토끼의 각막 상처 수리를 위한 강화 광가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제작 및 외과적 적용

요약

토끼의 각막 기질 상처 수리를 위한 현장 블루라이트-가교 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 제조, 농축 및 적용을 위한 재현 가능한 프로토콜이 제시되었으며, 수술 처리, 부분 족근경 및 수술 후 관리를 위한 절차적 단계를 포함합니다.

초록

이 글에서는 토끼의 각막 기질 상처 수리를 위한 현장 블루라이트-교차결합 가능한 젤라 틴 하이드로겔을 제조, 보충 및 외과적으로 적용하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 전구체는 5% 젤라틴(w/v)과 0.01% 리보플라빈 인산염으로 구성되며, 멸균 및 광 보호 조건에서 준비하고 멸균 여과 후 사용 전 가열하여 주사 가능한 점도를 달성합니다. 인간 양막 추출물 또는 토끼 자가혈청의 선택적 삽입도 상세히 설명되어 있습니다. 필요에 따라 블루라이트를 이용해 λ = 420–480 nm 거리에서 총 2분간 겔화가 촉발됩니다. 생체 내 방법은 재현 가능한 전방 기질 각막절제술(트레핀 직경 6.5mm; 깊이 약 187 μm)을 포함하며, 이어서 하이드로겔 충전, 광 활성화, 부분 측면 족근술을 통해 치료를 안정시키고 상처 치유를 촉진하며 수술 후 관리를 표준화합니다. 대표적인 시험관 내 결과는 젤 유사 점탄성 거동과 전단 희석 및 빠른 회복, 그리고 500 nm 이상 광투과율(> 90%)을 보여 각막 사용 적합성을 나타냅니다. 생체 내에서 하이드로겔 기반 치료는 점진적인 상피 폐쇄, 우수한 안구 내성(3일 및 7일 드레이즈 점수 낮은 ), 생분해 및 조직 대체와 일치하는 가시적 수상겔 손실을 지원합니다. 재현성을 보장하기 위해 용해 및 여과 시 온도 조절, 빛으로부터의 보호, 가교 연결 시 램프 위치 지정 등 중요한 단계와 일시정지 지점이 강조됩니다. 이 프로토콜은 봉합 없이 정밀하게 배치된 빛 활성화 하이드로겔 안정화를 가능하게 하며, 여러 생체 활성 보충제 추가와 호환됩니다. 차세대 안과 생체재료의 전임상 평가를 위한 실용적인 플랫폼을 제공하며, 각막 상처 수리를 위한 광가교 수소겔 치료의 번역을 용이하게 합니다.

서론

각막은 투명하고 무혈 구조로, 눈의 굴절력의 약 3분의 2를 차지하므로, 구조적·기능적 완전성이 시력에 필수적입니다¹. 외부 환경에 직접 노출되기 때문에 각막은 외상, 감염, 화학적 손상, 수술 후 합병증에 매우 취약합니다 ^2,3. 상피 완전성을 신속하고 효과적으로 회복하지 못하면 지속적인 상피 결손(PEDs)과 만성 각막 궤양으로 이어지며, 궁극적으로 기질 용융, 천공, 흉터, 돌이킬 수 없는 시력 손실로 이어질 수 있습니다 ^4,5. 기존의 치료법—윤활제, 항생제 예방요법, 자가혈청 점안액 등—은 중등도에서 중증 결손에서 기질 회복을 충분히 촉진하지 못하는 경우가 많으며, 부분적인 이점만 제공하는 경우가 많습니다 ^6,7,8.

이러한 한계를 해결하기 위해 생체재료 기반 치료법이 상처 보호, 상피 수리 지원, 기^{질 조직 복원} 능력 9,10,11,12,13,14 등 유망한 대안으로 떠올랐습니다. 하이드로겔은 생체 적합성, 광학 투명성, 조절 가능한 기계적 거동, 치료제 포함 능력 덕분에 특히 매력적입니다. 젤라틴 ^15,16,17, 콜라겐 ^18,19, 키토산^20,21, 폴리에틸렌글리콜(PEG)^22,23, 히알루론산^18,24 등 천연 및 합성 하이드로겔 모두 각막 상처 치유 촉진에 잠재력이 입증되었습니다. 이 중 젤라틴 기반 하이드로겔은 콜라겐 유래 조성과 고유한 세포 부착 모티프 덕분에 특히 가치가 높습니다.

