테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

요약

tBHP를 이용한 HNM 조기 노화 유도 표준화 프로토콜, 성장 정지, SA-β-갈락토시다제 활성, SASP 인자 등 주요 노화 지표 분석의 표준화 프로토콜.

초록

자외선, 대기 오염, 담배 연기 등 환경적 스트레스 요인이 외부 피부 노화를 유발합니다. 이러한 외부 노화 요인에 노출되면 노화 세포가 축적되어 주름과 색소침착 장애가 형성됩니다. 일차 자외선 차단을 제공하는 멜라닌사이트는 나이가 들수록 활성이 감소합니다. 노화된 멜라닌 세포는 노화된 피부에 축적되어 노화 외관에 기여합니다; 그러나 멜라닌사이트 노화를 연구하는 모델은 거의 없으며, 이 연구는 추가 연구를 위한 재현 가능한 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 본 연구에서는 잘 특성화된 산화 스트레스 유발제인 삼부틸 하이드로퍼옥사이드(tBHP)를 사용하여 인간 신생아 멜라닌세포(HNM)의 노화 모델을 제시합니다. tBHP는 세포의 항산화 방어를 소모시키고 과도한 생성을 촉진하여 산화환원 항상성을 방해하여 DNA와 단백질 손상을 초래합니다. 우리는 제한된 성장 잠재력, 형태학적 변화, SA-β-갈락토시다제 활성 등 확립된 노화 마커를 분석하여 tBHP 처리된 멜라닌세포의 노화 표현형을 특성화합니다. 이 모델은 멜라닌세포의 스트레스로 인한 조기 노화를 조사하는 데 유용한 도구를 제공하며, 외재성 피부 노화 및 색소침착 장애에서의 역할에 대한 통찰을 제공합니다.

서론

피부 노화는 두 가지 뚜렷한 요인으로 구성됩니다: 내재성 노화와 외인성 노화 ^1,2. 내재 노화는 자연적인 시간 과정과 유전적 요인에 의해 발생하며, 외재적 노화는 주로 자외선과 같은 환경 스트레스 요인에 누적되어 발생하며, 이로 인해 노화 과정을 정상적인 시간 속도를 넘어 가속화됩니다 ^3,4. 환경 노출은 세포 내 항산화 방어를 압도하는 산화 스트레스를 발생시켜 DNA 손상, 단백질 산화, 지질 과산화를 초래합니다. 이러한 분자 변형은 지속적인 DNA 손상 반응과 세포 기능 장애를 유발하여 궁극적으로 조기 노화를 촉진합니다 ^5,6. 이러한 스트레스로 인한 노화는 주름, 고르지 않은 색소침착, 탄력 저하, 장벽 기능 저하 등 노화 피부의 임상적 특징에 기여합니다⁷.

멜라닌사이트는 기저 표피에 위치하며, 멜라닌을 합성하여 주변 각질세포로 전달함으로써 자외선 손상에 대한 피부의 주요 방어 역할을 합니다. 역설적으로, 이러한 보호 역할 때문에 외^{재 노화} 중 산화 스트레스와 조기 노화에 특히 취약^하다. 멜라노생성 과정 자체는 티로시나아제 촉매화 반응의 부산물로 상당한 양의 활성산소 종을 생성하며, 이는 자외선과 오염과 같은 환경 노출에 의해 더욱 증폭되는 고유한 산화 부담을 만듭니다^10,11. 그 결과, 만성 환경 스트레스는 산화 손상, 미토콘드리아 기능 장애, 궁극적으로 세포 노화를 유발할 수 있습니다¹². 중요함에도 불구하고, 멜라닌세포 노화를 조절하는 분자 경로와 산화 스트레스가 이 과정을 어떻게 시작하는지에 관한 핵심 질문들이 남아 있습니다. 더불어, 노화 멜라닌사이트가 주변 피부 미세환경에 미치는 영향은 특히 SASP 인자 분비를 통해 노화 관련 피부 변화의 원인으로 알려져 있으나,^13,14.

멜라닌사이트는 특히 산화 스트레스로 인한 노화에 취약하지만, 이 과정을 연구할 수 있는 실험 모델은 여전히 제한적입니다^15,16. 대부분의 노화 연구는 섬유아세포에서 복제 또는 스트레스 유발 노화 모델에 계속 의존하지만, 이러한 접근법은 멜라노세포의 독특한 생물학이나 이웃 세포와의 교차 상호작용을 통한 피부 노화 영향을 포착하지 못한다¹⁷. 이 격차는 환경 스트레스 요인에 대한 멜라닌사이트의 생리적 반응과 인간 피부 노화에 대한 기여를 보다 정확하게 반영하는 멜라노사이트 특이적 노화 모델의 필요성을 강조합니다^18,19.

