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방법 논문

순환 세포 스트레스 장력 시스템을 사용하여 골격 줄기세포에 인장력을 가하는 시험관 내 시스템

47 조회수

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DOI:

10.3791/70570

⸱

2026년 6월 12일

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

이 논문에서

요약

마우스 골격 줄기세포(SSC)는 FACS로 분리되어 시험관 내에서 배양되었습니다. SSCs에 순환 인장 기계적 자극을 적용하는 제어 가능한 실험 시스템이 구축되어, 세포 노화 관련 유전자인 p16 과 p21의 발현이 감소했습니다.

초록

뼈는 신체의 물리적 신호에 지속적으로 반응하는 주요 기계에 민감한 기관입니다. 기계적 자극은 골격 발달, 항상성, 손상 수리에 중요한 역할을 하지만, 골격 줄기세포(SSC)가 기계적 스트레스에 어떻게 반응하는지는 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 이 질문에 답하기 위해 우리는 마우스 골막 SSC를 분리하고 기계적 자극을 적용하는 시험관 내 모델을 구축했습니다. 마우스 골막 세포는 처음에 효소 소화로 얻었으며, 이후 표면 표지자를 기반으로 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 SSC가 분리되었습니다. 배양에 부착된 후, SSC는 순환 세포 스트레스-장력 시스템을 이용한 인장 기계적 자극을 받았다. 이 시스템은 배양된 세포에 인장력을 재현 가능하게 하며, 기계적 입력에 대한 SSC 반응을 분석하는 플랫폼을 제공합니다. 이 접근법을 사용하면, 기계적 자극 후 세포 노화 관련 유전자 p16 과 p21 의 발현이 SSC에서 현저히 감소함을 발견했습니다. 이 결과는 인장 자극이 시험관 내 상태에서 SSC의 노화 관련 변화에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 기계적 자극 하에서 SSC 행동을 연구하고 기계적 단서가 SSC 기능에 미치는 영향을 조사하는 데 유용하고 적합한 플랫폼을 제공합니다.

서론

인체에서 가장 크고 중요한 보조 기관인 골격계는 다른 장기들의 부착 부위와 보호를 제공할 뿐만 아니라 운동 기능의 기초이기도 합니다. 따라서 골격계는 내부와 외부 환경으로부터 다양한 기계적 자극에 끊임없이 노출됩니다. 기계적 자극 신호는 뼈 발달과 기능 유지 모두에 필수적입니다. 1893년경부터 뼈 밀도와 뼈가 지닌 기계적 힘 사이에 일정한 양의 상관관계가 있다고 제안되었으며, 이것이 바로 울프의 법칙1입니다. 최근 몇 년간 일부 연구에서는 뼈 2,3,4,5의 정상 발달에 기계적 힘을 지닌 골격계의 중요성이 입증되었습니다. 골격계가 기계적 힘에 반응하는 방식은 부분적으로 뼈 6의 세포 구성 요소에 달려있습니다. 골격계 세포 구성 요소의 85%에서 90%는 골격세포 구성 요소의 85%에서 90%를 차지합니다. 광범위한 분포와 독특한 수지상 세포 형태 덕분에 골세포는 기계적 반응 측면에서 현재 가장 철저히 연구된 골격 세포 유형입니다 7,8. 정골세포가 기계적 힘에 반응하는 능력이 널리 알려져 있을 뿐만 아니라, 골격 전구체 세포도 기계적 힘에 필수적인 역할을 합니다. 연구소 연구소 전구세포가 기계적 신호에 반응하여 운명 변화를 조절하여 조직손상 복구에 영향을 미친다는 사실이 밝혀졌습니다.

