백발유 초기 배아 발생에서 신생 전사체의 대사 표지

요약

우리는 5-에티닐-우리딘(5-EU)을 사용하여 Xenopus 초기 배아에서 전사체 분석을 위해 신생 전사체를 대사적으로 표지하고 정제하는 상세한 방법을 제공합니다.

초록

초기 배아 발생은 수정 후 처음 휴면 상태였던 접합 유전체에서 접합 유전자의 새로운 전사를 필요로 합니다. 주요 과제는 새로운 전사체를 정확히 검출하고 접합 게놈 활성화(ZGA) 중 발현 시기를 규명하는 것이었습니다. 여기서는 초기 Xenopus laevis 배아에서 5-에티닐-우리딘(5-EU)에 의한 신생 전사체의 대사 표지 작성 절차를 상세히 설명합니다. 수정 후, 5-EU는 1세포 단계 배아에 미세주입되어 ZGA 과정에서 새로 전사된 RNA를 대사적으로 표지합니다. 초기 EU-RNA는 클릭 화학 매개 반응을 통해 비오티닐화 후 정제되며, 차세대 시퀀싱을 통해 초기 전사체가 결정됩니다. 중요한 점은, 이 방법이 낮은 활성화 유전자의 특성화가 가능한 높은 민감도와 특이성을 갖추었다는 것입니다. 따라서 이 접근법은 초기 발달 중 유전자 전사 역학을 연구하는 강력한 도구를 제공하며, 다른 배아 시스템이나 조직에도 일반화할 수 있습니다.

서론

수정 후 배아는 난자에 침착된 모계 인자의 조절 하에 있으며, 접합 게놈은 일정 기간 전사적으로 침묵합니다; 이 유전자는 세포 운명 특정과 생식층 형성 ^1,2,3,4,5,6 등 수백에서 수천 개의 유전자를 전사하기 위해 활성화됩니다. 모체에서 접합체로의 전환(MZT) 과정에서 발생하는 접합자 게놈 활성화(ZGA) 현상은 모든 다세포 종에서 매우 보존되어 있으나, ZGA의 시기는^{종 1, 2, 3, 4, 5, 6}에 따라 다릅니다. ZGA가 어떻게 조절되는지 이해하는 것은 조기 발달의 기본 원리를 이해하는 데 중요할 뿐만 아니라, 발달 장애 진단 및 치료와 생식 건강 증진을 위한 새로운 전략 개발에도 잠재력을 제공합니다.

ZGA 연구의 주요 과제는 새로운 전사체를 정확히 검출하고 접합 게놈 활성화(ZGA) 중 그 발현 시기를 규명하는 것이었습니다. 초기^{배아 7}에서 모체 전사체가 우세하기 때문에, 이러한 전사체의 높은 수준은 ZGA 중 새로운 전사체의 검출을 가릴 수 있으며, 특히 활성화도가 낮은 유전자의 경우, 기존의 대량 RNA-seq를 사용해 발견할 수 있습니다. 이 도전을 극복하기 위해, 우리는 5-에티닐-우리딘(5-EU)으로 신생 전사체를 대사 표지하고, 클릭 화학을 통해 신생 EU-RNA를 비오티닐화하여 정제하여 시퀀 싱(EU-RNA-seq)을 수행하는 방법을 개발^{했습니다.} 4-티오리딘(4sU)^11,12와 같은 초기 전사체 프로파일링 방법과 비교할 때, 5-EU 표지는 클릭 화학을 통해 매우 특이적이며, 영상 및 시퀀싱 모두에 사용할 수 있고 화학적 전환이 필요하지 않습니다. 더욱이, 초기 EU-RNA-seq는 매우 민감하여 수백 개의 유전자를 탐지할 수 있는데, 이는 기존의 대량 RNA-seq⁸로는 감지할 수 없는 유전자입니다. 이 접근법은 또한 개별 접합 유전자 활성화 시기를 정확히 규명하고 초기 배아 발생⁸ 중 ZGA의 뚜렷한 시공간 패턴을 프로파일링할 수 있게 했습니다.

