방법 논문

대사 기능 장애 관련 지방성 간질환의 조기 심혈관계-대사 평가를 위한 표준화된 프로토콜

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DOI:

10.3791/70593

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2026년 9월 29일

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1Clinical Research Department, Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory, 2Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), Laboratory of Biochemistry and Experimental Medicine, 3Cardiology Department, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), 4Facultad de Enfermería y Nutrición, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, 5Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada (CICATA), Instituto Politécnico Nacional (IPN)

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 식이 염증 평가, 생화학적 바이오마커, 심초음파 및 경동맥 초음파 검사를 통합하여 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MASLD) 성인의 초기 심혈관계-대사 평가를 위한 표준화된 워크플로를 설명하며, 재현성을 높이기 위해 표준화된 획득, 품질 관리 및 데이터 검증 절차를 함께 제공합니다.

초록

대사 기능 장애 관련 지방성 간질환(MASLD)은 만성적인 저강도 염증 및 심혈관 질환 위험 증가와 관련이 있습니다. 식단 염증 평가와 객관적인 심혈관 영상 진단을 통합한 표준화된 프로토콜이 제한적이어서, 임상 전 단계의 심장 대사 변화를 조기에 식별하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 본 프로토콜은 MASLD로 진단된 성인을 대상으로 식단의 염증 잠재력과 조기 심장 대사 변화 사이의 연관성을 평가하기 위한 재현 가능한 워크플로우를 설명합니다. 참가자는 표준화된 적격성 기준에 따라 모집되며, 초음파 검사를 통해 간 지방증을 확인합니다. 식단 섭취는 검증된 반정량적 식품 섭취 빈도 설문지(FFQ)를 사용하여 평가하며, 이를 바탕으로 기존 문헌 기반 방법론을 사용하여 식단 염증 지수(DII)를 산출합니다. 심장 대사 평가는 신체 계측, 공복 생화학 분석, 중성지방 대 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(TG/HDL-C) 비율 및 혈장 죽상경화 지수(AIP) 계산, 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 이용한 염증 바이오마커 정량 분석, 조직 도플러 유래 E/e′를 이용한 경흉부 심초음파 기반 좌심실 이완 기능 평가, 그리고 경동맥 내중막 두께(CIMT) 측정을 위한 양측 경동맥 초음파 검사를 포함합니다. 방법론적 일관성과 재현성을 보장하기 위해 표준화된 획득 절차, 사전 정의된 품질 관리 체크포인트 및 데이터 검증 단계가 포함되었습니다. 대표 결과는 DII 분류, 염증 바이오마커 프로필, 심초음파 지표 및 CIMT 측정값을 포함하여 본 프로토콜을 통해 생성된 표준화된 데이터를 보여주며, 이는 확정적인 생물학적 연관성을 의미하지는 않습니다. 본 프로토콜은 MASLD 성인에서 식단 염증 부담과 조기 심장 대사 변화 사이의 관계를 조사하는 임상 및 중개 연구를 수행하기 위한 상세하고 재현 가능한 방법론적 프레임워크를 제공합니다.

서론

대사 기능 장애 관련 지방성 간질환(Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD)은 전 세계적으로 가장 흔한 만성 간질환으로, 성인 인구의 약 3분의 1에게 영향을 미칩니다. 진행성 간 손상 외에도, MASLD는 만성적인 저강도 염증, 인슐린 저항성, 내피 기능 장애 및 가속화된 죽상동맥경화증을 특징으로 합니다1,2. 심혈관 질환은 MASLD 환자의 주요 이환 및 사망 원인이며, 이는 임상적으로 명백한 심혈관 질환이 발생하기 전에 초기 심혈관 대사 변화를 식별할 수 있는 신뢰할 수 있는 접근법의 필요성을 강조합니다3,4. 본 프로토콜의 목적은 MASLD 성인 환자를 대상으로 식이 염증 부담, 전신 염증 및 초기 잠재적 심혈관 기능 장애를 통합적으로 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능한 워크플로우를 제공하는 것입니다. 본 프로토콜은 해당 인구 집단에서 임상적으로 유의미한 심혈관 질환에 앞서 나타나는 초기 심혈관 대사 위험을 조사하는 임상 및 중개 연구를 위해 고안되었습니다.

축적된 증거에 따르면 식단은 MASLD의 시작과 진행에 중추적인 역할을 합니다. 초가공 식품, 포화 지방, 정제 탄수화물 및 첨가당의 섭취가 많은 식단 패턴은 산화 스트레스, 내피 기능 장애, 면역 활성화 및 만성 전신 염증을 촉진합니다5,6. 반대로 식이섬유, 폴리페놀, 오메가-3 지방산 및 항산화 미량 영양소가 풍부한 식단 패턴은 대사 기능 장애 및 심혈관 질환과 관련된 염증 경로를 완화합니다6,7.

식단 염증 지수(Dietary Inflammatory Index, DII)는 C-반응성 단백질(CRP), 인터루킨(IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-10 및 종양괴사인자-α(TNF-α)를 포함한 염증성 바이오마커에 미치는 45가지 식단 구성 성분의 효과를 바탕으로 문헌에서 도출된 점수 산정 시스템을 사용하여 평소 식단 섭취의 염증 유발 가능성을 추정하기 위해 개발되었습니다8. 다양한 인구 집단에서 DII 점수가 높을수록 혈중 염증 매개체 증가, 인슐린 저항성, 대사 증후군, 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환과 관련이 있는 것으로 나타났습니다9,10.

DII가 부정적인 대사 결과와 관련이 있는 것으로 알려져 왔으나, MASLD 환자의 조기 심혈관 변화를 감지하기 위해 식이 염증 평가와 객관적인 심혈관 영상을 통합하여 분석한 연구는 상대적으로 적습니다4,11. 심장 대사 손상의 가장 초기 징후 중에는 조직 도플러 유래 E/e′ 비율로 평가하는 불현성 좌심실 이완 기능 장애가 있으며, 이는 상승된 좌심실 충만압을 반영하며 당뇨병성 및 대사성 심근병증의 초기 특징을 나타냅니다12,13. 또한, 향후 심혈관 사건을 독립적으로 예측하는 불현성 죽상경화증의 검증된 대리 표지자인 경동맥 내중막 두께(CIMT)가 있습니다14,15.

