다.

이러한 기술적 한계를 해결하기 위해 독소 기반 카운터 셀렉션 시스템이 개발되었고, P. brasiliense에 대한 견고한 Tn5 돌연변이 유발 스크리닝 워크플로우가 구축되었습니다. 전통적인 자당 기반 방법과 비교할 때, 이 독소 기반 접근법은 선택 엄격성 향상, 이중 교차 사건 식별의 특이성 향상, 교란 삼투압 스트레스 제거 등 뚜렷한 장점을 제공합니다. 유사한 vmi480 독소-항독소 기반 시스템이 비브리오 종⁷에서 선택 장벽을 극복하는 데 성공적으로 도입되었습니다. 확립된 방법론은 미지의 유전자에 대한 고처리량 기능 특성 분석에 매우 적합하며, 관련 연부패 세포세균과에도 적용할 수 있는 다목적 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

1. P. brasiliense에서 마커 없는 recA 결실 돌연변이 생성

1. 표준 DNA 준비 절차를 사용하여 대장균 기증자 균주에서 P. brasiliense SM과 pKV2 플라스미드(항생제 선택 마커 및 다중 클로닝 부위 변형을 통해 유래한 pLP12)에서 유전체 DNA를 추출합니다.
2. 아가로스 겔 전기영동과 나노드롭 분광광도측정을 통해 추출된 유전체 DNA 및 플라스미드 DNA의 품질과 농도를 검증합니다.
3. 플라스미드 pKV2를 37°C에서 EcoRI와 NheI를 이중 소화하여 5시간 동안 선형화합니다. 아가로스 겔 전기영동으로 완전 소화를 확인하고 선형화된 플라스미드를 정제합니다.
4. 유전체 분석 소프트웨어를 사용해 recA 유전자의 상류 및 하류 약 800 bp 영역을 식별하고, 해당 프라이머 쌍인 LBF/LBR 및 RBF/RBR을 설계합니다(본 연구에 사용된 모든 프라이머는 재료 표 참조).
5. 표준 PCR 사이클 조건에서 두 상동족을 증폭하고 PCR 산물을 정제합니다. 50 μL PCR은 일반적으로 2.5 μg의 생성물을 생성합니다.
   참고: 프라이머의 Tm 값과 GC 함량은 상동 영역의 경계를 변경하여 조정할 수 있습니다.
6. DNA 조립 키트를 사용해 정제된 상동족 팔을 선형화된 플라스미드 골격으로 결합하여 재조합 자살 플라스미드 pKV2-recA를 조립합니다.
7. 조립 혼합물을 열충격으로 화학적으로 적합한 E. coli S17-1 λpir 세포로 전환하고, 세포를 LB 배지에서 회수한 후 카나마이신(LB + kan)이 포함된 LB 한천에 플레이트링합니다.
   참고: 최종 사용 농도는 50 mg/mL 카나마이신, 0.2% (w/v) 포도당, 0.3% (w/v) 아라비노스, 0.3 mM 2,6-디아미노피멜릭산(DAP)입니다.
8. 제한 소화 또는 콜로니 PCR을 통해 양성 클론을 검증합니다. (이 연구에서 사용된 모든 미디엄 레시피에 대해서는 재료 표를 참조하세요.)
9. 확인된 pKV2-recA 플라스미드를 추출하여 열충격 변환(예상 변환>률 10⁶ cfu/μg)을 이용해 대장균 WM3064로 변환합니다.
10. LB 한천 위에 카나마이신과 디아미노피멜릭산(DAP)을 포함한 변형체를 선택합니다.
11. 양쪽 부모 접합을 수행하여, 기증자 균주(WM3064 pKV2-recA)와 수혜자 P. brasiliense SM의 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 일반적으로 기증자와 수혜자 세포 1밀리리터당 10⁴ 에서 10⁶ 전환결합체를 생성합니다.
12. 혼합 배양물을 멸균수로 한 번 세척한 후, 혼합물을 LB 한천에 카나마이신과 DAP를 보완한 후 28°C에서 48–72시간 배양합니다.
    참고: 만약 형상 결합체가 관찰되지 않으면, 결합 효율을 높이기 위해 기증자-수혜자 비율을 2:1(v/v)로 높일 수 있습니다. 높은 배경 성장이 관찰될 경우, 혼합 배양물을 멸균수로 두 번 세척하여 잔류 DAP를 제거할 수 있습니다.
13. 접합 혼합물을 회수하여 카나마이신과 포도당(DAP 제외)이 포함된 LB 한천에 플레이트를 올려 역선택을 수행합니다.
14. 6개에서 8개의 군집을 골라 LB + kan과 LB + kan + arabinose 모두에 복제 플레이트를 부착하세요.
15. LB + kan에서는 자라지만 LB + kan + 아라비노스에서는 자라지 않는 군락을 선택; 이들은 첫 번째 크로스오버 후보들입니다.
16. 첫 교차 균주를 확인된 균주를 LB 배지에 접종하고 하룻밤 배양합니다. L-아라비노스가 포함된 LB 한천에 배양물을 플레이트하여 두 번째 상동 재조합을 유도합니다.
17. 여러 군집을 골라 LB + 아라비노스와 LB + kan에 복제 플레이트를 부착하세요. LB + 아라비노스에서는 자라지만 LB + kan에서는 자라지 않는 일부 군락; 이들은 추정되는 RecA 결실 돌연변이입니다.
    참고: 두 번째 교차 사건 이후 콜로니가 관찰되지 않는다면, 박테리아 성장에 있어 표적 유전자의 잠재적 필수성을 평가해야 합니다. 또는 상류 및 하류 상동 영역을 1,200 bp까지 확장하여 상동 재조합 효율을 높일 수 있습니다.
18. RecA 프로모터와 말단기 영역을 가로지르는 증폭을 위해 설계된 프라이머 쌍 checkF/checkR을 사용하여 콜로니 PCR로 recA 돌연변이를 확인하여 표적 유전자의 인프레임 결실을 검증합니다. recA의 정확한 프레임 내 삭제를 확인하기 위해 PCR 산물을 시퀀싱합니다.
19. 성공적인 결실은 PCR 산물 크기의 감소로 표시되며, 이는 야생형 조각 길이에서 삭제된 유전자 구간의 특정 길이를 뺀 값에 해당합니다.