여기서는 Xenopus laevis의 초기 배아를 모델로 하여 신생 전사체를 프로파일링하기 위한 EU-RNA-seq용 샘플 준비 절차를 상세히 설명합니다. 이 프로토콜은 이전 방법^10,13에서 변형되었으며, 5-EU를 1세포 단계 배아에 미세주입하고, 클릭 반응을 이용한 신생 EU-RNA의 비오티닐화, 시퀀싱을 위한 정제(그림 1) 등 절차에 약간의 최적화가 이루어졌습니다(그림 1). 재현성을 보장하기 위해, 초기 배아의 단계별 신생 전사체의 풍부도가 다르기 때문에 총 RNA의 1–10 μg를 입력으로 사용해야 하지만, 더 적은 양도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초파리¹⁴, 제브라피시¹⁵ 등 다른 배아 시스템과 다른 조직¹³에도 적용할 수 있습니다. 이 방법은 유전자 전사와 다양한 생물학적 과정에서 조절 메커니즘을 이해하는 데 강력한 도구이며, 초기 배아 발생의 새로운 원리를 밝혀냅니다.

프로토콜

이 연구에서 기술된 동물 연구는 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험실 안전과 폐기물 처리는 기관 규정을 준수해야 합니다.

1. 시약 및 완충제 준비

1. 20x MMR(마크스 변형 링거) 용액: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 40 mM CaCl₂를 혼합합니다. NaOH로 pH를 7.8로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
2. 3% Ficoll (w/v) / 0.5x MMR: 자석 교반봉으로 부드럽게 저으며 Ficoll 400 1.5g을 0.5x MMR 50mL에 천천히 첨가하여 Ficoll이 완전히 녹을 때까지 합니다. 오토클레이브로 세척하고 사용 전까지 4°C에서 보관하세요.
3. 5-에티닐 우리딘(5-EU) 스톡 용액: 50 mM 스톡 용액을 만들기 위해 372.8 μL의 완충제(미세주입에 적합한 완축제, 예: 1x TBS, pH 7.6 사용 가능)를 5mg 바이알에 첨가합니다. 잘 섞고 2μL 알리코트를 만드세요. -80°C에서 보관하세요.

2. 5-EU의 1세포 배아에 미세주입

1. Xenopus 배아를 얻으려면 표준 프로토콜을 따라 시험관 수정(IVF)을 수행하세요(예: Sive et al., 2007 참조)¹⁶. 배아는 0.1배 MMR로 사용 준비가 되어 있어야 합니다.
2. 표준 유리 슬라이드(25mm x 75mm)로 만든 미세주입 챔버에 3% Ficoll/0.5x MMR 1mL를 첨가합니다. 플라스틱 이식 피펫을 사용해 20개(필요 시 그 이상) 배아를 미세주입 챔버 중앙으로 옮기세요.
3. 가는 핀셋을 사용해 유리 바늘의 아주 가느다란 끝을 조심스럽게 잘라내고, 바늘을 수직으로(끝이 아래를 향한 채) 벤치 벽에 붙이세요. P2 피펫과 마이크로로더 팁을 사용해 유리 바늘 상단에서 50 mM 5-EU 0.5 μL를 추가합니다.
4. 바늘을 마이크로매니퓰레이터에 조립하세요. P10 피펫을 사용해 스테이지 마이크로미터에 10 μL 할로카본 오일을 추가한 후 입체 현미경에 대세요.
5. 주입 부피를 보정하려면 먼저 발로 마이크로인젝터에 연결된 바닥의 패드를 눌러 마이크로미터의 할로카본 오일에 방울을 주입합니다. 방울 크기에 따라 마이크로인젝터의 압력과 주입 시간을 조정하여 주입 부피를 10 nL, 즉 마이크로미터에서 직경 0.27 mm로 결정합니다.
6. 한 손에는 핀셋을 사용해 배아를 잡고, 다른 손으로는 마이크로매니퓰레이터를 잡으며, 1세포 단계에서 50 mM EU 10 nL 주사를 배아에 주입하세요. 배아 내 5-EU의 최종 농도는 ~0.5 mM이다.
7. 미세주입 후에는 플라스틱 이송 피펫을 사용해 주입 챔버에서 3% Ficoll/0.5x MMR이 포함된 새로운 유리 접시로 배아를 옮깁니다. 주입된 배아는 Ficoll에 ~1시간 동안 보관하세요.
8. 피콜 용액을 조심스럽게 제거하고 0.1x MMR로 대체하세요. 배아는 추가 사용 전까지 0.1배 MMR 상태로 유지하세요. 배아의 발달을 지속적으로 관찰하고 필요시 이상 배아를 제거하세요.
9. 배아가 원하는 발달 단계에 도달하면, 플라스틱 이식 피펫을 사용해 10개의 배아를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. P200 피펫을 사용해 튜브 내 잔류 배지를 조심스럽게 제거하고, 배아를 액체 질소에 스냅 얼리세요.
   참고: 엄격성과 재현성을 보장하기 위해, 대조군과 비교해 외관상 정상인 배아만 수집하세요. 이상 배아는 제거하여 추가 분석에서 제외하세요. 필요하다면 음성 대조군과 동일한 수의 배아를 미세주입 없이 채취하세요.
10. 배아는 -80°C 냉동고에 보관하여 추가 사용 후에야 합니다.