광 가교 수소겔은 안구 표면에서 직접 필요 시 고화가 가능해 봉합사 없이도 정밀한 배치와 기계적 안정성 향상을 가능하게 하는 추가 장점을 제공합니다. 원뿔 각막 치료를 위해 개발된 리보플라빈 매개 가교결합은 우수한 생체 적합성, 안과 안전성, 가시광선 또는 자외선 하에서 가교를 유도하는 활성 산소 종 생성 능력 덕분에 최근 하이드로겔 광중합에 적용되었습니다^25,26. 청색광(≈445 nm)은 특히 각막 적용에 유리하며, 자외선 관련 위험을 피하면서 효율적인 가교를 가능하게 합니다 27,28,29.

본 글에서는 5%(w/v) 젤라틴과 0.01% (w/v) 리보플라빈 인산(RFP)으로 구성된 광가교결합 가능한 하이드로겔의 제작, 농축 및 외과적 적용을 소개합니다. 시험관 내 하이드로겔 준비에 대한 상세한 프로토콜이 제공되며, 인간 양막 추출물(HAMe) 또는 자가혈청(AS)의 선택적 삽입과 토끼 기질 각막절제술 모델에서의 생체 내 적용도 포함됩니다. HAMe는 안구 표면에 항염증, 항섬유화, 재생 촉진 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있으며, 30,31,32,33,34,35이며, 자가혈청은 상피 재생에 필수적인 비타민 A, EGF, 피브로넥틴 및 기타 성장 인자의 눈물과 유사한 농 도를 제공합니다 36,37,38. 이 요소들은 함께 재상피화를 지원하고 염증을 줄이며, 기질 분해를 잠재적으로 방지할 수 있습니다 ^39,40.

설명된 접근법은 제어된 광중합과 맞춤형 생체 활성을 제공하지만, 현재 적용 범위는 표재 및 중간 기질 결손에 한정되어 있으며, 청색광에 대한 시야 노출이 필요해 불투명하거나 깊게 침투된 조직에서의 사용이 제한될 수 있습니다. 하이드로겔 준비 및 농축, 안과 취급, 부분 측측 족근지 치료를 포함한 수술 후 관리를 통합함으로써, 본 논문은 각막 수리를 지원하고, 빛 활성화 하이드로겔 기술을 임상 실무로 전환하며, 각막 재생 연구를 위한 표준화된 플랫폼 개발에 기여하는 재현 가능한 접근법을 제시합니다.

프로토콜

인간 태반은 헬싱키 선언에 따라 기증자로부터 충분한 동의를 받아 획득되었으며, 크루세스 대학교 병원 윤리 위원회(승인 번호 CEIC E15/03)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험은 바스크 대학교 동물 연구 윤리 위원회(UPV/EHU)의 승인을 받았으며(승인 번호 CEEA M20/2023/038), 안과 및 시각 연구에서 동물 사용을 위한 ARVO 성명을 준수하였습니다. 모든 절차는 UPV/EHU 동물 시설(SGIker)에서 진행되었으며, 전반적으로 멸균 기술을 유지하였습니다(생물학적 제제 취급 시 클래스 II 생물안전 캐비닛).