주로 신체 계측, 정기적인 생화학적 검사 및 개별 심혈관 위험 요인에 의존하는 기존의 심장 대사 평가와 달리, 본 프로토콜은 식이 염증 평가, 염증 바이오마커 프로파일링, 이완 기능의 심초음파 평가 및 경동맥 초음파 검사를 하나의 표준화된 워크플로우로 통합합니다. 이러한 통합적 접근 방식은 임상 연구 환경에서 널리 사용 가능한 비침습적 기술을 통해 식이 노출, 전신 염증 및 불현성 심혈관 리모델링을 동시에 평가할 수 있게 합니다. 대사 질환에서 초기 심혈관 기능 장애의 특성 분석을 개선하기 위해 다중 모드 접근 방식이 제안되어 왔으나, 표준화된 실행 프로토콜은 여전히 제한적인 실정입니다.

전형적인 지질 프로파일 평가를 보완하기 위해, 본 프로토콜에는 중성지방 대 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 (TG/HDL-C) 비율과 log (TG/HDL-C)로 계산되는 혈장 동맥경화 지수 (AIP)가 포함됩니다. AIP는 동맥경화성 지질단백질과 항동맥경화성 지질단백질 간의 균형을 반영하며, 작고 조밀한 저밀도 지질단백질 (LDL) 입자, 인슐린 저항성, 내피 기능 장애 및 잔여 심혈관 위험의 대리 표지자로 부상했습니다. 결과적으로 AIP는 동맥경화성 이상지질혈증에 대한 보다 포괄적인 평가를 제공하며, 특히 MASLD16,17와 같은 대사 질환이 있는 사람을 포함하여 심혈관 위험이 증가한 개인을 식별하는 데 우수한 판별 능력을 입증했습니다.

또한, 본 프로토콜은 식이 염증 잠재력과 MASLD의 심장 대사 손상을 연결하는 생물학적 메커니즘을 더욱 자세히 규명하기 위해 일련의 순환 염증 바이오마커 패널을 포함합니다. 이러한 바이오마커들은 백혈구 모집, 선천 면역 활성화, 염증 촉진 및 억제 신호 전달, 내피 기능 장애 및 인슐린 저항성에서 핵심적인 역할을 하기 때문에 선택되었습니다. 이러한 매개체들을 동시에 평가함으로써 CRP 단독 측정보다 전신 염증에 대한 더 종합적인 특성 분석이 가능하며, 식이 염증 부담과 MASLD의 초기 심혈관 손상 사이의 관계에 대한 기전적 통찰력을 높일 수 있습니다1,18,19.

따라서 본 프로토콜은 식단 평가, 염증성 바이오마커 프로파일링, 생화학적 분석, 심초음파 및 경동맥 초음파 검사를 통합함으로써, MASLD 환자의 식단 염증 잠재력과 초기 심혈관 대사 변화 사이의 연관성을 평가하기 위한 표준화되고 재현 가능한 방법론을 제공합니다. 표준화된 측정 절차와 사전 정의된 품질 관리 체크포인트를 포함함으로써, 본 워크플로우는 연구자 및 연구 기관 간의 재현성을 용이하게 하는 동시에 MASLD의 초기 심혈관 대사 위험에 대한 임상 및 중개 연구를 지원하도록 설계되었습니다.

프로토콜

본 연구 프로토콜은 멕시코시티에 위치한 멕시코 국립 의료 센터 "20 de Noviembre," Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE)의 기관 연구 및 연구 윤리 위원회의 승인을 받았습니다 (승인 번호: 04-118-2025). 모든 절차는 헬싱키 선언 및 인간 대상 연구를 규율하는 해당 국가 법령에 따라 수행하십시오. 등록 전 모든 참여자로부터 서면 동의서를 확보하십시오. 모든 임상, 실험실, 식이 및 영상 데이터에 코드화된 연구 식별자를 사용하여 참여자의 비밀을 보호하십시오.

1. 참가자 모집 및 적격성 평가

  1. 참가자 모집
    1. 2025년에서 2026년 사이에 대사 기능 장애 관련 지방간 질환(MASLD)이 의심되는 18세 이상의 성인을 모집한다.
    2. 등록 전 연구 목적, 절차, 잠재적 위험 및 비밀 유지 조치에 대해 설명한다.
    3. 연구 절차를 수행하기 전 각 참가자로부터 서면 동의서를 받는다.
  2. MASLD 확진
    1. 표준화된 기관 절차에 따라 복부 초음파 검사를 수행한다.
    2. 신장 피질 대비 증가된 간 에코 발생도와 후방 음향 감쇠를 확인하여 간 지방증을 확진한다.
    3. 현재의 합의 기준에 따라 간 지방증과 적어도 하나의 심혈관 대사 위험 인자의 존재를 확인하여 MASLD로 진단한다.
      참고: 검사자 간 변동성을 최소화하기 위해 모든 초음파 검사는 동일한 획득 프로토콜을 사용하고, 가능한 경우 동일한 숙련된 영상의학과 전문의가 수행하도록 한다.
  3. 적격성 평가
    1. 사전에 정의된 모든 적격성 기준을 충족하고 서면 동의서를 제출한 참가자를 포함한다.
    2. 과도한 음주력이 있는 참가자는 제외한다.
    3. 바이러스성 간염(HBV 또는 HCV), 자가면역성 간질환, 약물 유발 간 손상, 유전성 간질환, 임신, 활동성 악성 종양, 비보상성 심부전 또는 심혈관 대사 평가를 방해할 수 있는 기타 만성 간질환이 있는 참가자는 제외한다.
      참고: 각 참가자에게 코드화된 연구 식별자를 부여하고, 연구 데이터베이스에서 성명, 의무기록번호 및 기타 개인 식별 정보를 제거하며, 심초음파 및 경동맥 초음파 영상을 보안이 유지되는 기관 데이터베이스에 저장함으로써 참가자의 비밀을 보호한다.

