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방법 논문

초기 배아 단일 세포에서 접합 게놈 활성화 시각화

397 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70592

⸱

2026년 4월 3일

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

이 논문에서

요약

우리는 초기 배아 발생 시 단일 세포에서 조기 배아 발생 시 접합 게놈 활성화 중 발생 전사를 시각화하는 방법을 설명합니다.

초록

초기 배아 발생은 접합 게놈 활성화(ZGA)를 필요로 하는 모체-접합 전이(MZT)를 필요로 합니다. ZGA 과정에서는 수백에서 수천 개의 유전자가 전사되며, 이는 초기 배아 발달의 다양한 과정, 예를 들어 배아 생존 유지, 세포 운명 특정, 생식층 형성 등 다양한 과정에 필수적입니다. ZGA 연구의 주요 과제 중 하나는 초기 배아의 개별 세포에서 ZGA를 직접 시각화하는 것이었습니다. 여기서는 5-에티닐 우리딘(5-EU)을 이용해 신생 전사체를 대사 표지하여 초기 배아 단일 세포에서 ZGA를 직접 시각화하는 방법을 설명하고, 이후 클릭 화학을 통해 초기 EU-RNA를 형광체와 결합시킨 후, Xenopus laevis 를 모델로 하여 공초점 현미경으로 전체 마운트 배아에서 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 전체 장착 배아에서 단일 세포 ZGA를 추적하고, 초기 배아 발생 중 ZGA의 공간과 시간적 이질적 발현을 밝혀낼 수 있었습니다. 다른 배아 시스템이나 조직에서 단일 세포 수준에서 유전자 전사와 게놈 조절을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

서론

초기 발달 과정에서 배아는 모체에서 접합체로의 전환(MZT)을 겪으며, 이 과정에서 발달 통제권이 모계 인자에서 접합 유전자로 점차 전환됩니다. MZT는 처음에 휴면 상태였던 접합체 게놈의 활성화를 필요로 하며, 이를 접합체 게놈 활성화(ZGA)라고 합니다; ZGA 발현 유전자는 초기 세포 운명 지정, 원구 형성, 그리고 축 형성에 필요합니다 1,2. 중요한 점은 ZGA가 모든 다세포동물에서 보존되어 있으며, ZGA의 시기는 엄격히 조절되지만 종 3,4 종 간에 차이가 있다는 것입니다. ZGA의 조절 장애는 발달 결함부터 유산과 같은 배아 사망에 이르기까지 심각한 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서 ZGA의 기전 연구는 유전자 조절의 기초를 이해하는 데 중요할 뿐만 아니라 임상적으로도 중요한 함의를 가집니다.

ZGA 연구의 주요 과제는 초기 배아에서 대규모 ZGA를 직접 시각화하고 단일 세포 수준에서 그 메커니즘을 조사하는 것이었습니다. 우리는 ZGA 중 신생 전사체의 대사 표지를 5-에티닐 우리딘(5-EU)으로 표지한 후, 클릭 화학과 공초점 현미경을 이용한 전체 마운트 배아에서 신생 EU-RNA를 형광체로 결합시키는 방법을 개발하여 이 도전을 극복했습니다. 이 방법은 Xenopus laevis를 모델로 삼았습니다. 지름 ~1.2mm의 큰 Xenopus 배아는 세포 크기의 구배를 포함하며, 대규모 ZGA는 중간 배반 단계 주변(7단계경 발현, 9단계 정점)에서 나타나 ZGA5 패턴 연구에 이상적인 모델입니다. 초기 Xenopus 배아에서 5-EU 표지를 사용함으로써, 우리는 전체 장착 초기 배아의 개별 세포에서 대규모 ZGA를 직접 시각화하고 정량화할 수 있었으며, 이는 주로 세포 크기 5,6에 의해 조절되는 새로운 ZGA의 시공간 패턴을 발견하는 데 기여했습니다.

여기서는 이전 연구에서 최적화 5,7을 적용한 이 접근법의 세부 사항을 설명합니다. 여기에는 5-EU로 신생 전사체의 대사 표지 후 배아를 고정하고, 클릭반응 8을 통해 EU-RNA를 형광체와 결합시키며, 세포 내 세포 마커에 대한 면역염색 후 공초점 영상을 위해 배아를 정리하는 과정을 포함합니다. 이 방법은 제브라피시 9,10을 포함한 다른 배아 시스템에 적용할 수 있으며, 신생 전사체11의 프로파일링을 위한 시퀀싱에 사용되어 다양한 샘플과 분석에서 일반적이고 광범위한 적용을 지원합니다. 전반적으로 이 방법은 단일 세포에서 유전체 조절 메커니즘을 연구하는 새로운 중요한 수단을 제공합니다.