3. 총 RNA 추출 및 농도 측정

참고: 초기 배아에서 총 RNA를 분리하려면 실리카막 기반 총 RNA 추출 키트를, RNA 농도를 측정할 때는 형광 기반 고감도 RNA 정량 키트를 사용하세요. 키트에 제공된 지침을 따르면, 다음 단계는 매뉴얼에서 약간 수정된 것입니다. 다음 단계에서 사용되는 모든 용액과 시약은 RNase가 없어야 합니다.

1. -80°C 냉동고에서 샘플을 얼음에 올려 보관하세요.
2. 각 튜브에 RNA 추출 키트에서 버퍼 RLT 700 μL을 추가합니다. P1000 피펫을 사용해 최소 15회 또는 모든 배아가 녹을 때까지 위아래로 피펫을 움직입니다.
3. 샘플을 20분간 얼려 두세요. 배아를 완전히 균질화하기 위해 최소 10회 피펫팅으로 부드럽게 다시 섞으세요.
4. 균질화된 배아에 70% 에탄올 700 μL을 첨가합니다. 피펫을 위아래로 움직여 잘 혼합한 후 700 μL 혼합물을 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
5. 컬럼을 10,000 x g 에서 1분간 원심분리합니다. 플로우 스루를 버리세요. 원심분리기를 반복하여 혼합물이 완성될 때까지 반복합니다.
6. 버퍼 RW1 350 μL을 추가하고 컬럼을 10,000 x g 에서 1분간 원심분리합니다. 플로우스루를 버리세요.
7. 컬럼 내 막 중앙에 80 μL DNase I를 조심스럽게 첨가합니다. 상온에서 15분간 배양하세요.
8. 버퍼 RW1 350 μL를 추가하고 컬럼을 10,000 x g 에서 1분간 원심분리합니다. 플로우스루를 버리세요.
9. 버퍼 RPE 500 μL를 추가하고 10,000 x g 압력으로 컬럼을 1분간 원심분리합니다. 플로우스루를 버리세요. 세탁을 한 번 더 반복하세요.
10. 컬럼을 10,000 x g 에서 다시 원심분리하여 2분간 건조시킵니다.
11. 컬럼을 새로운 RNase 없는 튜브로 옮깁니다. 컬럼 막 중앙에 RNase 프리 H₂O 35 μL을 조심스럽게 첨가합니다.
12. 컬럼을 10,000 x g 에서 1분간 원심분리합니다. 용출된 RNA를 채취하고 얼음 보관하세요.
13. RNA 농도를 측정하기 위해 먼저 RNA 정량 키트를 사용해 RNA 버퍼에서 RNA 시약(염료)을 1:200 비율로 희석하여 작업 용액을 준비합니다. 전체 표준 개수에 따라 작업 용액의 총 부피를 계산하고, 각 표준이나 시료마다 200 μL을 준비합니다.
14. 0.2mL 8튜브 스트립을 설치하세요. 각 표준체를 희석하려면 작동 용액의 10 μL에 190 μL를 추가합니다. 각 샘플을 희석하려면 작업 용액 199 μL에 1 μL를 추가합니다. 잘 섞으세요.
15. 8튜브 스트립을 형광광경에 넣으세요. RNA 분석법을 선택하고 표준 기준으로 보정한 후 샘플 농도를 측정하세요.

4. 초기 EU-RNA 비오티닐화 및 정제

참고: 클릭 화학 기반 초기 RNA 캡처 키트를 사용하여 비오티닐화하고 초기 EU-RNA를 추출합니다. 키트에 제공된 지침을 따르면, 다음 단계들이 약간 수정됩니다. 비주입 배아의 RNA와 바이오티닐화가 없는 EU-RNA는 풀다운 특이성의 배경 대조군으로 활용될 수 있습니다.