2. P. brasiliense에서 Tn5 돌연변이 유발을 위한 pKV2-LLtnp 구축

1. pMCS2-LLtnp⁸ 의 Tnp 전이체 카세트를 프라이머 쌍 Tnp-F/Tnp-R을 사용해 증폭하고, pKV2에서 oriγR6K Tn5 백본을 프라이머 쌍 ori-F/ori-R을 사용하여 증폭합니다. 모든 PCR 제품은 DNA 정제 키트를 사용해 정제하세요.
2. DNA 조립 키트를 사용해 정제된 Tnp 카세트와 oriγR6K Tn5 백본을 조립하세요. 조립 혼합물을 열충격으로 화학적으로 적합한 E. coli S17-1 λpir 세포로 변환하고, LB 배지에서 회수한 후 카나마이신(LB + kan)을 보충한 LB 한천에 플레이트 부착합니다.
3. ori-F/ori-R 프라이머 쌍과 Tnp-F/Tnp-R을 사용하여 집단 PCR을 통한 양성 클론을 검증합니다.
4. 단일 콜로니를 LB 배지에 접종하고 하룻밤 배양하여 대장균 RHO3 적합 세포를 준비합니다. 배양물을 1:100으로 신선한 LB 배지에 희석하고 OD₆₀₀ 0.6으로 성장시킵니다.
5. 배양물을 얼음 위에 냉각한 후 0.1 M CaCl₂ 염료로 세 번 세척합니다. 최종 펠릿을 500 μL 미리 냉각된 20% 글리세롤에 재현탁하여 −80 °C에서 보관합니다.
6. 검증된 재조합 플라스미드 10 μL(pKV2-LLtnp)을 열 쇼크(예상 형질변환 속도 >10⁶ cfu/μg)로 100 μL RHO3 적합 세포로 변환합니다. 얼음 위에서 30분간 배양하고, 42°C에서 45초간 열충격을 받은 뒤, 얼음 위에서 2분간 식힙니다.
7. 500 μL LB 배지를 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 교반하며 배양합니다. 카나마이신과 DAP(LB + kan + DAP)가 포함된 LB 한천에 플레이트링하여 37°C에서 하룻밤 배양합니다.
8. Tnp-F/Tnp-R을 이용한 콜로니 PCR을 통해 양성 RHO3 형질전환체를 검증합니다.