2. 식품 섭취 빈도 설문지

  1. 식이 평가 도구 선택
    1. 연구 대상 집단에 적합하고 검증된 반정량적 식품 섭취 빈도 설문지(FFQ)를 선택한다.
      참고: 반복적인 24시간 식이 회상법 또는 식이 기록법을 통해 사전에 검증된 FFQ를 사용한다. 본 프로토콜에서는 지난 7일간의 습관적 섭취량을 평가하기 위해 ENSANUT 140개 항목 반정량적 FFQ를 사용하였다20,21.
  2. 식이 평가 준비
    1. 참가자 모집 전, 표준화된 서면 지침을 사용하여 모든 면담자를 교육한다.
    2. 모든 면담자 간에 설문지 작성 방식, 1회 섭취량 추정, 응답 해석 및 데이터 기록 과정을 표준화한다.
  3. FFQ 실시
    1. 대면 면담을 통해 FFQ를 수행한다.
    2. 참가자에게 FFQ에 명시된 기준 기간 동안의 습관적인 식품 및 음료 섭취량을 보고하도록 안내한다.
    3. 평일과 주말에 모두 섭취한 식품을 포함한다.
    4. 급성 질환, 입원 또는 단기 치료적 중재와 관련된 일시적인 식이 변화는 제외한다.
  4. 식이 섭취량 기록
    1. 사전에 정의된 FFQ 빈도 범주를 사용하여 식품 섭취량을 기록한다.
    2. 표준화된 가정용 식기, 식품 모형, 사진 또는 표준 1회 제공량 가이드를 사용하여 1회 섭취량을 추정한다.
    3. 참가자의 응답에 영향을 주지 않으면서 생소한 식품, 제공량 또는 빈도 범주에 대해 명확히 확인한다.
      참고: 면담 직후 작성 완료된 각 FFQ를 검토하여 데이터 품질을 확인한다. 누락된 응답이나 일관성 없는 답변을 식별하고, 데이터를 연구 데이터베이스에 입력하기 전에 참가자와 직접 불일치 사항을 해결한다.
  5. 일일 식이 섭취량 계산
    1. 보고된 섭취 빈도를 일평균 섭취량(회/일)으로 변환한다.
    2. FFQ 매뉴얼에 따라 1회 섭취량을 일일 g 또는 mL 단위로 변환한다.
    3. 적절한 식품 성분 데이터베이스와 영양 분석 소프트웨어를 사용하여 일일 영양소 섭취량을 계산한다.
    4. 모든 참가자에게 동일한 영양소 계산 절차를 적용한다.
      일시 중단 지점: 품질 확인이 완료된 FFQ를 안전하게 보관하고, 추후 영양 분석 및 식이 염증 지수(DII) 계산을 위해 처리한다.

3. 식이 염증 지수 추정

참고: 식이 염증 지수(Dietary Inflammatory Index, DII)는 검증된 식이 평가 도구8를 통해 수집된 데이터를 바탕으로 평상시 식이 섭취의 염증 가능성을 추정하는 문헌 기반 알고리즘입니다.

  1. 식단 섭취 데이터 준비
    1. 표준화된 식품 성분 데이터베이스와 영양 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 FFQ 응답을 일일 영양소 섭취량으로 변환합니다.
    2. 모든 대상자에게 동일한 영양소 계산 절차를 적용합니다.
  2. 식단 구성 성분 선택
    1. DII 계산에 사용할 수 있는 식단 구성 성분을 식별합니다.
    2. 선택한 FFQ 및 식품 성분 데이터베이스에서 신뢰성 있게 파악된 식단 구성 성분만을 사용하여 DII를 계산합니다.
    3. 모든 대상자에게 동일한 식단 구성 성분 세트를 적용합니다.
      참고: 측정되지 않은 식단 구성 성분에 0의 값을 할당하지 마십시오.
  3. 표준 점수 계산
    1. 각 식단 구성 성분의 섭취량을 기존 DII 방법론8에 기술된 해당 글로벌 참조 평균 및 표준 편차와 비교합니다.
    2. 다음 식을 사용하여 표준 점수를 계산합니다.
    3. 표준 점수 = (대상자 섭취량 − 글로벌 참조 평균) ÷ 글로벌 참조 표준 편차
  4. 중심 백분위수 계산
    1. 기존 DII 방법론에 따라 각 표준 점수를 중심 백분위수로 변환합니다.
    2. 다음 식을 사용하여 중심 백분위수를 계산합니다.
    3. 중심 백분위수 = (백분위수 × 2) − 1
  5. 성분별 DII 점수 계산
    1. 중심 백분위수에 기존 DII 데이터베이스8에서 각 식단 구성 성분에 할당된 염증 효과 점수를 곱합니다.
    2. 사용 가능한 모든 식단 구성 성분에 대해 이 계산을 반복합니다.
    3. 성분별 DII 점수 = 중심 백분위수 × 염증 효과 점수
  6. 전체 식단 염증 지수(Dietary Inflammatory Index) 계산
    1. 성분별 DII 점수를 합산하여 각 대상자의 전체 DII 점수를 구합니다.
    2. 음수 값은 더 항염증적인 식단 패턴으로 해석합니다.
    3. 양수 값은 더 전염증적인 식단 패턴으로 해석합니다.
  7. 대상자 분류
    1. DII 점수에 따라 대상자의 순위를 매깁니다.
    2. 연구 모집단 분포를 기반으로 대상자를 사분위수로 나눕니다.
  8. 품질 관리 수행
    1. 모든 대상자에게 동일한 FFQ, 식품 성분 데이터베이스, 영양 분석 소프트웨어 및 DII 계산 방법을 사용합니다.
    2. 분석 전, 모든 식단 기록에서 누락된 정보, 비현실적인 에너지 섭취량 및 데이터 입력 오류가 있는지 검토합니다.
    3. 계산 정확도를 검증하기 위해 무작위로 추출한 대상자 표본에 대해 DII를 독립적으로 재계산합니다.
    4. DII 계산에 포함된 모든 식단 구성 성분을 문서화하고, 사용할 수 없었던 성분들을 보고합니다.