1. 하이드로겔 합성

1. 젤라틴-리보플라빈 전구체 용액 (5% 및 10% w/v)
   참고: 어두운 조명 아래에서 작업하거나 알루미늄 호일로 감싼 호박색 병 또는 용액을 빛으로부터 보호하세요. 생물학적 용도로 사용될 경우 모든 과정을 층류 후드 내에서 멸균 조건에서 수행하세요.
   1. 필요한 젤라틴 및 리보플라빈 인산염(RFP) 양을 계량하세요: 5% (w/v) + 0.01% (w/v) RFP 전구체 10 mL의 경우, 젤라틴 500 mg과 RFP 1 mg의 무게를 무게로 측정합니다. 10% (w/v) + 0.02% (w/v) RFP 스톡 30 mL의 경우, 젤라틴 3g과 RFP 6 mg의 무게를 측정합니다.
   2. 젤라틴과 RFP를 해당 부피의 탈이온수(최종 부피의 ≈90%)에 첨가합니다. 분말이 완전히 분산될 때까지 부드럽게 저어줍니다.
   3. 1 M NaOH를 사용해 pH를 7.0으로 조정하고, 염기를 드롭 방향으로 추가하면서 pH를 모니터링합니다. 사용한 NaOH의 부피와 최종 조정된 부피를 기록합니다. pH 조정 후, 용액을 탈이온수와 함께 최종 부피로 옮깁니다.
   4. 용액을 80°C에서 200rpm 자기 저어주며 30분간 용액을 용해하고 균질화합니다.
      참고: >70–80°C)의 뜨거운 용액은 내열 장갑을 착용하여 다루세요.
   5. 용액을 30–40°C까지 식힌 후 0.22 μm 폴리에테르설폰(PES) 친수성 멤브레인 필터를 통해 멸균 호박 병에 담아야 합니다.
      참고: 필요 시 여과 전에 점성 용액을 부드럽게(≈ 40–50 °C) 가열하세요; 과열을 피하세요.
   6. 병에 조성, 날짜, 운영자 이니셜을 적으세요. 여과된 하이드로겔 용액은 사용 전까지 4°C에서 보관하며, 보관 기간이 준비 시점부터 2주를 넘지 않도록 하세요.
2. 젤라틴 하이드로겔 보충 (최종 용량: 10 mL)
   1. 4절과 5절에 설명된 절차에 따라 자가혈청(AS) 또는 인간양막 추출물(HAMe)을 제조하십시오. 추출물은 사용 전까지 멸균되고 냉장 상태로 보관하십시오.
   2. 농축된 하이드로겔 10mL당 10% 젤라틴 + 0.02% RFP 스톡 5mL와 해당 생물학적 추출물(AS 또는 HAMe) 5mL를 혼합합니다.
      참고: 필요 시 여과 전에 점성 용액을 부드럽게(≈ 40–50 °C) 가열하세요; 과열을 피하세요.
   3. 따뜻한 용액을 0.22 μm PES 친수성 멤브레인 필터로 걸러내어 멸균 호박 병에 담그세요.
   4. 하이드로겔은 라벨을 붙여 4 °C에서 보관하여 사용 후까지 보관하세요. 보관 기간이 준비 시점부터 2주를 넘지 않도록 주의하세요.
      참고: 모든 폐기물은 기관 생물안전 규정에 따라 처리해야 합니다.

2. 시험관 내 하이드로겔 적용

1. 1절에 설명된 하이드로겔 제형을 준비하여 적용 전에 32 °C에서 유지하여 적절한 점도를 유지하세요.
2. 멸균 기법을 사용하여 목표 웰, 몰드, 접시 또는 기판에 필요한 양의 하이드로겔을 피펫으로 주입합니다(그림 1A).
3. Led-C 경화램프를 하이드로겔 표면에서 2cm 위에 위치시킵니다. 하이드로겔을 청색광(λ = 420–480 nm)과 850-1000 mW/^{cm 2}의 빛 출력에 노출시켜 총 2분 동안 현장 가교를 시작합니다. 조명을 20초씩 6번 펄스로 전달하며, 펄스 사이에 5–10초의 정지를 삽입하여 국소 가열을 방지합니다(그림 1B).
4. 완전한 겔화를 육안으로 확인하고, 멸균 기기로 표면을 부드럽게 만져 고체적이고 조작 가능한 하이드로겔 형성을 보장합니다(그림 1C,D).
5. 가교 하이드로겔은 즉시 사용하거나 4 °C에서 무균 조건에서 저장하여 하류 적용에 적합합니다.
   참고: 시술 내내 무균 기법을 유지하세요. 피부나 눈을 직접 블루라이트 방사선에 노출하지 마세요.