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프로토콜

여기서 설명된 동물 작업은 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 프로토콜 시작 전 준비

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 RNase 무첨가 물로 다음 용액을 준비하세요.

  1. 트리스 완충 생리식염수(TBS) 1× pH 7.6: 50 mM 트리스-HCl과 150 mM NaCl을 준비합니다. pH를 7.6으로 조절하세요. 실온에서 보관하세요. 두 달 이내에 완충 자금을 사용하세요.
  2. 트윈 20(TBST), pH 7.6× 트윈 20 트리스 완충 생리식염수 1 준비: RNase 무첨가수로 1× TBS(pH 7.6)에 최종 농도 0.1%(부피/부피)의 Triton X-100을 첨가합니다. 실온에서 보관하세요. 한 달 이내에 완충 기간을 사용하세요.
  3. 4% 파라포름알데히드(PFA)/1× MEM 준비: 16% PFA 스톡 1바이알(10 mL)과 10× MEM 4 mL(1000 mM 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산 [MOPS] pH 7.4, 20 mM EGTA, 10 mM MgSO4)를 혼합합니다. RNase 없는 물을 40mL에 추가하세요. 알리코트를 만들어 -20°C에서 보관하세요. 6개월 이내에 사용하세요.
  4. 70%, 50%, 25% 메탄올을 0.5× SSC에 각각 3:1, 1:1, 1:3에 혼합하여 메탄올과 0.5× SSC를 혼합합니다. 6개월 이내에 사용하세요.
  5. 표백액 준비: RNase 무첨가물에서 최종 농도는 2%(볼륨/볼륨) H2O2, 5%(볼륨/볼륨) 포름아마이드, 0.5× SSC로 혼합합니다. 사용 직전에 이 용액을 신선하게 준비하세요.
  6. 차단액 준비: 염소 혈청 10%(부대/부피)와 0.2%(무게/부대) BSA를 1× TBST에 첨가합니다. -20°C에서 보관하세요. 6개월 이내에 사용하세요.
  7. BABB 클리어링 시약 준비: 벤질 알코올(BA) 1과 벤질 벤조에이트(BB) 2 비율을 혼합합니다. 실온에서 보관하세요. 6개월 이내에 사용하세요.

2. 5-EU 마이크로주입 배아 고정

  1. 5-에티닐-우리딘(5-EU)을 1세포 배아에 미세주입할 때는 앞서 설명한 절차를 따르세요. 배아가 ZGA가 활성화된 9단계, 즉 ZGA가 배아의 대부분 세포에서 활성화되는 단계로 발달하도록 두세요.
  2. 5-EU 마이크로 주입된 배아를 고정시키기 위해, 먼저 4% PFA/1× MEM 약 1.8mL를 2mL 섬광 유리 바이알에 첨가합니다. 그 후 플라스틱 이식 피펫을 사용해 약 20개의 배아를 유리 바이알에 옮깁니다. 유리 바이알에 배양지를 넣는 양을 최소화하세요.
  3. 유리 바이알을 위쪽까지 추가로 4% PFA/1× MEM으로 채우세요. 병을 뚜껑으로 닫아; 공기 방울을 남겨두면 안 됩니다.
  4. 유리 바이알을 회전기에 올려놓고 배아를 저속(예: 10rpm)으로 실온에서 최소 2시간 이상 회전시킵니다.
  5. 피펫을 사용해 고정제를 조심스럽게 제거하세요. 유리병에 100% 메탄올을 채우세요. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 5분간 저속으로 회전시킵니다.
  6. 조심스럽게 메탄올을 제거하고 새 메탄올을 추가하세요. 배아가 완전히 탈수되도록 회전과 탈수를 최소 두 번 반복하세요.
  7. 배아는 -20°C의 메탄올에 보관하세요.
    참고: 프로토콜은 여기서 일시정지할 수 있습니다. 배아를 최소 2일간 메탄올에 두었다가 다음 단계를 진행하세요. 배아는 2개월 이내에 사용할 수 있습니다.

