초기 배아 단일 세포에서 접합 게놈 활성화 시각화

요약

우리는 초기 배아 발생 시 단일 세포에서 조기 배아 발생 시 접합 게놈 활성화 중 발생 전사를 시각화하는 방법을 설명합니다.

초록

초기 배아 발생은 접합 게놈 활성화(ZGA)를 필요로 하는 모체-접합 전이(MZT)를 필요로 합니다. ZGA 과정에서는 수백에서 수천 개의 유전자가 전사되며, 이는 초기 배아 발달의 다양한 과정, 예를 들어 배아 생존 유지, 세포 운명 특정, 생식층 형성 등 다양한 과정에 필수적입니다. ZGA 연구의 주요 과제 중 하나는 초기 배아의 개별 세포에서 ZGA를 직접 시각화하는 것이었습니다. 여기서는 5-에티닐 우리딘(5-EU)을 이용해 신생 전사체를 대사 표지하여 초기 배아 단일 세포에서 ZGA를 직접 시각화하는 방법을 설명하고, 이후 클릭 화학을 통해 초기 EU-RNA를 형광체와 결합시킨 후, Xenopus laevis 를 모델로 하여 공초점 현미경으로 전체 마운트 배아에서 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 전체 장착 배아에서 단일 세포 ZGA를 추적하고, 초기 배아 발생 중 ZGA의 공간과 시간적 이질적 발현을 밝혀낼 수 있었습니다. 다른 배아 시스템이나 조직에서 단일 세포 수준에서 유전자 전사와 게놈 조절을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

서론

초기 발달 과정에서 배아는 모체에서 접합체로의 전환(MZT)을 겪으며, 이 과정에서 발달 통제권이 모계 인자에서 접합 유전자로 점차 전환됩니다. MZT는 처음에 휴면 상태였던 접합체 게놈의 활성화를 필요로 하며, 이를 접합체 게놈 활성화(ZGA)라고 합니다; ZGA 발현 유전자는 초기 세포 운명 지정, 원구 형성, 그리고 축 형성에 필요합니다 ^1,2. 중요한 점은 ZGA가 모든 다세포동물에서 보존되어 있으며, ZGA의 시기는 엄격히 조절되지만 종 ^3,4 종 간에 차이가 있다는 것입니다. ZGA의 조절 장애는 발달 결함부터 유산과 같은 배아 사망에 이르기까지 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 ZGA의 기전 연구는 유전자 조절의 기초를 이해하는 데 중요할 뿐만 아니라 임상적으로도 중요한 함의를 가집니다.

ZGA 연구의 주요 과제는 초기 배아에서 대규모 ZGA를 직접 시각화하고 단일 세포 수준에서 그 메커니즘을 조사하는 것이었습니다. 우리는 ZGA 중 신생 전사체의 대사 ....

프로토콜

여기서 설명된 동물 작업은 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 프로토콜 시작 전 준비

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 RNase 무첨가 물로 다음 용액을 준비하세요.

1. 트리스 완충 생리식염수(TBS) 1× pH 7.6: 50 mM 트리스-HCl과 150 mM NaCl을 준비합니다. pH를 7.6으로 조절하세요. 실온에서 보관하세요. 두 달 이내에 완충 자금을 사용하세요.
2. 트윈 20(TBST), pH 7.6× 트윈 20 트리스 완충 생리식염수 1 준비: RNase 무첨가수로 1× TBS(pH 7.6)에 최종 농도 0.1%(부피/부피)의 Triton X-100을 첨가합니다. 실온에서 보관하세요. 한 달 이내에 완충 기간을 사용하세요.
3. 4% 파라포름알데히드(PFA)/1× MEM 준비: 16% PFA 스톡 1바이알(10 mL)과 10× MEM 4 mL(1000 mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 [MOPS] pH 7.4, 20 mM EGTA, 10 mM MgSO₄)를 혼합합니....