3. 인간 양막(HAM) 획득

참고: 혈청음성 기증자에게서 받은 태반은 사전 동의를 제공하고 기관 및 윤리적 요건을 충족하는 경우만 사용하세요.

1. 기증자 자격 및 동의
   1. 각 기증자가 HIV 1형 및 2형, B형 및 C형 간염, 매독에 대해 음성 검사를 받았는지 확인하세요.
   2. 수술 전에 각 기증자로부터 서면 동의서를 받으세요.
   3. 건강한 기증자의 선택적 제왕절개 직후 즉시 인간 태반을 채취하세요.
2. 수집 및 초기 처리
   1. 출산 직후 각 태반을 멸균된 스테인리스 용기에 담아 수집하세요.
   2. 수술실에서 태반을 멸균 식염수로 광범위하게 헹구어 혈전을 제거합니다. 양수(양수강을 감싸는 가장 안쪽의 투명한 막)를 확인하고, 멸균 겸자를 사용해 태반 가장자리 쪽으로 부드럽게 벗겨 융모막에서 조심스럽게 분리합니다.
      참고: 막을 조심해서 찢어지지 않도록 주의하세요.
   3. 완전히 분리된 후에는 무균 니트로셀룰로오스 필터 조각을 HAM 기질 표면에 부착하여 조작을 용이하게 하고 분할을 표준화합니다. HAM을 세 개의 정의된 영역으로 나누세요(그림 2A, B): 원위 양막: 폭 10cm, 내측 양막: 폭 10cm, 근위 양막: 태반 가장자리까지 연장된 단면.
3. 교통
   1. 각 HAM 조각을 멸균 병에 넣고, 1.25 μg/mL 암포테리신 B, 50 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/mL 네오마이신이 보충된 둘벡코 변형 이글 배지(DMEM)에 담가둡니다.
   2. 각 병에 기증자 코드, 날짜, 원산 부위(원위, 내측, 근위)를 명확히 라벨링하세요.
   3. 샘플을 즉시 실험실로 운송하는데, 깨끗하고 무균 냉장 조건(4°C)에서 이루어집니다.
      참고: 막은 UN 3373(생물학적 물질, B등급)을 준수하는 밀봉된 삼중 포장으로 운송하며, 인간 조직을 규율하는 기관 생물안전 규정에 따라 운송해야 합니다.
4. 실험실 처리
   참고: 이후 모든 단계는 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 조건에서 수행하십시오.
   1. 멸균 가위를 사용해 각 원위, 내측, 근위 HAM 조각을 4.0–4.5 × 4.0–4.5 cm 크기의 정사각형으로 절단합니다.
   2. 앞서 언급한 항생제 보충제 DMEM에 조각을 담가 후, 멸균 클램프로 부드럽게 닦아 혈액 잔류물을 제거합니다. 50 μg/mL 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM에 2 x 5분간 세척합니다.
   3. 항생제 없이 DMEM에서 2분씩 5분간 세척하세요.
   4. 이 선정된 조각들을 멸균 인산염 완충식염수(PBS)로 세척합니다.
   5. 각 조각을 배양 배지 없이 5mL 멸균관으로 옮깁니다. 샘플을 –80 °C에서 직접 냉동하여 추가 사용 후에야 합니다.

4. 인간 양막 추출물(HAMe) 제제

참고: 단백질 분해와 오염을 최소화하기 위해 모든 과정을 무균 및 냉각 조건에서 수행하십시오.