3. P. brasiliense에서 Tn5 트랜스포존 돌연변이 라이브러리 구축

1. P . brasiliense ΔrecA 를 28°C의 LB 배지에서 배양하고, 37°C에서 카나마이신과 DAP(LB + kan + DAP)를 보충한 LB 배지에서 RHO3/pKV2-LLtnp를 배양합니다. 두 균주 모두 OD₆₀₀ / 1에 도달할 때까지 기다려 주세요.
2. P . brasiliense ΔrecA 100 μL과 RHO3/pKV2-LLtnp 100 μL 혼합물을 원심분리한 후 상청액을 버린 후 세척된 펠릿을 10 μL LB 배지에 재현탁합니다.
3. 재현탁된 혼합물을 DAP를 보낸 LB 한천 플레이트에 위치시키고, 28°C에서 8시간 배양하여 결합을 허용합니다.
4. 접합 혼합물을 1mL 멸균 LB 배지로 플레이트 표면을 헹구어 회수합니다. 원심분리기를 잠시 하고 상원액을 버린 후 LB 미지로 펠릿을 두 번 세척하여 DAP를 제거합니다.
5. 세척된 펠릿을 300 μL LB 배지에 재현탁하고, 카나마이신과 포도당(LB + kan + glucose; DAP 제외)을 보충한 LB 한천에 10배 연속 희석액을 판팅하여 트랜스콘이어간트를 선택한다.
6. 플레이트를 28°C에서 48시간 배양하세요. 다섯 개의 콜로니를 선택해 각각을 콜로니 PCR로 ori-F/ori-R과 Tnp-F/Tnp-R의 프라이머 쌍으로 검증하여 Tn5 트랜스포존의 성공적인 도입을 확인합니다. Tn5가 게놈에 삽입되었는지 확인하기 위해 다섯 군락 모두를 시퀀싱합니다.
   참고: 돌연변이 도서관이 공식적으로 구축되기 전에, 결합판에서 무작위로 6개의 단일 군체가 선택되었습니다. 삽입 부위를 결정하기 위해 플라스미드 구조 분석법이 수행되었으며, 두 가지 다른 제한효소를 별도의 병행 대조군으로 사용했습니다. 총 36회의 시퀀싱 리드가 얻어졌습니다. 단일 Tn5 삽입 사건은 각 개별 콜로니의 6개 삽입 부위가 동일할 때만 검증되었다.
7. 결합 단계를 반복하고 집단 수를 세어 돌연변이 라이브러리 용량을 추정합니다. 전체 라이브러리 크기가 12,000개 콜로니를 초과하여 하위 선별을 위한 충분한 유전체 범위 확보를 보장합니다.
   참고: 돌연변이 유발 빈도가 낮을 경우, E54K/M56A/L372P 돌연변이체와 같은 과활성 Tn5 전이체를 사용하여 전위 효율을 높이는 것을 고려해야 합니다.
8. 6단계에서 얻은 개별 돌연변이 군집을 각 웰당 200 μL LB + kan을 포함하는 96웰 플레이트에 옮깁니다. 플레이트를 28°C에서 하룻밤 동안 인큐베이팅하고 200rpm에서 흔듭니다.
9. 각 웰에 멸균 50% 글리세롤 133 μL을 첨가하여 최종 농도는 약 20%로 만듭니다. 96웰 플레이트는 장기 보존을 위해 −80 °C에서 밀봉 및 보관하세요.