1. RNA 비오티닐화 및 정화
   1. 각 샘플에 대해 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 다음 성분을 혼합하여 50 μL 클릭 반응을 만듭니다: 총 RNA(1–10 μg), EU 완충 1개, 2 mM CuSO₄, 0.25 mM 비오틴 아지드, 10 mM 첨가제 1, 12 mM 첨가물 2.
   2. 반응 혼합물을 상온에서 30분간 튜테이터 위에서 배양하세요.
   3. 위의 각 반응마다 글리코겐 1 μL, 7.5 M 아세트산 암모늄 50 μL, 냉각된 100% 에탄올 700 μL을 첨가합니다. 피펫을 위아래로 5번 움직여서 잘 섞으세요.
   4. 튜브를 -80°C 냉동고에 넣고 하룻밤 보관하세요.
   5. 튜브를 13,000 x g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다. 펠릿을 흔들지 않고 조심스럽게 상정액을 제거하세요.
   6. 75% 에탄올 700μL을 첨가하고 부드럽게 섞어 펠릿을 재현탁시킵니다. 튜브를 13,000 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 펠릿을 흔들지 않고 조심스럽게 상정액을 제거하세요. 세탁을 한 번 더 반복하세요.
   7. 펠릿을 실온에서 5–10분간 자연 건조하세요. 펠릿을 10 μL RNase 프리 H₂O에 재현탁합니다.
2. EU-RNA 정제
   1. 초기 EU-RNA를 추출하기 위해, 각 샘플마다 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리관에 5 μL 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬을 투여합니다.
   2. 워시 버퍼 2 9 μL을 추가합니다. 잘 섞은 후 튜브를 자석 선반에 올려놓으세요. 2분간 두세요. 상정액을 제거하세요. 세탁을 두 번 더 반복하세요. 비즈를 5 μL 워시 버퍼 2에 재현탁하세요.
   3. 다음 마스터 믹스를 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관(각 샘플당 15 μL)에 준비합니다: 12.5 μL RNA 결합 버퍼(성분 G), 0.2 μL 1:10 희석된 RNase OUT, 2.3 μL RNase 없는 H₂O. 각 RNA 샘플이 담긴 튜브에 15 μL 혼합물을 추가합니다.
   4. 69°C의 열블록에서 5분간 배양하세요. 튜브를 얼음 위에 올려놔.
   5. 위에 미리 세척된 비즈 5 μL을 RNA 샘플이 담긴 각 튜브에 첨가합니다. 상온에서 뉴테이터에서 30분간 배양하세요.
   6. 워시 버퍼 1 50 μL 추가. 잘 섞은 후 튜브를 자석 선반에 올려놓으세요. 2분간 두세요. 상정액을 제거하세요. 세탁을 4번 더 반복하세요.
      참고: 첫 세척 후 상청액은 아마도 모체 전사체만 포함하고 있으며, 모체 전사체 측정을 위해 수집할 수 있습니다.
   7. 워시 버퍼 2 50 μL를 추가합니다. 잘 섞은 후 튜브를 자석 선반에 올려놓으세요. 2분간 두세요. 상정액을 제거하세요. 세탁을 4번 더 반복하세요.
   8. 비즈를 5 μL 워시 버퍼 2에 재현탁하세요. 초기 EU-RNA를 포함한 구슬들은 직접 cDNA 합성과 라이브러리 준비에 적합하다.
      참고: 라이브러리 준비에 들어가기 전에, 새슬린 전사체의 풍부화는 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용해 알려진 개별 유전자의 발현을 측정하여 평가할 수 있습니다.

5. RNA 라이브러리 준비 및 서열 분석

1. 시판 중인 키트를 사용해 cDNA 라이브러리를 준비하고, 키트에 제공된 지침을 따르세요. 일루미나용 NEBNext 라이브러리 퀀트 키트를 사용해 라이브러리를 정량화하고 풀어보세요.
2. 일반적으로 사용되는 차세대 시퀀싱 키트의 지침에 따라 라이브러리를 풀링하세요. 라이브러리를 ~1.8 pM로 희석한 후 벤치탑 시퀀서에 적재하여 시퀀싱 중 최적의 클러스터 밀도 ~200k/mm² 를 달성하세요. 일반적으로 사용되는 차세대 시퀀싱을 사용하여 라이브러리를 시퀀싱하세요. 샘플당 ~2천만 번의 리드에 대해 쌍말 75-bp 시퀀싱을 사용했습니다.
3. 연어¹⁷을 사용해 서열을 Xenopus laevis 게놈 빌드 9.2에 정렬하여 전사체 리드를 정량하고, DESeq2¹⁸을 이용해 차등 유전자 발현 분석을 수행합니다. 게놈 브라우저에서 피크를 시각화하려면 STAR¹⁹를 사용해 서열을 게놈에 매핑하고 통합 유전체 뷰어(IGV)¹⁹에 표시합니다.