1. −80°C에 저장된 인간 양막(HAM) 조각이 담긴 튜브를 회수합니다. 조직을 단단하게 하기 위해 액체 질소에 5분간 담그십시오.
2. 각 얼린 조각을 미리 냉각된 절구(−80 °C)에 옮긴 뒤, 공으로 완전히 으깨서 부드럽고 균질한 가루가 될 때까지 만듭니다.
3. 분말 샘플을 즉시 밸런스 플레이트 위에 계량하여 해동을 최소화하세요. 무게 가루를 5mL 튜브로 옮긴 후, 5 μL/mg 프로테아제 억제제 혼합물을 보충한 3 mL의 PBS 샘플에 재현탁합니다.
   참고: 단백질 완전성을 유지하기 위해 가공 중에는 모든 튜브를 얼음 위에 보관하세요.
4. 초음파 검사기와 직경 1.5mm 프로브를 사용해 각 샘플을 90% 진폭으로 20분간 초음파 처리하며, 과열 방지를 위해 15초 온/15초 오프 사이클을 적용합니다.
5. 용해액을 3,000 × g 온도에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 펠릿을 건드리지 않고 상상액을 조심스럽게 수집하세요.
6. 상청액을 0.22 μm PES 친수성 멤브레인 필터로 무균 상태로 여과합니다. 여과된 HAMe를 0.2 mL 마이크로튜브에 알리코트(aliquot)로 분리합니다. 알리코트는 −80 °C에서 보관하여 추가 사용 후까지 보관합니다.
   참고: 보관 기간이 준비 시점부터 6개월을 초과하지 않도록 주의하세요.

5. 토끼로부터 혈액 유래 자가혈청 추출

참고: 뉴질랜드 백토끼(≈2kg)의 생체 내 검사 절차는 해당 기관의 동물 연구 윤리 위원회 승인을 받고 기관 지침을 준수하여,

1. 정맥 천자 부위에 리도카인(국소 또는 피하)으로 국소 마취하세요.
2. 중앙 귀동맥에서 혈액을 4.5mL 혈액 채취관에 모으고, 이 튜브에는 폴리머 젤 분리기가 포함되어 있습니다(그림 3A,B). 혈액이 2시간 동안 RT에서 교란 없이 응고되도록 두세요(그림 3C).
3. 샘플을 1,000 × g 에서 15분간 RT 원심분리합니다. 토끼 자가혈청(AS)을 구성하는 상청액(혈청)을 채취합니다(그림 3D).
4. 0.22 μm PES 친수성 멤브레인 필터로 세럼을 걸러냅니다. 멸균 0.2 mL 튜브에 분리하여 −80 °C에서 보관하여 사용 시까지 보관합니다.
   참고: 보관 기간이 준비 시점부터 6개월을 초과하지 않도록 주의하세요.

6. 체내 수술 절차

참고: 해당 기관의 동물 연구 윤리 위원회에 따라 모든 실험 절차를 수행하며, 헬싱키 선언과 안과 및 시각 연구에서 동물 사용을 위한 ARVO 성명의 원칙을 준수하십시오.