4. 감자 덩이와 대마초 접종을 통한 고처리량 병원성 분석

1. 감자 덩이(cv. Favorita)를 멸균된 물로 헹구고, 75% 에탄올에 잠시 담근 후 깨끗한 작업대에서 자연 건조하세요. 덩이줄기를 ~8mm 두께의 조각으로 썰어 멸균된 90mm 페트리 접시에 넣으세요. 생물학적 복제를 위해 최소 세 조각은 준비하세요.
2. 96웰 돌연변이 라이브러리의 플레이트 배치에 따라 멀티채널 피펫을 사용해 감자 조각에 각 돌연변이 균주당 1μL을 접종합니다. P. brasiliense ΔrecA 를 양성 대조군으로, LB + kan을 음성 대조군으로 포함시켰습니다.
3. 접종된 감자 조각을 28°C에서 7–8시간 배양합니다. ΔrecA 대조군과 비교했을 때 눈에 띄게 감소한 마세레이션 또는 병변 부위가 작아진 돌연변이체가 기록되었습니다. 병변 부적의 길이와 너비를 측정하여 정량화하세요. 이들을 1차 심사 후보로 지정하세요.
   참고: 접종 전에 돌연변이 배양 및 대조군의 OD₆₀₀ 값이 0.8로 정규화되도록 하세요.
4. 2차 선별을 위해 각 후보 균주당 5 μL을 신선한 감자 조각에 접종합니다(한 조각당 6품종, 같은 간격). 각 균주마다 세 개의 생물학적 복제체를 준비하세요. 28°C에서 7–8시간 동안 인큐베이팅하고 병변 크기를 기록하여 감쇠를 확인합니다.
5. LB + kan 플레이트에 줄무늬를 붙여 일관된 병원성 감소를 보이는 분리 균주. 판을 28°C에서 하룻밤 배양하고, 검증된 저감병원성 돌연변이를 4°C에 보관하여 후속 분석을 마칩니다.
6. 전체 식물 검증을 위해 감자 줄기에 150 μL 박테리아 현탁액을 1 x 10⁸ CFU/mL로 정규화하여 접종합니다. 멸균 주사기를 사용해 기저 줄기 부위에 현탁액을 주입하세요. 48시간 후 질병 진행을 관찰하세요. 세 가지 개별 식물에 생물학적 복제를 수행하세요.
7. 블랙레그 질병 등급 척도("6점 순서 척도: 0, 1, 3, 5, 7, 9")를 사용하여 질병 심각도를 점수 부여하고, 질병 지수를 다음과 같이 계산합니다:
   1. 등급 0: 식물 전체에 질병 증상 없음.
   2. 1등급: 줄기 병변이 줄기 둘레의 1/3을 넘지 않으며, 개별 잎이 시들었습니다.
   3. 3등급: 줄기 병변은 줄기 둘레의 절반을 넘지 않고, 잎의 절반 미만이 가벼운 시들음을 보이며, 아래쪽 잎 몇 개에 병변이 있습니다.
   4. 5등급: 줄기 병변이 줄기 둘레의 절반 이상을 덮고 있으며, 잎의 절반 이상이 가벼운 시들음을 보입니다.
   5. 7등급: 줄기 병변이 줄기 둘레 전체를 둘러싸고 있으며, 잎의 2/3 이상이 시들었습니다.
   6. 9등급: 식물의 모든 잎이 시들거나 죽었습니다.
      
8. 확실한 감쇠된 돌연변이체의 장기 저장 재고를 준비하는데, 균열 50% 글리세롤을 최종 농도인 25%로 혼합하여 -80°C에서 보관합니다.