골격 줄기세포(SSC)는 자가 재생 능력을 가진 조직 특이적 줄기세포의 한 종류로, 뼈 성장, 유지 및 수리에 필요한 성숙한 골세포 유형으로 분화할 수 있습니다. 2015년에는 쥐 SSC의 표면 표지 유전자가10개로 확인되었습니다. 이후 여러 연구에서 SSC가 뼈 발달, 항상성 유지, 골 손상 수리 등 다양한 측면에서 매우 중요한 역할을 한다는 점도 입증되었습니다11,12. 골격계가 기계적 힘에 반응하는 특성 때문에, 기계적 힘 신호는 골격 줄기세포의 기능을 조절하는 데 필수적인 요소로 간주할 수 있습니다. 기계적 자극 하에서 SSC의 행동 변화를 연구하기 위해서는 시험관 내에서 기계적 힘을 가할 적절한 실험 시스템을 구축해야 합니다.

세포에 대한 시험관 내 기계적 자극의 주요 방법으로는 유체 전단 응력, 압축 응력, 인장력, 정수압, 매트릭스 강성 및 매트릭스 위상이 포함됩니다 6,13. 마우스 SSC의 표면 마커 유전자를 바탕으로, 골절 수리에 관여하는 SSC가 주로 골막14에서 유래하기 때문에 유동 세포분석 방식으로 마우스 페리오스티르 SSC를 얻었습니다. 이후 순환 세포 응력 장력 시스템을 통해 골막 SSC에 적절한 인장력이 가해졌습니다. 인장력 자극 후에는 세포 샘플을 채취할 수 있으며, 전사체 시퀀싱, 프로테옴 시퀀싱, ATAC-seq 등 다중 오믹스 분석이 수행됩니다. 따라서 이 프로토콜을 확립하는 것은 기계적 자극에 대한 SSC 반응을 연구하는 데 견고한 토대를 제공합니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 포함된 쥐 실험들은 모두 중국과학원 상하이생화학 및 세포생물학연구소 동물 관리 및 사용 위원회(SIBCB-S350-2312-41)의 승인을 받았습니다.

1. 쥐에서 골막 세포 분리

  1. 4주에서 6주 된 쥐를 CO₂ 안락사 상자에 넣고 숨이 멈출 때까지 3분간 CO₂에 계속 노출시킵니다.
  2. 쥐 몸 표면을 75% 알코올로 소독하세요. 뒷다리를 분리하기 위해 안과 가위를 사용하세요. 그 후 뾰족한 겸자와 안과 가위를 사용해 뒷다리의 골격근을 제거하여 대퇴골과 경골의 관절 부위가 온전하게 유지되도록 합니다.
  3. 분리된 뼈를 차가운 PBS에 보존한 후, 양쪽 끝에 저녹 아가로스(TAE 완충제 5-10%)를 코팅합니다.
  4. 대퇴골과 경골을 최소 필수 배지 알파(α-MEM)에 1 mg/mL 콜라게나제, 2 mg/mL 디스파제 II, 0.1 mg/mL DNase I를 37°C, 0.3 × g을 30분 두 번 소화합니다. 소화된 세포를 배양지(α-MEM + 10% 태아 소 혈청(FBS))에 수집합니다.
  5. 셀 현탁액을 40 μm 셀 체에 걸러낸 후 500 × g 에서 5분간 원심분리하여 상원액을 제거합니다.
  6. 침전물을 적혈구 용해 버퍼로 2분간 재현탁한 후 유세포 버퍼(PBS + 2% FBS)로 반응을 종료합니다.
  7. 세포를 500 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 상청액을 버리세요. 세포를 1× 107 cells /mL로 유동 세포 버퍼로 재현탁하여 세포 분류를 진행합니다.