4. MASLD 평가

  1. 1.2.2.에 기술된 대로 간 지방증을 확인한다.
    참고: 검사자 간의 변동성을 최소화하기 위해, 가능한 경우 동일한 숙련된 영상의학과 전문의가 동일한 획득 파라미터를 사용하여 모든 검사를 수행하도록 한다.
  2. 알코올 섭취량을 평가한다
    1. 표준화된 임상 면담을 통해 알코올 섭취량을 평가한다.
    2. 알코올 섭취량이 현재 MASLD 진단 기준치를 초과하는 참가자는 제외한다.
  3. 간 지방증의 이차적 원인을 배제한다
    1. 만성 바이러스성 간염(HBV 또는 HCV)이 있는 참가자는 제외한다.
    2. 자가면역성 간질환, 약제 유발성 간 손상, 유전성 간질환, 임신, 활동성 악성 종양 또는 심혈관 대사 평가를 방해할 수 있는 기타 만성 간질환이 있는 참가자는 제외한다.
  4. 심혈관 대사 위험 요인을 평가한다
    1. 체질량지수(BMI)를 측정하고 BMI ≥25 kg/m2인 경우 과체중 또는 비만으로 분류한다.
    2. 공복 혈장 포도당 >125 mg/dL를 기준으로 제2형 당뇨병 여부를 평가한다.
    3. 다음 기준 중 최소 두 가지 이상이 충족되는지 확인하여 대사 조절 장애 여부를 평가한다: 허리둘레 증가, 혈압 ≥130/85 mmHg, 중성지방 ≥150 mg/dL, HDL-C 남성 <40 mg/dL 또는 여성 <50 mg/dL, 공복 혈장 포도당 100–125 mg/dL 또는 HbA1c 5.7%–6.4%, 또는 HOMA-IR과 같은 인슐린 저항성 지표의 상승.
  5. 현재의 합의 기준에 따라 간 지방증이 확인되고 하나 이상의 심혈관 대사 위험 요인이 동반된 경우 MASLD로 진단한다.