3. 클릭 반응을 통해 플루로포어와 신생 RNA를 결합시키는 것

  1. 배아를 재수화시키기 위해 먼저 유리 바이알에서 메탄올을 제거하고, 0.5× SSC에 75% 메탄올 2mL를 넣은 후 캡으로 바이알을 닫습니다. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 5분간 저속으로 회전시킵니다.
  2. 회전 후 유리 바이알 안의 액체를 제거하세요. 위 단계를 순차적으로 반복하여 0.5× SSC에 50% 메탄올, 0.5× SSC에 25% 메탄올, 0.5× SSC를 사용한다. 배아를 완전히 재수분시키려면 0.5× SSC로 마지막 세척을 최소 두 번 반복하세요.
  3. 유리 바이알에 신선하게 준비한 표백용액 2mL(2% H,2O2 , 5% 포르마마이드 4/0.5× SSC)를 추가합니다. 유리 바이알을 알루미늄 호일 위에 올려놓고, 샘플이 과열되지 않는 거리에서 LED 조명 아래에 두세요.
  4. 모든 색소가 흰색으로 변할 때까지 배아를 빛 아래에서 표백하는데, 보통 5–6시간이 걸립니다. H2 O2가 O2로 분해되면서작은 공기 방울이 생겨 배아가 떠오를 수 있다는 점에 유의하세요. 배아를 주기적으로(예: 30분마다 한 번) 점검하고, 유리 바이알을 부드럽게 돌려 배아가 표백 용액에 자리 잡도록 하세요.
  5. 표백 완충제를 조심스럽게 제거하세요. 0.5× SSC 2mL를 추가해 배아를 빠르게 헹구세요. 필요하다면 빠르게 한 번 더 빠르게 씻어내세요.
  6. 유리 바이알에 1× TBST 2mL를 넣으세요. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 1시간 동안 저속으로 돌립니다. 회전 후 유리 바이알 안의 액체를 제거하세요.
  7. 위 단계를 최소 5번 반복하세요. 다음 단계에서는 배아를 철저히 세척하는 것이 매우 중요하다는 점을 유의하세요.
  8. 유리 바이알에 1× TBS 2mL를 넣으세요. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 5분간 저속으로 회전시킵니다. 회전 후 유리 바이알 안의 액체를 제거하세요.
  9. 위 단계를 한 번 더 반복하세요.
  10. 1.5 mL 마이크로 원심분리관에서 클릭 반응을 위해 다음 시약을 첨가하여 최종 농도인 100 mM Tris-HCl(pH 8.5), 1 mM CuSO4, 25 μM 테트라메틸로다민(TAMRA)-아지드, 100 mM 아스코르빈산을 만듭니다. 반응 끝에 아스코르빈산을 추가하세요. 피펫을 위아래로 움직여 잘 섞으세요.
  11. 유리 바이알에 200 μL 반응 혼합물을 배아에 첨가합니다. 반응 혼합 부피가 모든 배아를 바이알에 담그기에 충분한지 확인하세요. 실온에서 어두운 환경에서 12시간 배양하세요.
  12. 클릭 반응 혼합물을 조심스럽게 제거하세요. 배아에서 비특이적 형광이 관찰된다는 점에 유의하세요. 배아를 1× TBST로 빠르게 두 번 헹구고, 1× TBST로 최소 5회 세척하며, 위에서 설명한 대로 1시간마다 용액을 교체하세요.
  13. 배아를 세척하는 동안 2시간마다 TBST 1×을 교체하고, 회전기로 4°C에서 하룻밤 동안 두세요. 비특이적 형광이 거의 보이지 않을 때는 세척을 멈추세요. 클릭 반응 잔류물이 하위 면역염색에 해로울 수 있으므로, 다음 단계로 넘어가기 전에 배아를 1–2일간 철저히 세척해야 합니다.

4. 세포 내 세포 마커를 이용한 배아 면역 염색(선택 사항)

  1. 배아를 차단하려면 위 세척 단계에서 유리 바이알에서 1× TBST를 제거하고, 차단액 200 μL(염소 혈청 10% BSA/BSA/1× TBST)을 추가하세요. 유리 바이알을 알루미늄 호일 조각으로 감싸 배아를 빛으로부터 보호하세요. 유리 바이알을 뉴테이터 위에 올려놓고 배아를 실온에서 최소 1시간(또는 4 °C에서 하룻밤) 부드럽게 흔듭니다.
  2. 1차 항체(예: 항-H3 항체)를 1:1,000 비율로 10% 염소 혈청/TBST 1× 200 μL 용액에 희석합니다. 희석된 항체를 유리 바이알에 넣고 알루미늄 호일로 유리 바이알을 감싸세요. 배아를 4°C에서 낮은 속도로 뉴테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  3. 유리 바이알에서 항체를 조심스럽게 제거하세요. 1× TBST 2mL를 유리 바이알에 넣고 제거하여 배아를 두 번 빠르게 헹구세요.
  4. 유리 바이알에 1× TBST 2mL를 넣은 후 알루미늄 호일로 감싸세요. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 1시간 동안 저속으로 돌립니다. 회전 후 유리 바이알 안의 액체를 제거하세요.
  5. 위 단계를 최소 5번 반복하세요.
  6. 2차 항체(예: 토끼 알렉스 플루오르 488 항체)를 1:1,000 비율로 10% 염소 혈청/1× TBST 200 μL에 희석합니다. DNA 염색이 필요하다면 DNA 염료(예: TO-PRO-3)와 2차 항체를 희석합니다.
  7. 희석한 항체를 유리 바이알에 넣고 알루미늄 호일로 감싸세요. 배아를 4°C에서 낮은 속도로 뉴테이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  8. 유리 바이알에서 항체를 조심스럽게 제거하세요. 1× TBST 2mL를 유리 바이알에 넣고 제거하여 배아를 두 번 빠르게 헹구세요.
  9. 유리 바이알에 1× TBST 2mL를 넣은 후 알루미늄 호일로 감싸세요. 유리 바이알을 회전기 위에 올려놓고 배아를 1시간 동안 저속으로 돌립니다.
  10. 위 단계를 최소 5번 반복하세요.