1. 수술 전 준비
   참고: 뉴질랜드 화이트 래빗(≈2kg)을 동물 모델로 사용하세요.
   1. 수술 전에는 동물의 허벅지에 근육 주사를 통해 전신마취를 투여하는데, 케타민 1 mL/kg(50 mg/mL)과 자일라진(Xylazine) 0.3 mL/kg(20 mg/mL)를 사용하세요. 각막과 발 반사가 없는지 확인한 후 진행하세요.
   2. 동물을 무균 수술 플랫폼에 옆으로 데큐비투스 자세로 놓고 포비돈-요오드 용액으로 주위 주변을 소독합니다. 수술 중 안구 표면의 지속적인 노출을 유지하기 위해 수술 눈에 눈꺼풀 질경을 착용합니다.
2. 전방 기질 각막절제술
   1. 토끼 각막에 직경 6.5mm 진공 트레핀을 중심에 놓습니다(그림 4A). 흡입을 가해 장치를 안정시키고 트레핀을 3/4회전시켜 대략 187 μm의 기질 깊이를 달성합니다.
   2. 초승달 모양 칼날을 사용해 두개골 부위 내에서 상피층과 전면 기질층을 제거하여 매끄러운 상처층을 얻을 때까지 시행합니다(그림 4B).
3. 생체 내 하이드로겔 적용
   1. 각막 결손부에 해당 수소겔 제형 50 μL을 32 °C로 예열하여 최적의 점도를 확보합니다(그림 4C).
   2. 각막 표면에 청색광(λ= 420–480 nm)을 2분간 비추어 현장 가교 를 시작하세요. 국소 가열을 제한하기 위해 각막 표면에 5–10초의 정지기를 두고 20초 펄스 펄스 6회를 전달합니다(그림 4D).
4. 측면 부분 족근절
   1. 관찰과 치료를 위해 안쪽 노출을 위해 위아래 눈꺼풀 가장자리의 비강 3분의 1을 식별하세요.
   2. 첫 번째 봉합사를 삽입합니다(눈꺼풀 길이와 안정성에 따라 1–2봉합 사용 가능)(그림 4E).
      1. 겸자로 외눈꺼풀 윗부분 가장자리를 잡으세요. 바늘을 피부 쪽에서 결막 쪽으로 회색선/눈꺼풀 가장자리를 통과시키며, 가능한 한 족골판에 깊게 침투하지 않도록 전층 물어보세요.
      2. 결막 쪽에서 피부 쪽으로 하꺼풀 가장자리의 해당 지점을 바늘로 통과시켜 눈꺼풀 가장자리의 부착을 만듭니다.
      3. 봉합선을 단단한 외과의용 매듭과 두 개의 사각형 매듭으로 묶으면, 피부 표면의 매듭은 눈꺼풀 가장자리 바깥쪽에 약간 위치하도록 유지하세요.
      4. 추가 안정성이 필요하다면 첫 번째 봉합사보다 약 3–4mm 안쪽에 두 번째 봉합사를 삽입할 수 있으며, 동일한 전층 U자형 봉합사나 간단한 중단 봉합을 사용하세요.
      5. 자극을 줄이기 위해 봉합선 꼬리를 3–4mm 간격으로 다듬고, 나중에 제거할 수 있도록 충분한 길이를 남겨둡니다.
      6. 눈꺼풀 부착물이 치료된 각막을 보호하면서도 내측 및 측두막 결막/각막에 접근하여 검사와 안약 치료를 가능하게 하는지 확인하세요. 족근즙이 지나치게 조이지 않고, 동물의 눈꺼풀이 허혈성이 없는지 확인하세요(그림 4F).
5. 수술 후 모니터링 및 관리
   1. 케라테절제술 전에 0.05 mg/kg의 부프레노르핀을 피하 주사로 투여하여 72시간 동안 12시간마다 투여하여 진통을 제공합니다.