5. 심혈관 대사 위험 평가

  1. 인구통계학적 및 신체계측치 측정
    1. 참가자의 연령, 성별, 병력, 현재 복용 약물 및 제2형 당뇨병과 고혈압을 포함하여 진단된 심혈관 대사 질환을 기록한다.
    2. 교정된 장비를 사용하여 신장과 체중을 측정한다.
    3. 체중(kg)을 신장의 제곱(m2)으로 나누어 체질량 지수(BMI)를 계산한다.
    4. 신축성이 없는 측정 테이프를 사용하여 마지막 갈비뼈 하단 가장자리와 장골능의 중간 지점에서 허리둘레를 측정한다.
  2. 일상적인 자동 임상 실험실 방법을 사용하여 심혈관 대사 위험의 생화학적 마커를 결정한다.
    1. 기관 실험실 절차에 따라 공복 혈액 샘플을 수집한다.
    2. 일상적인 자동 임상 실험실 검사를 사용하여 총 콜레스테롤, HDL-C, LDL-C, 중성지방, 공복 혈당, HbA1c 및 공복 인슐린을 포함한 생화학적 마커를 측정한다.
      참고: 자동 임상 실험실 검사는 일반적으로 효소 비색법을 사용하여 총 콜레스테롤과 중성지방을, 직접 균질 효소 비색법을 사용하여 HDL-C와 LDL-C를, 효소 헥소카이네이스법을 사용하여 공복 혈당을, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 HbA1c를, 그리고 화학발광 면역분석법을 사용하여 공복 인슐린을 측정한다.
    3. 인슐린 저항성에 대한 항상성 모델 평가(HOMA-IR)를 계산한다.
    4. 중성지방 대 HDL 콜레스테롤(TG/HDL-C) 비율을 계산한다.
    5. 혈장 동맥경화 지수(AIP)를 다음과 같이 계산한다:
      AIP = log (TG/HDL-C)
  3. 혈장 염증 바이오마커 측정
    참고: 인간 생물학적 검체는 기관의 생물안전 규정 및 표준 주의사항에 따라 취급한다. 적절한 개인 보호구(PPE)를 착용하고, 멸균 재료와 무균 기술을 사용하며, 밀폐 용기에 검체를 운송하고, 기관 규정에 따라 생물학적 폐기물을 처리한다.
    1. 혈액 샘플 획득 및 처리
      1. 무균 기술을 사용하여 적절한 항응고제 함유 튜브에 주관절 정맥에서 공복 정맥혈 15 mL를 수집한다.
      2. 튜브를 8–10회 부드럽게 뒤집어 섞는다. 4 °C에서 2,000 × g로 10분 동안 원심분리한다.
      3. 혈장 상층액을 라벨이 부착된 멸균 튜브로 옮기고 필요에 따라 분주한다. 분석 전까지 분주액을 −80 °C에 보관한다.
    2. ELISA 수행
      1. 표준물질과 샘플 희석액을 준비한다. 지정된 항체 코팅 웰에 표준물질, 대조군 및 적절히 희석된 혈장 샘플 100 µL를 중복으로 첨가한다.
      2. 실온에서 부드럽게 흔들어주며 2.5시간 동안 배양한다. 내용물을 흡입 제거하고 0.05% polysorbate 20을 함유한 PBS(PBST, pH 7.2–7.4) 300 µL로 웰을 3회 세척하며, 마지막 세척 후 잔류 액체를 제거한다.
      3. 검출 항체 100 µL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 플레이트를 세척하고, streptavidin-HRP 100 µL를 첨가하여 실온에서 30–60분 동안 배양한다. 세척 단계를 반복한다.
      4. 발색을 위해 TMB 기질 100 µL를 첨가한다. 암소 실온에서 20–30분 동안 배양한다. 정지액을 첨가한다.
      5. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준 곡선으로부터 분석물 농도를 계산한다.
      6. 각 혈장 샘플을 중복으로 분석하고 통계 분석을 위한 평균값을 계산한다.
      7. 매 분석 실행마다 교정 표준물질과 품질 관리 샘플을 포함한다.
      8. 중복 측정값이 사전 정의된 변동 계수 기준을 충족하는지 확인한다. 기준을 초과하거나 기술적 오류가 감지되면 측정을 반복한다.
      9. 코드화된 참가자 식별자를 사용하여 최종 결과를 기록한다. 실험실 분석 전 과정 동안 검체의 익명성을 유지한다.
  4. 심초음파 검사를 통한 좌심실 이완 기능 평가
    1. 참가자 및 장비 준비
      1. 영상 획득 전 참가자가 최소 10분 동안 조용히 휴식하게 한다.
      2. 참가자를 좌측와위로 배치하고 심장 주기 동기화를 위해 ECG 리드를 부착한다.
      3. 호흡 운동을 최소화하면서 조용한 호흡 중에 모든 영상을 획득한다.
      4. 펄스파 도플러 및 조직 도플러 이미징이 가능한 2–5 MHz 위상 배열 트랜스듀서가 장착된 고해상도 초음파 시스템을 사용한다.
      5. 가능한 경우 연구 전반에 걸쳐 동일한 초음파 장비, 트랜스듀서 설정 및 획득 파라미터를 유지한다.
        참고: 모든 검사는 미국심초음파학회(American Society of Echocardiography) 및 유럽심혈관이미징학회(European Association of Cardiovascular Imaging)의 최신 권고 사항에 따라 수행한다12,22.
    2. 표준 심초음파 영상 획득
      1. 표준 흉골연 장축, 흉골연 단축, 심첨 4방도, 심첨 2방도 및 심첨 장축 뷰를 얻는다.
      2. 도플러 획득 전 이득, 깊이, 섹터 너비 및 프레임 속도를 최적화한다.
    3. 승모판 유입 혈류 측정
      1. 심첨 4방도 뷰에서 펄스파 도플러 샘플 볼륨을 승모판 엽 끝단 사이에 배치한다.
      2. 초기(E) 및 후기(A) 승모판 유입 속도를 기록한다.
      3. 분석을 위해 최소 3회의 연속적인 심장 주기를 획득한다.
    4. 조직 도플러 이미징 수행
      1. 심첨 4방도 뷰에서 펄스파 조직 도플러 이미징을 활성화한다.
      2. 샘플 볼륨을 중격 및 외측 승모판 환상막에 순차적으로 배치한다.
      3. 초음파 빔을 심근 운동과 가능한 한 평행하게 유지한다.
      4. 각 환상막 위치에서 3회의 연속적인 심장 주기를 기록한다.
    5. 환상막 속도 계산
      1. 중격 및 외측 e′ 속도를 측정한다.
      2. 각 환상막 위치에 대해 3회의 심장 주기 평균을 낸다.
      3. 평균 환상막 e′ 속도를 계산한다.
    6. E/e′ 비율 계산
      1. 승모판 E 속도를 평균 환상막 e′ 속도로 나누어 평균 E/e′ 비율을 계산한다.
      2. 가능한 경우 중격 및 외측 E/e′ 비율을 각각 보고한다.
        참고: 품질 관리를 위해 안정적인 호흡 중에 최소 3회의 연속적인 심장 주기를 획득하고, 각 심초음파 변수에 대해 3회의 독립적인 측정값의 평균을 낸다. 모든 디지털 영상은 실험실 및 식이 데이터에 눈가림 처리된 최소 2명의 숙련된 작업자가 오프라인으로 분석할 수 있도록 저장하며, 최종 데이터 분석 전 작업자 간 재현성을 평가한다.
  5. 경동맥 내중막 두께 측정을 통한 잠재적 동맥경화 유발 평가
    1. 참가자 및 장비 준비
      1. 7–15 MHz 선형 배열 혈관 트랜스듀서가 장착된 고해상도 초음파 시스템을 사용하여 경동맥 초음파 검사를 수행한다.
      2. 영상 획득 전 참가자가 앙와위로 최소 10분 동안 휴식하게 한다.
      3. 목을 약간 신전시키고 머리를 검사하는 반대 방향으로 약 30–45° 회전시킨다.
      4. 혈관 기하학적 구조를 유지하고 영상 품질을 최적화하기 위해 과도한 머리 회전을 피한다.
      5. 가능한 경우 모든 참가자에게 동일한 초음파 시스템, 트랜스듀서, 획득 설정 및 분석 소프트웨어를 사용한다.
    2. 경동맥 초음파 검사 수행
      1. 우측 및 좌측 경동맥을 각각 독립적으로 검사한다.
      2. 횡단면에서 총경동맥, 경동맥 팽대부, 내경동맥 및 외경동맥을 식별한다.
      3. 트랜스듀서를 회전시켜 루멘-내막 및 중막-외막 인터페이스가 명확하게 정의된 종단면 영상을 얻는다.
      4. 측정 전 영상 깊이, 초점 영역 및 전체 이득을 최적화한다.
    3. 경동맥 내중막 두께 측정
      1. CIMT를 루멘-내막 인터페이스의 전단 가장자리와 중막-외막 인터페이스의 전단 가장자리 사이의 거리로 정의한다.
      2. 경동맥 팽대부에서 근위로 약 10 mm 떨어진 원위 총경동맥 원벽의 플라크가 없는 분절을 선택한다.
        참고: 이 영역들이 사전 정의된 연구 결과가 아닌 한, 기본 총경동맥 CIMT 측정에 경동맥 팽대부나 내경동맥을 포함하지 않는다.
    4. CIMT 계산
      1. 각 경동맥에서 최소 3회의 측정값을 얻는다.
      2. 우측 및 좌측 경동맥의 평균 CIMT를 각각 계산한다.
      3. 우측과 좌측 평균값의 평균으로 전체 평균 CIMT를 계산한다.
      4. 각 측의 최대 플라크 없는 CIMT를 보조 기술 변수로 기록한다.
    5. CIMT 해석
      1. CIMT를 주로 연속 변수로 분석한다.
      2. 적절한 경우, 대표적인 범주형 분석을 위해서만 사전 정의된 연구 특정 CIMT 임계값(<0.7 mm 또는 ≥0.7 mm)을 적용한다.
      3. 경동맥 플라크를 CIMT 측정값과 별도로 기록한다.
        참고: 대표 분석에는 ≥0.7 mm의 CIMT 임계값만 사용하고, 가능한 경우 연령 및 성별 특정 참조 값을 사용한다. 숙련된 초음파 검사자, 코드화된 영상 및 최소 2명의 연구자에 의한 눈가림 독립 분석을 통해 품질 관리를 보장한다. 95% 신뢰 구간을 가진 ICC를 사용하여 관찰자 간 및 관찰자 내 신뢰도를 평가하고, 동맥 인터페이스가 제대로 시각화되지 않은 경우 측정을 반복한다.