결과

1세포 단계의 Xenopus laevis 배아는 5-EU를 미세주입했으며, 9단계 배아는 배아 전체에 걸쳐 대규모 ZGA가 진행될 때 고정되었습니다. 배아는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 배아의 초기 RNA는 클릭 반응을 통해 TAMRA-azide로 표지했고, 히스톤 H3는 항히스톤 H3 항체를 사용해 표지했으며, DNA는 TO-PRO-3로 표지하였습니다. 배아는 10× 대물렌즈를 사용해 공초점 현미경으로 촬영되었습니다. 그림 1에서 보듯, 초기 EU-RNA(빨간색)는 배아 세포 핵에서 검출되었으며, H3(녹색)와 DNA(마젠타)가 핵 마커로 사용되어 이 배아 세포에서 매우 활발한 ZGA가 존재함을 시사합니다. 따라서 대사 표지된 EU-RNA는 초기 배아 발생 시 ZGA의 단일 세포 분석에 민감하고 편리한 방법을 제공합니다.

토론

ZGA는 배^{아 발달}의 가장 초기 단계에서 가장 중요한 전환기 중 하나를 대표합니다^. 여기서는 5-EU 마이크로주입 배아를 고정하고, 클릭 반응을 이용한 신생 RNA와 형광체의 결합, 클릭 반응 후 세포 내 세포 마커의 면역염색, 공초점 영상⁷을 위한 배아 제거 등 전체 마운트 초기 제노푸스 배아에서 ZGA를 직접 시각화하기 위한 샘플 준비 절차를 상세히 설명했습니다. 포함된 5-EU의 양은 진행 중인 전사에 비례하기 때문에, 각 핵 내 형광 신호의 세기는 단일 세포 수준에서 ZGA의 정량적 판독을 제공합니다. 따라서 이 방법은 개별 세포에서 ZGA의 활동을 정량화하고 모니터링하며, 배아 내 세포 간 비교를 가능하게 하여 초기 배아 발생에서 ZGA의 새로운 공간 패턴과 메커니즘을 발견할 수 있게 했습니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드 (PFA)	응급의료 서비스	15710-S	고정액을 만들기 위해
20번, SSC	미디어텍	MT46-020-CM	표백 용액을 만들기 위해
3D 튜테이팅 믹서	VWR	76595-802	튜터링 배아에 대해
9 mm 나사산 바이알 (2 mL)	VWR	46610-722	배아 가공을 위해
항히스톤 H3 항체	앱캠	AB1791	면역염색을 위해
아스코르브산	시그마-올드리치	A7506	클릭 반응을 만들기 위해
벤질 알코올	시그마-올드리치	305197	배아를 제거하는 데
벤질벤조산염	아크로스 오가닉스	105860010	배아를 제거하는 데
소 혈청 알부민 (BSA)	시그마-올드리치	A3059	차단 해를 만들기 위해
9mm 나사산 바이알(2mL) 캡	VWR	46610-712	배아 가공을 위해
커버글라스 (24mm & 40mm)	VWR	48393-060	이미징 챔버 제작을 위해
CuSO4	시그마-올드리치	61230	클릭 반응을 만들기 위해
에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)	써모피셔 사이언티브	AC409915000	고정액을 만들기 위해
피지 이미지	NIH		영상 처리
포름아마이드	써모피셔 사이언티브	AC181090010	표백 용액을 만들기 위해
유리 파스퇴르 피펫	VWR	14673-010	BABB 전이
염소 안티-래빗 알렉스 플루어 488 2차 항체	써모피셔 사이언티브	A27034	면역염색을 위해
염소 혈청	앱캠	AB7481	차단 해를 만들기 위해
과산화수소	시그마-올드리치	H1009	표백 용액을 만들기 위해
황산마그네슘 (MgSO4)	써모피셔 사이언티브	M65-500	고정액을 만들기 위해
메탄올	써모피셔 사이언티브	A4524	배아 탈수 치료를 위해
메탄올, 무수성	시그마-올드리치	322415	배아 탈수 치료를 위해
걸레	써모피셔 사이언티브	AC172631000	고정액을 만들기 위해
다중 모드 튜테이팅 믹서	VWR	76595-812	튜터링 배아에 대해
플라스틱 트랜스퍼 피펫	써모피셔 사이언티브	13-711-9 오전	배아 이식을 위해
면도날	써모피셔 사이언티브	18-100-970	테이프 자르기
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트리톤 X-100	시그마-올드리치	10789704001	세척 버퍼 만들기 위해
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자이스 LSM 700 공초점 현미경	자이스		공초점 영상을 위한 목적