5. 공초점 영상 촬영 전 배아를 제거하기

  1. 배아를 탈수시키기 위해, 최종 세척 후 유리 바이알의 완충제를 조심스럽게 제거하고 100% 메탄올 2mL를 추가하세요. 유리 바이알을 알루미늄 호일로 감싸 회전기 위에 올려놓고, 배아를 5분간 저속으로 회전시킵니다. 회전 후 유리 바이알 안의 액체를 제거하세요.
  2. 위 단계를 최소 5번 반복하세요.
  3. 배아를 완전히 탈수시키기 위해서는 위 단계를 최소 5회 이상 100% 무수 메탄올 2mL로 반복하세요.
  4. 유리 바이알에서 가능한 한 많은 메탄올을 조심스럽게 제거하세요.
  5. 유리 피펫을 사용해 투명 시약 BABB 500 μL을 천천히 유리 바이알에 주입합니다. 배아는 BABB 안에 떠 있다가 10분간 기다려 모든 배아가 유리병 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 배아는 거의 보이지 않게 되므로, 배아를 손상시키지 않도록 조심스럽게 제거하세요.
  6. 위 단계를 최소 2번 더 반복하거나, 슐리렌 선이 보이지 않을 때까지 반복하세요. 배아를 완전히 제거하려면 영상 촬영 전 1–2일간 BABB에 보관하세요.
  7. VHB 테이프에서 ~5 mm × 5 mm 두께의 작은 정사각형(예: ~5 mm 5 mm)을 잘라내고, 크기는 배아 크기와 비슷하고 크기는 ~10 mm × 10 mm인 것을 24 mm × 40 mm 커버글라스에 붙입니다.
  8. 제거된 배아를 조심스럽게 챔버로 옮긴 후, 다른 뚜껑 유리로 덮으세요. 배아는 커버글라스 샌드위치 안에 넣어 양면을 촬영할 수 있습니다.
  9. 공초점 현미경 아래에서 영상 촬영을 하세요.

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결과

1세포 단계의 Xenopus laevis 배아는 5-EU를 미세주입했으며, 9단계 배아는 배아 전체에 걸쳐 대규모 ZGA가 진행될 때 고정되었습니다. 배아는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 처리되었습니다. 배아의 초기 RNA는 클릭 반응을 통해 TAMRA-azide로 표지했고, 히스톤 H3는 항히스톤 H3 항체를 사용해 표지했으며, DNA는 TO-PRO-3로 표지하였습니다. 배아는 10× 대물렌즈를 사용해 공초점 현미경으로 촬영되었습니다. 그림 1에서 보듯, 초기 EU-RNA(빨간색)는 배아 세포 핵에서 검출되었으며, H3(녹색)와 DNA(마젠타)가 핵 마커로 사용되어 이 배아 세포에서 매우 활발한 ZGA가 존재함을 시사합니다. 따라서 대사 표지된 EU-RNA는 초기 배아 발생 시 ZGA의 단일 세포 분석에 민감하고 편리한 방법을 제공합니다.