6. 통계 분석

  1. 표본 크기 추정
    1. 주요 연구 목적과 예상 효과 크기에 따라 필요한 표본 크기를 산출하십시오.
    2. 유의 수준(α)의 0.05 및 최소 80%의 통계적 검정력.
  2. Shapiro–Wilk 검사와 같은 적절한 정규성 검정을 사용하여 연속형 변수의 분포를 평가하십시오.
  3. 통계 분석법 선택
    1. 정규 분포를 따르는 연속 변수는 Student's t-검정을 사용하여 분석하십시오. t-테스트.
    2. 정규분포를 따르지 않는 연속형 변수는 Mann–Whitney 검정을 사용하여 분석하십시오. U 테스트.
    3. 적절한 경우, 일원 분산 분석(one-way ANOVA) 또는 크루스칼-월리스 검정(Kruskal–Wallis test)을 사용하여 세 그룹 이상의 그룹을 비교하십시오.
    4. 카이제곱 검정 또는 피셔의 정확 검정을 사용하여 범주형 변수를 분석하십시오.
    5. 피어슨 상관분석을 사용하여 정규 분포를 따르는 변수 간의 연관성을 평가하십시오.
    6. 스피어먼 서열 상관 분석을 이용한 비정규 분포 변수 간의 연관성 평가23,24,25.
  4. 교란 변수 보정
    1. 식단 염증 지수(Dietary Inflammatory Index)와 심혈관계-대사 결과 사이의 독립적 연관성을 평가하기 위해, 적절한 경우 다변량 회귀 분석을 수행하십시오.
    2. 연령, 성별, 체질량 지수, 허리둘레, 동반 질환, 흡연 상태, 신체 활동 및 염증성 바이오마커에 영향을 미칠 수 있는 약물을 포함하여 임상적으로 유의미한 교란 변수들에 대해 회귀 모델을 보정하십시오.26.
  5. 양측 검정을 고려하십시오 p 값 <0.05 통계적으로 유의미함.
  6. 통계 분석 보고
    1. 연속형 변수를 평균으로 표시하십시오. ± 적절하게 표준편차 또는 중앙값(사분위수 범위)으로 표시함.
    2. 범주형 변수는 빈도와 백분율로 제시하십시오.
    3. 해당하는 경우, 효과 추정치와 그에 따른 95% 신뢰구간을 함께 보고하십시오.

결과

모든 참가자는 표준화된 간 초음파 검사를 통해 MASLD 진단을 받았습니다. 연구 대상 집단은 연령과 성별을 맞추었으며, 가장 흔한 동반 질환은 Table 1에 요약된 바와 같이 제2형 당뇨병, 전신 동맥 고혈압 및 이상지질혈증이었습니다. 대표 분석의 근거가 되는 원시 데이터는 Supplementary File 1에 제공됩니다.

본 프로토콜의 대표적인 적용 사례로, 식이 염증 잠재력의 지표로서 식이 염증 지수(Dietary Inflammatory Index, DII)를 분석하였습니다. 탐색적 분석 결과, DII와 E/e′ 비율 사이에 중간 정도의 양의 상관관계가 나타난 반면(Spearman's ρ = 0.50, p < 0.05), DII와 CIMT 사이에는 유의미한 상관관계가 관찰되지 않았습니다(Spearman's ρ = 0.40, p = 0.81; 그림 1). 따라서 DII-CIMT 상관관계는 탐색적이며 유의미하지 않은 결과로 해석되어야 합니다.

대표적인 생화학적 분석 결과, MASLD 환자군은 더 높은 혈장 포도당, HbA1c, 중성지방 농도를 보였으며, 상승된 중성지방 대 HDL 콜레스테롤(TG/HDL-C) 비율 및 혈장 동맥경화 지수(Atherogenic Index of Plasma)에서 나타나듯 더 큰 심혈관 위험을 나타냈습니다. 무증상 동맥경화증은 CIMT에 따라 참가자를 층화하여 추가로 평가하였습니다. 대표 분석 결과, CIMT의 증가는 체중, 체질량 지수 또는 허리둘레와는 연관성이 없었으나, MASLD의 존재와는 연관이 있는 것으로 나타났습니다(표 2).

이 프로토콜의 적용 가능성은 사전에 정의된 참여자 분류 기준을 통해 더욱 구체적으로 설명됩니다. DII(식단 염증 지수)의 가장 높은 사분위수(Q4)에 배정된 참여자는 식단으로 인한 염증 부담이 가장 큰 하위 그룹을 나타내며, Q1에 배정된 참여자는 염증 노출이 가장 낮은 그룹을 나타냅니다. 마찬가지로, CIMT(경동맥 내중막 두께)가 0.7 mm 이상인 참여자는 불현성 동맥경화증이 증가한 것으로 분류되었으며, E/e′ 값 >14는 좌심실 충만압 상승 및 이완기 기능 장애를 나타냈습니다. 이러한 사전 정의된 임계값은 식단, 혈관 및 심장 소견을 해석하기 위한 표준화된 틀을 제공하며, 참여자 그룹 간의 심장 대사 위험에 대한 재현 가능한 비교를 용이하게 합니다.