5. 플라스미드 구조를 통한 Tn5 삽입 부위 식별

1. 관심 있는 Tn5 돌연변이를 배양하고 박테리아 유전체 DNA 추출 키트를 사용해 유전체 DNA를 추출합니다. DNA 농도를 정량하여 하위 소화에 필요한 충분한 입력을 보장합니다.
2. 100 μL 반응에 10× 반응 완충제와 5 μL 효소를 포함한 100 μL 반응에서 1–2 μg의 유전체 DNA EcoRI를 소화한 후, 37 °C에서 최소 3시간 배양합니다. 아가로스 젤을 사용해 소화 완료를 확인하세요.
3. 소화된 DNA를 3M 아세테이트 나트륨 1/10 부피와 절대 에탄올 3부피를 첨가하여 침전시킵니다. 충분히 섞어 -20 °C에서 1시간 동안 배양하세요.
4. 13,500 x g에서 원심분리기를 5분간 하고, 75% 에탄올과 절대 에탄올로 순차적으로 세척합니다. 펠릿을 자연 건조시키고 17 μL 멸균수에 재현탁합니다.
5. 소화된 DNA 조각을 10× T4 DNA 리가아제 버퍼 2 μL과 T4 DNA 리게아제 1 μL을 추가하여 자가 연결합니다. 배경 변환을 확인하기 위해 음성 대조군(무리게이제)을 포함하세요. 4°C에서 하룻밤 동안 접속 반응을 배양하여 제한 조각의 원형화를 촉진합니다.
6. 앞서 설명한 열충격 변환을 사용하여 10 μL 연결 혼합물을 화학적으로 적합한 E. coli S17-1 λpir로 변환합니다. LB에서 세포를 1시간 동안 회수한 후 카나마이신(LB + kan)이 포함된 LB 한천에 플레이트하여 Tn5 카세트를 탑재한 플라스미드를 선택합니다.
7. 무작위로 다섯 개의 카나마이신 내성 군락을 골라 표준 플라스미드 미니프렙 키트를 사용해 플라스미드 DNA를 추출하세요. 각 플라스미드 500 ng를 HindIII와 함께 소화하고 37 °C에서 5시간 배양하여 플라스미드 구조를 검증합니다. 아가로스 겔 전기영동을 이용한 소화 패턴을 분석하세요.
8. 플라스미드 밴드 크기가 예상 조각 패턴과 일치하면, Tn5 말단 내에 위치한 5' ME 프라이머를 사용하여 생거 시퀀싱을 수행합니다.
9. BLAST 또는 유전체 분석 소프트웨어를 사용해 Tn5 5'-ME 영역 하류의 50-100 bp 측면 서열을 P . brasiliense SM 게놈과 정렬하여 정확한 Tn5 삽입 부위를 규명합니다.
10. 각 돌연변이체의 다섯 가지 독립적인 시퀀싱 반응이 동일한 유전체 좌표(98% 서열 동일성)에 대응하는지 확인>.
11. 만약 다섯 개의 시퀀싱 반응 중 하나라도 다른 유전체 좌표에 매핑된다면, 이는 해당 돌연변이에 여러 개의 Tn5 삽입 부위가 존재함을 나타냅니다. 이럴 때는 추가 집락을 분석하여 모든 삽입 위치를 파악하세요. 또는 더 명확한 삽입 부위 지도를 얻기 위해 서던 블로팅 또는 전체 유전체 시퀀싱을 수행한다.
12. 모든 시퀀싱 반응에서 단일 일관된 삽입 부위를 가진 돌연변이를 후류 표현형 또는 유전적 분석에 적합한 진정한 Tn5 단일 삽입 돌연변이로 지정한다.