결과

수정 후 5시간에서 9시간(hpf) 단계(22°C)에서 22 °C의 Xenopus laevis 배아(4개의 생물학적 복제)는 5단계(대규모 ZGA가 거의 없음)부터 9단계(높은 ZGA)까지 단계에 해당하며, 위⁸단계 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 총 RNA, 정제된 초기 EU-RNA, 그리고 흐름 RNA가 라이브러리 준비에 사용되어 서열 분석이 이루어졌습니다. 그림 2에서 보듯, 6–9 hpf의 신생 전사체와 5 hpf의 전사체를 비교하면, ZGA 과정에서 6에서 9 hpf로 차등 활성화된 유전자의 수가 증가하여 EU-RNA-seq를 이용해 ZGA가 성공적으로 포획되었음을 시사합니다(그림 2A). 더불어, 접합 유전자는 전체 RNA-seq에 비해 EU-RNA가 더 높은 수준과 더 이른 시기에 검출되어(<...

토론

여기서는 초기 배아 발생에서 신생 전사체의 대사 표지에 관한 상세한 프로토콜을 제공했으며, 여기에는 5-EU를 1세포 배아에 미세주입하고, 총 RNA를 추출하여 농도를 측정하며, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위한 신생 EU-RNA의 비오티닐화 및 정제(EU-RNA-Seq)(그림 1)를 포함합니다(그림 1). 전체 RNA-seq에 비해 높은 민감도와 특이성 덕분에, 이 프로토콜은 ZGA 과정에서 신생 전사체의 수준과 시작 시기를 정확히 결정할 뿐만 아니라, 초기 배아 발달 중 개별 유전자의 새로운 시공간 활성화 패턴을 밝혀낼 수 있게 해주었습니다 ^8,9.

이 프로토콜을 수행하기 전에, 분석에 포함될 복제 수와 배아 수와 같은 실험 설계의 매개변수를 고려하고 결정하는...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
µ PUPM 마이크로인젝터	월드 프리시전 인스트루먼트	펌프	마이크로인젝션(압력을 이용한 마이크로인젝팅)을 위한 경우입니다.
5-에티닐 우리딘	써모피셔 사이언티브	E10345	마이크로 주입(초기 트라크니프틱 표지)
ACCU-SCOPE 3075 줌 입체 현미경	VWR	470351-130	마이크로 주입(배아 시각화)을 위해
아세트산 암모늄	시그마-올드리치	A2706	RNA 침전을 위해
아스코르브산	시그마-올드리치	A7506	클릭 반응을 위해
붕규산 유리 모세관	월드 프리시전 인스트루먼트	TW100-4	마이크로 주입(유리 바늘 만들기)을 위한
원심분리기	에펜도르프	5425R	원심분리기 사용
Click-iT 신생 RNA 캡처 키트	써모피셔 사이언티브	C10365	비오티닐화와 신생 RNA 정제를 위해
CuSO4	시그마-올드리치	61230	클릭 반응을 위해
DNase I	로슈 진단	4716728001	RNA 추출을 위해
피콜 400	시그마-올드리치	GE17-0300-10	현세주입(배아 배아 인큐베이션)을 위한 경우입니다
유리 페트리 접시 (60mm)	VWR	75845-542	수정을 위해
글리코겐	써모피셔 사이언티브	AM9510	RNA 침전을 위해
할로카본 오일 27	시그마-올드리치	H8773	마이크로 주입(주입 부피 보정)을 위한
L-시스테인	시그마-올드리치	168149	배아 해독을 위해
마이크로로더 팁	칼리버 사이언티픽	EPE-5242956003	마이크로주입(5-EU를 유리 바늘에 주입)
NEBNext 일루미늄용 라이브러리 퀀트 키트	NEB	E7630	라이브러리 정량화를 위해
NSQ 500/550 고출력 KT v2.5 (75 CYS)	일루미나	20024906	시퀀싱을 위해
Qubi Flex 형광도계	써모피셔 사이언티브	Q33327	RNA 농도 측정을 위해
큐비트 RNA HS 결합 키트	써모피셔 사이언티브	Q32852	RNA 농도 측정을 위해
RNeasy 미니 키트	치아겐	74104	RNA 추출을 위해
스테이지 마이크로미터	워드의 과학	470175-914	마이크로 주입(주입 부피 보정)을 위한
NuQuant을 이용한 범용 RNA-seq	뉴젠	0364	도서관 준비를 위해