figure-results-1
그림 1: 식이 염증 지수와 초기 심혈관 대사 측정치 사이의 대표적 관계. (A) 식이 염증 지수(DII)와 좌심실 충만압의 심초음파 마커인 E/e′ 비율 간의 상관관계. (B) DII와 경동맥 내중막 두께(CIMT) 간의 상관관계(연속 변수로 분석됨). 미리 정의된 0.7 mm의 CIMT 임계값은 대표적인 범주형 분석에만 사용되었으며, 보편적인 진단 컷오프 값으로 해석되어서는 안 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MASLD 제외MASLD 동반 시p-값
(n = 10)(n = 15)
연령 (세) 42 (37 – 48)41 (39 – 43)0.37
남성 n (%)4 (40.0)8 (53.3)0.4
공복 혈당 (mg/dL)88 (83 – 94)105 (98 – 125)0.01
당화혈색소(HbA1c)5.9 (5.5 - 6.1)6.4 (6.0 – 7.2)0.02
중성지방 (mg/dL)120 (74 – 147)219 (108 – 297)0.02
HDL 콜레스테롤(mg/dL)41 (37 – 46)48 (30 – 57)0.43
TG/HDL-C 비율2.5 (1.8 – 4.9)5.1 (2.6 – 6.7)0.04
AIP0.32 (0.24 – 0.41)0.42 (0.35 – 0.62)0.04
CRP (mg/dL)0.8 (0.4 – 1.0)1.1 (0.2 – 1.3)0.23

표 1: MASLD 상태에 따른 대표적인 인구통계학적, 생화학적 및 심혈관계 대사 특성. MASLD가 없는 참가자와 MASLD가 있는 참가자의 기초 인구통계학적 특성과 대표적인 생화학적 및 심혈관계 대사 파라미터. 연속 변수는 중앙값(사분위 범위)으로, 범주형 변수는 n (%)으로 표시함. 그룹 간 비교는 연속 변수의 경우 Student's t-test 또는 Mann–Whitney U test를 사용하였으며, 범주형 변수의 경우 Fisher's exact test를 사용함. 약어: MASLD = 대사 기능 장애 관련 지방성 간질환; HbA1c = 당화헤모글로빈; TG = 중성지방; HDL-C = 고밀도 지질단백질 콜레스테롤; AIP = 혈장 죽상경화 지수; CRP = C-반응성 단백질.

초기 죽상경화증 발생진행성 죽상동맥경화증p-값
경동맥 내중막 두께 측정(CIMT) < 0.7 (n = 18)경동맥 내중막 두께(CIMT) ≥ 0.7 (n = 7)
체중 (kg) 73.4 ± 18.070.0 ± 10.60.4
BMI (kg/m2) 30.0 ± 5.2429.0 ± 4.430.46
허리둘레 (cm)90.5 ± 7.596.5 ± 2.890.48
대사 이상 관련 지방성 간질환8 (44.4)7 (100)0.01

표 2: 경동맥 내중막 두께에 따른 대표적인 신체 계측 특성.경동맥 내중막 두께(CIMT)에 따라 층화한 대표적인 신체 계측 특성 및 MASLD 유병률. 대상자는 조기 잠복성 동맥경화증(CIMT <0.7 mm) 또는 증가된 잠복성 동맥경화증(CIMT ≥0.7 mm)으로 분류되었다. 연속 변수는 평균 ± 표준 편차로, 범주형 변수는 n (%)으로 나타내었다. 그룹 간 비교는 적절하게 Student's t-test, Mann–Whitney U test 또는 카이제곱 검정을 사용하여 수행하였다. 약어: BMI = 체질량 지수; WC = 허리둘레; CIMT = 경동맥 내중막 두께.

보충 파일 1: 본 연구에서 설명된 분석에 사용된 원시 데이터 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 문서에서 설명하는 방법은 간 관련 대사 기능 장애가 초기 죽상동맥경화증에 기여한다는 가설27,28을 바탕으로, 심혈관 대사 및 죽상동맥경화성 부담이 대사 기능 장애 관련 지방간질환(MASLD)과 연관되어 있는지 조사하기 위한 표준화된 워크플로우를 제공합니다. 제안된 워크플로우는 방법론적 일관성과 재현성을 높이기 위해 대상자 선정, 식단 평가, 바이오마커 정량화, 심혈관 영상 촬영, 품질 관리 및 데이터 검증에 대한 표준 절차를 수립합니다. 가능한 경우, 조사자와 기관 간의 검사자 의존적 변동성을 최소화하기 위해 모든 측정은 동일한 장비, 표준화된 획득 파라미터, 숙련된 인력, 중복 검증 및 눈가림 영상 분석을 통해 수행됩니다. DII 계산은 자기 보고식 식단 섭취의 정확도에 달려 있으므로, 구조화되고 이미지가 지원되는 식품섭취빈도조사지(FFQ)를 이용한 식단 평가가 핵심 요소가 됩니다. 표준화된 참조 분량과 시각적 보조 도구를 사용하면 회상 편향을 줄이고 개인 간 비교 가능성을 높일 수 있습니다29,30. 마찬가지로, 45가지 식단 파라미터의 글로벌 참조 데이터베이스를 사용하여 식이 염증 지수(DII)를 추정함으로써 서로 다른 인구 집단 간의 식이 염증 잠재력을 표준화하여 평가할 수 있습니다8,9. 이 단계에서 식단 섭취가 잘못 분류되면 심혈관 대사 결과와의 연관성이 약화될 수 있습니다. 또한, 생화학적 마커, 좌심실 이완 기능(E/e′)의 심초음파 평가 및 경동맥 내중막 두께(CIMT)를 통합함으로써 초기 심혈관 대사 위험에 대한 종합적인 평가가 가능합니다. 가이드라인에서 권장하는 프로토콜을 엄격히 준수하면 검사자 의존적 변동성을 최소화하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 심혈관 측정값을 확보할 수 있습니다12,15,22.