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토론

ZGA는 배아 발달의 가장 초기 단계에서 가장 중요한 전환기 중 하나를 대표합니다. 여기서는 5-EU 마이크로주입 배아를 고정하고, 클릭 반응을 이용한 신생 RNA와 형광체의 결합, 클릭 반응 후 세포 내 세포 마커의 면역염색, 공초점 영상7을 위한 배아 제거 등 전체 마운트 초기 제노푸스 배아에서 ZGA를 직접 시각화하기 위한 샘플 준비 절차를 상세히 설명했습니다. 포함된 5-EU의 양은 진행 중인 전사에 비례하기 때문에, 각 핵 내 형광 신호의 세기는 단일 세포 수준에서 ZGA의 정량적 판독을 제공합니다. 따라서 이 방법은 개별 세포에서 ZGA의 활동을 정량화하고 모니터링하며, 배아 내 세포 간 비교를 가능하게 하여 초기 배아 발생에서 ZGA의 새로운 공간 패턴과 메커니즘을 발견할 수 있게 했습니다

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공개 사항

저자는 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

우리는 펜실베이니아 대학교의 매튜 굿 연구실에 교육을 제공해 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(R03HD105802)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16% 파라포름알데히드 (PFA)응급의료 서비스15710-S고정액을 만들기 위해
20번, SSC미디어텍MT46-020-CM표백 용액을 만들기 위해
3D 튜테이팅 믹서VWR76595-802튜터링 배아에 대해
9 mm 나사산 바이알 (2 mL)VWR46610-722배아 가공을 위해
항히스톤 H3 항체앱캠AB1791면역염색을 위해
아스코르브산시그마-올드리치A7506클릭 반응을 만들기 위해
벤질 알코올시그마-올드리치305197배아를 제거하는 데
벤질벤조산염아크로스 오가닉스105860010배아를 제거하는 데
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치A3059차단 해를 만들기 위해
9mm 나사산 바이알(2mL) 캡VWR46610-712배아 가공을 위해
커버글라스 (24mm & 40mm)VWR48393-060이미징 챔버 제작을 위해
CuSO4시그마-올드리치61230클릭 반응을 만들기 위해
에틸렌비스(옥시에틸렌니트릴로) 테트라아세트산(EGTA)써모피셔 사이언티브AC409915000고정액을 만들기 위해
피지 이미지NIH영상 처리
포름아마이드써모피셔 사이언티브AC181090010표백 용액을 만들기 위해
유리 파스퇴르 피펫VWR14673-010BABB 전이
염소 안티-래빗 알렉스 플루어 488 2차 항체써모피셔 사이언티브A27034면역염색을 위해
염소 혈청앱캠AB7481차단 해를 만들기 위해
과산화수소시그마-올드리치H1009표백 용액을 만들기 위해
황산마그네슘 (MgSO4)써모피셔 사이언티브M65-500고정액을 만들기 위해
메탄올써모피셔 사이언티브A4524배아 탈수 치료를 위해
메탄올, 무수성시그마-올드리치322415배아 탈수 치료를 위해
걸레써모피셔 사이언티브AC172631000고정액을 만들기 위해
다중 모드 튜테이팅 믹서VWR76595-812튜터링 배아에 대해
플라스틱 트랜스퍼 피펫써모피셔 사이언티브13-711-9 오전배아 이식을 위해
면도날써모피셔 사이언티브18-100-970테이프 자르기
RNase 없는 물써모피셔 사이언티브BP561-1RNASE가 없는 용액을 만들기 위해
로토-미니 플러스 (회전 기계)VWR470313-912로레이팅 배아를 위해
테트라메틸로다민(TAMRA)-아지드앱캠ab146486클릭 반응을 만들기 위해
토-프로-3써모피셔 사이언티브T3605DNA 염색을 위해
트리톤 X-100시그마-올드리치10789704001세척 버퍼 만들기 위해
트리즈마 베이스 (트리스 베이스)시그마-올드리치T1503Tris 버퍼를 만들기 위해
VHB 3M GPH-110GF 테이프 (45밀리)VWR76524-608이미징 챔버 제작을 위해
자이스 LSM 700 공초점 현미경자이스공초점 영상을 위한 목적

참고문헌

  1. Kojima, M. L., Hoppe, C., Giraldez, A. J. The maternal-to-zygotic transition: Reprogramming of the cytoplasm and nucleus. Nat Rev Genet. 26 (4), 245-267 (2025).
  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
  5. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  6. Chen, H., Good, M. C. Nascent transcriptome reveals orchestration of zygotic genome activation in early embryogenesis. Curr Biol. 32 (19), 4314-4324.e7 (2022).
  7. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in whole-mount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  8. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  9. Chan, S. H., et al. Brd4 and P300 confer transcriptional competency during zygotic genome activation. Dev Cell. 49 (6), 867-881.e8 (2019).
  10. Adar-Levor, S., et al. Cytokinetic abscission is part of the midblastula transition in early zebrafish embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (15), e2021210118(2021).
  11. Chen, H. Quantifying nascent transcription in early embryogenesis. Methods Mol Biol. 2923, 143-162 (2025).
  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

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