   2. 감염을 막기 위해 상처가 완전히 봉합될 때까지 하루 두 번 3 mg/mL 토브라마이신 안약을 주사하세요.
   3. 각막 수분을 유지하기 위해 0.2% 히알루론산(HA) 인공눈물을 하루 네 번 모든 눈에 바르세요.
   4. 봉합선 느슨함, 감염, 국소 조직 괴사, 과도한 긴장 징후가 있는지 최소 하루 두 번 발톱을 점검하세요. 동물의 정상적인 행동, 섭식 여부, 안구 불편함 징후를 관찰하세요.
   5. 수술 후 72시간에 봉합 매듭을 자르고 겸자로 각 봉합사를 부드럽게 빼내며, 결막 표면에 오염물질이 끌리지 않도록 주의하세요.
   6. 눈꺼풀 가장자리의 치유 여부와 각막 표면의 상피 완전성을 검사하십시오. 상피가 완전히 닫힐 때까지 필요한 시술을 계속하십시오.
   7. 3일째부터 7일째까지 안구 치유 및 임상 징후를 모니터링하고 기록하며, 슬릿 램프 현미경과 형광 염색을 사용하여 상피 폐쇄, 불투명도, 신생혈관 형성을 평가합니다.
      참고: 허혈, 상처 열열, 심한 자극 징후가 나타나면 즉시 봉합사를 제거하고 적절히 관리하세요.
6. 급성 안구 자극 평가
   1. 수건이나 담요 랩으로 토끼를 부드럽게 제압하세요. 먼저 흰 빛 아래에서 홍채와 결막을 살펴보세요.
   2. 결막 발적, 혈증(부종), 분비물을 드레이즈 척도에 따라 점수를 부여합니다( 표 1 및 표 2 참조).
   3. 데이터시트에 6가지 드레이즈 매개변수를 모두 기록하세요. 안구 자극 지수(OII)를 구성 요소 점수의 합으로 계산합니다; OII는 0에서 110까지 범위가 높을수록 자극이 더 심함을 나타냅니다.
   4. OII를 기반으로 한 Kay–Calandra 범주에 따라 각 눈을 분류하고; 데이터셋에 해당 범주를 기록합니다.
7. 상처 치유의 사진 기록
   1. 하막낭에 5 μL의 형광 용액을 주입합니다.
   2. 눈을 청색광으로 비추고 각막 불투명도(밀도와 면적)와 형광 착색 정도를 평가합니다.
   3. 수동 화이트 밸런스 조정, 광학 줌 비활성화, 눈에서 약 3cm 떨어진 곳에 카메라를 설정하여 세션 간 동일한 매개변수로 모든 이미지를 촬영합니다. 블루라이트 조명과 불가운 조명 중 형광 주입 후 상피 결손을 구분하기 위해 이미지를 촬영하세요. 0일차(족근절 전)부터 3일차(족근절 제거 후)부터 완전 상피 폐쇄까지 매일 이미지를 촬영합니다.
   4. ImageJ 소프트웨어로 이미지를 분석하고 형광 염색 영역의 면적을 정량화하세요.
      참고: 1일차와 2일차의 사진 기록은 부분 족근경 때문에 일반적으로 불가능합니다. 1일차와 2일차의 이미지가 데이터셋에서 누락되었음을 표시하고, 부작용 사례(예: 우발적 각막 마모)를 보고하십시오.
8. 안락사와 조직 채취
   1. 21일째(양쪽 눈 평가 기간이 끝난 후)에 케타민(2 mL/kg)과 자일라진(0.6 mL/kg)을 근주사로 심하게 마취합니다.
   2. 가장자리 귀정맥에 10mL 포화 염화칼륨(KCl)을 정맥 주사하여 안락사시키십시오.
   3. 조직 채취에 들어가기 전에 사후 경직과 생체 반사 부재로 사망을 확인하세요.