DII는 MASLD를 진단하거나 심혈관계 대사 질환을 독립적으로 예측하기 위한 것이 아니라, 식이 염증 잠재력의 개인 간 변동성을 특성화하기 위한 것임을 강조하는 것이 중요합니다. 따라서 MASLD 환자 모두가 높은 DII 점수를 보일 것으로 예상되는 것은 아니며, 높은 DII가 반드시 진행된 심혈관계 대사 이상을 나타내는 것도 아닙니다. 대신, 본 프로토콜에서는 DII를 층화 변수로 사용하여 식이 염증 부담의 증가가 MASLD 스펙트럼 전반에 걸쳐 진행성 잠재적 심혈관 변화와 관련이 있는지 조사합니다. 실행 가능성을 높이기 위해 본 프로토콜에는 임상 현장에서의 적용이 용이하도록 인구 집단에 맞게 조정된 FFQ가 포함되어 있습니다. 포괄적인 식이 조사 도구가 더 넓은 범위의 영양소를 포착하지만, 간소화된 FFQ 또한 DII 및 식이 관련 염증 패턴을 추정하는 데 있어 수용 가능한 타당성을 입증하였습니다31.

본 프로토콜은 실험실 및 영상 평가 시 재현성을 향상시키기 위해 표준화된 품질 관리 절차를 통합하고 있습니다. 표준화된 혈액 채취, 적시의 시료 처리, 적절한 보관 조건, 코드화된 시료 식별, 실험실 측정값의 중복 측정 및 품질 관리 시료의 포함을 통해 분석적 변동성을 최소화합니다. 마찬가지로, 표준화된 환자 자세 설정, Doppler 정렬, 획득 단면 및 여러 심장 주기의 평균화를 통해 심초음파 측정의 변동성을 줄이며, 표준화된 플라크가 없는 원거리벽 총경동맥 분절을 이용한 양측 CIMT 평가와 독립적인 눈가림 영상 검토를 통해 혈관 측정 재현성을 높입니다. 이 워크플로우는 서로 다른 연구 환경에 적응 가능하므로, 실험실 인프라가 제한적인 센터에서도 가용 자원과 연구 목적에 따라 추가적인 분자 또는 염증 바이오마커를 도입하기 전에 식이 평가, 신체 계측 평가 및 초음파 기반 심혈관 평가를 먼저 구현할 수 있습니다.

이 워크플로우의 추가적인 강점은 불일치하는 표현형을 가진 참가자를 식별할 수 있다는 점입니다. 예를 들어, 매우 염증 유발적인 식습관을 가지고 있으나 심혈관 대사 이상 징후가 없는 개인이나, 반대로 심혈관 대사 장애가 뚜렷함에도 불구하고 DII 수치가 상대적으로 낮은 개인 등을 식별할 수 있습니다. 이러한 발견은 식습관, 인슐린 민감성, 내장 지방, 신체 활동, 유전적 및 후성유전적 요인, 약물 치료, 수면의 질 및 심혈관 대사 건강의 기타 환경적 결정 요인 사이의 복잡한 상호작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 표준화된 프로토콜을 적용한 종단적 연구를 통해 MASLD에서 식단 염증 부담과 심혈관 대사 질환 진행 사이의 관계를 더욱 명확히 규명할 수 있을 것입니다.

본 프로토콜의 몇 가지 제한점을 고려해야 합니다. 단면 연구 설계로 인해 식이 염증 잠재력과 심혈관계 대사 손상 사이의 관계에 대한 인과적 추론이 불가능합니다. 또한, DII는 급성 염증 반응보다는 습관적인 식이 패턴을 반영하며, 자기 보고식 식이 평가는 회상 편향에 취약합니다32. 전신 염증 마커로서 C-반응성 단백질(CRP)에 의존하는 것은 광범위한 사이토카인 프로파일링에 비해 미세한 염증 변화를 과소평가할 가능성이 있습니다33. 마찬가지로, CIMT 재현성은 평가된 동맥 분절, 벽 선택, 심장 주기 타이밍 및 측정 횟수에 따라 달라집니다. 따라서 연속적인 CIMT 분석과 인구 집단별 백분위수 기반 해석이 바람직하며, 대표 결과에서 사용된 ≥0.7 mm 임계값은 보편적인 임상 임계값이 아니라 미리 정의된 연구 특정 분석 컷오프 값으로 간주해야 합니다. 중요한 점은, 본 프로토콜이 진단 또는 예후 알고리즘이 아니라 조기 심혈관계 대사 위험 평가 워크플로우로 고안되었다는 것입니다. 주로 신체 계측, 혈압 측정, 혈당 상태, 간 관련 생화학적 검사 및 지질 프로파일링에 의존하여 심혈관 위험을 추정하는 MASLD 환자 대상의 기존 심혈관계 대사 스크리닝 방식34,35과 달리, 본 워크플로우는 다섯 가지 상보적 영역을 통합합니다: (i) DII로 정량화된 식이 염증 부담, (ii) 생화학적 심혈관계 대사 프로파일링, (iii) 순환 염증 바이오마커, (iv) E/e′ 비율을 이용한 좌심실 이완 기능의 심초음파 평가, (v) 조기 불현성 동맥경화 마커로서의 CIMT입니다. 이러한 상보적 평가들을 통해 기존의 심혈관계 대사 스크리닝을 대체하는 것이 아니라 이를 보완하면서, 임상적으로 명백한 심혈관 질환이 발생하기 전의 조기 대사 및 혈관 변화를 식별하기 위한 표준화되고 비침습적이며 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다1,3,12,15,34,35,36,37,38,39.

공개 사항

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

감사의 글

저자들은 Institutional Program E015의 재정적 지원을 받았음을 밝힙니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ELISA 분석 키트 Abcamab6532896-well 플레이트용 Abcam 비색 ELISA 분석 키트
흡광도 측정용 마이크로플레이트 리더, SunriseTecan 30190079검출 모드: Absorbance; 파장 범위: 340 nm - 750 nm; 필터 파장: 405 nm, 450 nm, 492 nm, 620 nm; 플레이트 형식 96 well 플레이트
혈압계HomecareANEROIDE 1000후크가 포함된 100% 면 소재의 자가 조절 팔찌, 성인 동맥 지표 커프
CIMT 측정용 초음파 기기Philips EPIQ7L12-3 Broadband Linear Array Transducer선형 트랜스듀서(Broadband Linear Array Transducer)

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