2. 형광 활성화 세포 분류

  1. 다음 항체로 세포 현탁액을 염색합니다: PerCP/Cy5.5 접합 항생쥐 CD45, PerCP/Cy5.5 접합 항생쥐 CD31, PerCP/Cy5.5 접합 항생쥐 Ter119, FITC 접합 항생쥐 6C3/Ly-51, Brilliant Violet 605 접합 항마우스 CD90.2, PE/Cy7 접합 항생쥐 CD105, APC 접합 항생쥐 CD200.
  2. 위 항체를 1:500 비율로 희석한 후 빛을 차단한 상태로 얼음 위에 30분간 배양하세요.
  3. 유동세포분석 버퍼로 세포를 세척하고, 형광 활성화 세포 분류기를 이용해 세포 분류를 수행하여 CD45, CD31- Ter119- CD90.2, 6C3, CD105, CD200+ SSC를 얻습니다. 배양지와 함께 분류된 SSC를 수집합니다. FlowJo v10.8.1 소프트웨어로 수집된 데이터를 분석하세요.
  4. 5%CO2 세포 인큐베이터에서 팽창 배양액을 사용해 배양 접시에 분리된 SSC를 확장하세요. 기계적 자극 이전에 한 통로를 수행할 수 있었다.
    참고: 6주 된 쥐 한 쌍당 약 10×5 개의 골막 SSC를 얻을 수 있습니다.

3. SSC의 기계적 자극

  1. 쥐 꼬리 1형 콜라겐을 멸균된 0.02 M 아세트산에 희석하여 최종 농도는 0.15 mg/mL로 만듭니다. 이 용액은 3회 재사용할 수 있으며 4 °C에서 보관해야 합니다.
  2. 6웰 유연 바닥 배양판의 각 웰에 희석된 쥐 꼬리 1형 콜라겐 1.5mL를 첨가합니다. 상온에서 1시간 동안 플레이트를 코팅한 후, 과잉 콜라겐을 흡입한 후 PBS로 한 번 세척하여 나중에 사용하세요.
  3. 참고: 즉시 사용할 때는 잔여 산을 제거하기 위해 플레이트를 PBS로 헹구어야 합니다. 4 °C에서 보관하기 전에 플레이트는 뚜껑을 열고 완전히 건조해야 합니다.
  4. 배양된 마우스 골막 SSC를 소화한 뒤, 500 × g 에서 5분간 원심분리하고, 세포 침전물을 배양 배지에 재현탁하여 세포 밀도를 1 ×10 5 cells/mL로 만들고, 6웰 유연 바닥 배양판의 각 웰에 2mL의 세포 현탁액을 추가하여 세포 인큐베이터에 넣습니다.
  5. 세포 씨앗 후 24시간 후, 유연 바닥 배양판을 늘어진 베이스 플레이트에 놓고, 기계적 힘 자극 없이 다른 유연 바닥 세포 배양판을 대조군으로 유지합니다.
  6. FX-6000 버전 1.0 소프트웨어에서 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 스트레치 강도 8%, 주파수 0.1 Hz, 사각파 파형, 파형 듀티 사이클 80%, 스트레치 지속 시간 12시간.
    참고: 6웰 유연 바닥 배양판을 놓을 수 있는 늘어난 베이스 플레이트에는 네 개의 위치가 있습니다. 실험에 필요한 세포가 4개 미만이라면, 빈 자리는 6웰 유연 바닥 배양판으로 채워야 합니다. 적절한 기계적 자극을 가한 후, SSC는 세포 분화 또는 증식과 같은 기능 검사를 받거나, 다중 오믹스 시퀀싱을 위해 샘플을 추출할 수 있습니다.

4. 실시간 정량 PCR(RT-qPCR)

  1. 세포에 대한 기계적 자극이 완료된 후, 배양지를 버리고 PBS로 세포를 한 번 세척한 뒤, TRIzol 시약으로 총 RNA를 추출한 후 RNA 역전사를 수행합니다.
    참고: RNA 추출이 완료된 후에는 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 역전사로 얻은 cDNA는 -20°C에서도 저장하여 후속 검사를 할 수 있습니다.
  2. 실시간 PCR 시스템으로 RT-qPCR을 수행하세요. 사용된 프라이머 세트는 다음과 같습니다:
    HPRT: 포워드 5'-GTTAAGCAGTACACCCCAA-3',
    hprt: 역방향 5'-AGGGCATATCACAACAACAACTT-3',
    p16: 전방 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
    p16: 역방향 5'-GCACCGTAGTTGAGCAGAAG-3',
    p21: 포워드 5'-GCCTGGTTCCTTGCCACTTCTT-3',
    21쪽: 후면 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. 기계적 응력의 단기 처리 효과