결과

P. brasiliense의 sucB 돌연변이로 인한 불안정성을 극복하기 위해 플라스미드 pLP12의 vmi480 독소를 역선택 마커로 사용했으며, 항생제 내성 카세트를 교체하고 클로닝 부위 구성을 조정하여 수정된 자살 벡터 pKV2(그림 1A)를 구성하였다. 마커 없는 recA 결실 돌연변이를 생성하기 위해, 약 800 bp 크기의 recA 유전자의 좌우 상동암을 pKV2로 클로나링한 후, 이중 교차 재조합을 얻기 위한 2단계 선택 절차를 거쳤습니다. 프라이머 쌍 LBF/RBR과 생거 시퀀싱을 이용한 PCR 검증 결과, 돌연변이와 야생형 간 약 600 bp 차이가 나타나 recA 결손이 성공적으로 확인되었습니다(그림 1B).

recA 돌연변이 균주를 수용 배경으로 사용하여 Tn5 트랜스포존 돌...

토론

이 연구에서 개발된 유전자 조작 전략은 감자의 주요 연부패 병원체인 P. brasiliense에서 기능적 유전체학 가능성을 제공합니다 ^9,10. 독소 기반 역선택 시스템을 자살 플라스미드 골격에 통합함으로써 마커 없는 ΔrecA 돌연변이를 생성했다. 이 접근법은 전통적인 sacB 기반 시스템에 비해 상당한 장점을 제공합니다; SacB는 P. brasiliense의 고유한 자당 내성과 삼투압 민감성 때문에 높은 배경 성장을 보이는 반면, 독소 기반 시스템은 이중 교차 사건에 대해 향상된 선택 엄격성과 높은 특이성을 제공합니다. 결과적으로 생성된 ΔrecA 균주는 비특이적 상동 재조합을 제거하는 안정화된 배경 역할을 하여 이후 트랜스포존 삽입의 유전적 안정성을 보장합니다. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
박테리아 게놈 DNA 추출 키트	세균 게놈 DNA 추출	Tiangen	DP302-02
디아미노피멜산	1 L 매체 내 0.3 mM	Macklin	D836611-5g
DNA 어셈블리 키트	DNA 어셈블리	Vazyme	C116-02
DNA 정제 키트	DNA 정제	Tiangen	DP214-02
카나마이신	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
글루코스	0.2% (w/v)	Aladdin	G116305-250mg
트립톤	1 L 매체 내 10%	OXOID	LP0042B
효모 추출물	1 L 매체 내 5%	OXOID	LP0021B
NaCl	1 L 매체 내 10%	Biofroxx	1249KG001
아가르	1 L 매체 내 15%	Biofroxx	8211GR500
L-아라비노스	0.3% (w/v)	Aladdin	A106196-25g
플라스미드 미니프렙 키트	플라스미드 추출	Tiangen	DP103-02
EcoRI	제한 효소	Yugong Biotech	EG15536
NheI	제한 효소	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	제한 효소	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA 리가제	선형 DNA 자체 순환화	Yugong Biotech	EG15205
원심분리기	RWD	M1324R
PCR 열 사이클러	BIO-GENER	GET3XG
디지털 카메라	SONY	ILCE-7M4
전기영동 시스템	LY	DYY-6C
수조	JOANLAB	WB100-1F
겔 문서화 시스템	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
오토클레이브	Yamato	SQ510C
흔들기 인큐베이터	ZHICHU	ZQZY-AR8
일정 온도 인큐베이터	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
UV-Vis 분광 광도계	HITACHI	U-3900
전기포화기	BIO-RAD	MicroPulser
균주 및 플라스미드
P. brasiliense SM	감자 병원균	연구소 균주 컬렉션
E. coli S17-1 λpir	E. coli 컴피턴트 셀	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	E. coli 컴피턴트 셀	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	E. coli 컴피턴트 셀	연구소 균주 컬렉션
pKV2	수정된 자살 플라스미드	본 연구에서 제작
pLP12	자살 플라스미드	연구소 균주 컬렉션
pMCS2-LLtnp	Tn5을 운반하는 단편을 제공	연구소 균주 컬렉션
pKV2-LLtnp	Tn5 단편을 운반하는 수정된 플라스미드.	본 연구에서 제작
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		맞춤형
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		맞춤형
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		맞춤형
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		맞춤형
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		맞춤형
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		맞춤형
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		맞춤형
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		맞춤형
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		맞춤형
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		맞춤형
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		맞춤형