결과

하이드로겔 합성 및 특성 분석
하이드로겔은 합성 및 시험 관 내에서 광가교 전후 유변학적 및 광학적 특성을 평가하였다. 전단 유변학을 이용해 점탄성, 항복 및 유동 거동을 특성화하였다. 주파수 스윕 결과 모든 시험 주파수에서 G′가 G"보다 높게 유지되어 고체 유사 거동을 나타냈다(그림 5A). 10 rad·s⁻¹ 에서의 진폭 스윕은 넓은 선형 점탄성 영역(~100% 변형률)을 보여주었으며, 저장 탄성률(G′)이 손실 탄성(G")을 지속적으로 초과하여 젤 구조를 나타냈다(그림 5B). 블루라이트 가교 이전에 수행된 유동 스윕에서는 전단 희석 현상이 나타나며, 전단률이 10^⁻4 에서 100 s⁻¹로 증가함에 따라 점도가 현저히 감소하여 주입 조건을 모방했다...

토론

본 프로토콜은 각막 상처 치유를 위한 광가교결합 가능한 젤라틴-리보플라빈 하이드로겔의 준비, 로딩 및 적용을 위한 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다. 일관된 겔 품질을 달성하기 위해 여러 시험 관 내 단계가 중요하며, 변동성의 가장 빈번한 원인이기 때문에 강조할 만합니다. 첫째, 교반 시 전구체 용액을 80°C에서 유지하면 젤라틴과 리보플라빈 인산염이 완전히 용해되어 광학 투명도와 가교 균일성을 저해하는 입자 집합체를 방지합니다. 무균 여과 전에 제형을 40°C로 재가열하여 완전한 유동성을 보장해야 하며, 낮은 온도에서의 여과는 불완전한 통과와 오염 위험 증가를 초래합니다. 준비 후 하이드로겔은 4°C에서 빛으로부터 보호한 후 사용 직전 32°C까지 가열해야 하며, 이 시점에서는 반고체 상태를 유지하면서도 파이프로 옮길 수 있어 시험관 및 생체 내 적용 시 누출을 방지합니다. 실제로 이러한 온도 기준 중 어느 곳이든 실...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
양성자제 B	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15290018	최종 농도: 1.25 μg/mL
자가 혈청, 토끼 (AS)	사내 제조	-	전혈로부터 준비; 0.22 μm PES로 여과
블루 LED 경화 램프	Woodpecker Medical Instrument Co	LED.C 모델	파장: λ=420–480 nm; 거리: 1–2 cm; 광출력: 850-1000 mW/cm2
부프레노르핀 (Buprecare)	Ecuphar	578950	용량: 0.05 mg/kg, 피하 주사 12 시간마다 72 시간 동안
카메라	Panasonic	LUMIX TZ35	Leica 광학을 장착한 카메라
Cimarec 디지털 교반 핫 플레이트	Thermo Fisher Scientific	SP131320-33	220-240 V, 최대 온도: 540 °C
초승달 형 외과 용 블레이드	BVI Medical	373807	-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	11966025	-
에펜도르프 튜브 (0.2 mL)	Merck KGaA	30124707	HAMe 준비를 위해 차갑게 유지; 알리 쿼팅
에펜도르프 튜브 (5 mL)	Merck KGaA	30119606	HAMe 준비를 위해 차갑게 유지; 알리 쿼팅
플루오레세인 용액	Novartis	Colorcusi Fluotest	2% 플루오레세인 용액, 5 µl 안약
Gibco 네오마이신	Merck KGaA	N1142	최종 농도: 50 μg/mL
젤라틴 분말	Sigma Aldrich	G1890	80 °C에서 용해; pH를 7.0으로 조정
히알루론산 인공 눈물 (0.2%)	Chem.-pharm. Fabrik GmbH	Hylo-Tear	-
ImageJ 이미지 처리 소프트웨어	National Institute of Mental Health	-	Wayne Rasband가 연구 서비스 분과에서 개발
케타민 (Ketolar)	Pfizer	631028.1
리도카인	Vet One	NDC 13985-222-04	국소 또는 피하 주사
페니실린–스트렙토마이신	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	15140-122	최종 농도: 50 μg/mL
PES 주사기 필터, 0.22 μm0.22μm (Millex)	Merck KGaA	SLGP033RS	-
인산염 완충액 (PBS)	Sigma Aldrich	P4417-100TAB	-
단백질 분해 억제제 칵테일	Sigma Aldrich	P8340	조직 1mg당 5 μL 추가
포비돈-아이오딘 용액	Meda pharma	7167204	수술 전 소독
리보플라빈 인산염 (RFP)	Sigma Aldrich	R0630000	농도: 0.01% w/v (최종); 0.02% w/v (스톡)
소니케이터	Bandelein electronic	Sonoplus GM mini20	-
소니케이터 프로브	Bandelein electronic	MS 1.5	직경 1.5 mm, 길이 63 mm 프로브.
타르소라피 봉합사 (비 흡수성)	Alcon	8065308001	필요한 경우 1–2 봉합
토브라마이신 안과용 용액 (3 mg/mL)	Novartis	Tobrex	투여: 폐쇄까지 1일 2회
Hessburg-Barron 천공술, 직경 6.5 mm	Jedmed	21-8265	-
폴리머 젤 분리기가 있는 진공 혈액 수집 튜브	BD (Becton, Dickinson and Company)	367704	-
실라진 용액	Laboratorios Calier SA	Xylagesic	용량: 5 mg/kg 근육 주사