  1. FX-6000 버전 1.0 소프트웨어에서 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 스트레칭 강도 8%, 주파수 0.1 Hz, 파형은 사각파, 파형 듀티 사이클 80%. 세포는 기계적 장력 자극 후 10분과 60분 후에 RIPA 용해 완충제(인산효소 억제제 및 프로테아제 억제제 혼합)로 용해됩니다.
  2. Erk와 p-Erk 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하세요.

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결과

이 프로토콜 구현 이후, 인장력이 쥐의 골막 SSC에 성공적으로 가해졌습니다. 첫째, SSC는 생쥐의 골막에서 유세포분석을 통해 얻었습니다. 유세포검사 결과는 골막에 있는 SSC의 비율이 Lin-(CD45-, CD31-, Ter119-) CD90.2-6C3-(그림 1)의 거의 30%를 차지하며, 이는 골수보다 훨씬 높음을 보여주었다. 골막 SSC가 뼈 발달과 골절 수리에 중요한 역할을 한다는 점을 고려할 때14,15. 기계적 자극에 반응한 후 골막 SSC의 변화를 완전히 분석하는 것이 필요합니다.

기계적 힘 자극 후 세포 돌리의 SSC에서 일어난 변화를 감지하기 위해,

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토론

최근 몇 년간 뼈의 다양한 부위에서 발견된 골격 줄기세포 표지 유전자가 지속적으로 발견되었습니다. 그러나 SSC의 직접적인 조절에 관한 연구는 특히 기계적 힘 자극 조절 측면에서 아직 심화가 필요합니다. 지금까지 골격 줄기세포/전구세포의 기계적 조절 효과에 대한 연구는 주로 Piezo1 녹아웃 마우스 모델 9,18의 구축에 기반하고 있으며, 기계적 자극 하에서 SSC에서 어떤 변화가 일어났는지에 대한 직접적인 증거는 아직 부족하다. 순환 신장 시스템은 시험관 배양 세포에 대해 정밀하고 통제 가능하며 반복 가능한, 정적 또는 주기적 스트레스 변화를 제공할 수 있어, 세포...

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공개 사항

저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

중국 과학원 상하이 생화학 및 세포생물학 연구소의 유세포 분석 핵심 시설과 동물 중심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가자연과학기금(32471190, 82502903)과 하이난성 외국 전문가 프로그램(506068033010)의 지원을 받았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
α-MEMCorning10-022-CV골막 세포 분리
APC anti-mouse CD200BioLegend123809SSCs 분리
BioFlex 6-Well 배양 플레이트 FlexcellBF-3001A세포 배양
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317SSCs 분리
CollagenaseSigmaC0130골막 세포 분리
Dispase IISigmaD4693골막 세포 분리
DNase ISigmaDN25골막 세포 분리
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701SSCs 분리
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305SSCs 분리
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 세포 장력
플로우 사이토미터 분리기BDBD FACSAria FusionSSCs 분리
MesenCult 확장 키트 (마우스)Stem cell05513세포 배양
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409SSCs 분리
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522SSCs 분리
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132SSCs 분리
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228SSCs 분리
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236세포 배양
실시간 PCR 시스템Thermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 적혈구 용해 버퍼 Beyotime C3702골막 세포 분리
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022웨스턴블롯
 RIPA 용해 버퍼 ISangon BiotechNO. C500005웨스턴블롯
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010웨스턴블롯
p44/42 MAPK (Erk1/2) 항체 Cell Signaling Technology9102웨스턴블롯
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370웨스턴블롯
```

참고문헌

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