스트레스 유발 노화 접근법이 있음에도 불구하고, 원발성 인간 멜라닌사이트에서의 적용은 기술적으로 여전히 어렵고 상당한 변동성과 연관되어 있습니다. 멜라닌사이트는 산화 스트레스에 특히 민감하여 효과적인 노화 유도와 과도한 세포독성 사이의 실험적 창이 좁습니다. 또한, 기증자 의존적 1차 세포 준비 차이는 연구 간 결과의 불일치에 기여합니다. 이러한 문제들은 종종 과소보고되며, 프로토콜은 충분히 표준화되어 있지 않아 재현성이 제한됩니다. 본 프로토콜은 최적화되고 재현 가능한 치료 요법, 정의된 투여 일정, 표준화된 측정 결과를 제공하여 원발성 인간 멜라닌세포의 노화 유도 및 평가를 신뢰성 있게 제공합니다.

테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드(tBHP)는 활성산소 종을 생성하고 세포의 항산화 방어를 감소시켜 노화를 촉진하는 잘 알려진 산화 스트레스 유발제입니다. 이 약물은 피부 섬유아세포에서 노화를 유도하는 데 널리 사용되어 왔으며, 세포 생존력을 유지하면서 특징적인 노화 마커를 유발합니다^20,21. tBHP는 정의된 생화학적 경로를 통해 지속적인 산화 스트레스를 발생시키기 때문에, 산화 스트레스로 인한 노화를 연구하고 산화 손상과 노화 과정의 분자 메커니즘을 연구할 수 있는 재현 가능하고 접근 가능한 시스템을 제공합니다^22,23. 자외선 기반 모델과 달리, tBHP는 조사 매개변수와 무관하고 특수 장비 없이도 통제되고 재현 가능한 산화 스트레스 유도가 필요할 때 특히 유리합니다.

HNM은 외재적 노화 메커니즘을 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다²⁴. 포피에서 유래한 1차 세포로서 스트레스 반응 경로를 온전히 유지하며 유전자 변형이나 불멸화와 관련된 인공물을 피합니다²⁵. 신생아 멜라닌세포는 최소한의 기초 손상을 보여 환경 스트레스 유발 노화 경로를 명확히 평가할 수 있어 최적의 실험 모델을 제공합니다^26,27.

본 연구는 tBHP 유도 산화 스트레스를 원발 인간 신생아 멜라닌세포에서 활용하여 노화 연구에 흔히 사용되는 비멜라닌시티 및 불멸화 세포 모델의 한계를 극복합니다. 이 연구는 멜라닌사이트 특이적 노화 메커니즘을 검토하고 확립된 표지자를 가진 노화 표현형을 특징짓는 표준화된 플랫폼을 제공합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 멜라닌세포에서 산화 스트레스로 인한 노화 연구를 위한 재현 가능하고 생리학적으로 중요한 모델을 제공합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 tBHP에 의해 유발되는 스트레스 유발 조기 노화 기전을 연구하기 위해 인간 신생아 멜라노사이트(HNM) 연구를 위해 최적화되었습니다(그림 1). 멜라닌사이트는 신생아 백인 포피(밝은 색소 광형)에서 유래했으며, 상업적 공급처에서 얻었습니다. 공급업체 문서에 따르면, 헬싱키 선언 및 관련 데이터 보호 규정을 포함한 확립된 윤리적·법적 틀을 준수하여, 충분히 정보를 제공하고 동의를 제공한 기증자로부터 인간 조직을 수집합니다. 세포들은 신원 확인 해제 형태로 제공되었습니다. 이 연구에서 사용하기 위해 추가적인 윤리적 승인은 필요하지 않았습니다. 모든 실험은 일관성을 보장하기 위해 동일한 멜라닌세포 라인을 사용하여 수행되었습니다. 서로 다른 1차 세포주를 사용할 경우, 배양 조건, 농도 및 취급 절차가 추가로 조정되어야 할 수 있음을 유의하세요.

1. 준비

참고: tBHP 치료를 시작하려면 멜라닌세포를 최소 3일 전에 해동하여 충분한 회복과 융합을 보장해야 합니다. 처리 단계는 4일이며, 파종일은 0일로 지정됩니다. 이 연구에 사용된 모든 재료의 세부 사항은 재료표에 나와 있습니다.

1. 배양지를 준비하기 위해 멜라노사이트 기저 배지를 해당 성장 인자와 결합합니다. 각 바이알의 뚜껑을 불꽃으로 불태우고 내용을 배지에 넣기 전에 오염을 최소화하세요. 준비된 배지에 1% (v/v) 펜스트렙을 첨가하고 4 °C에서 보관하다가 사용하세요.
2. 씨앗을 뿌리기 전에 대두 트립신 억제제를 DPBS에 희석하여 트립신 억제제 용액을 준비합니다. 용액을 0.22 μm 막에 걸러내어 알리코트(aliquot)를 사용한 후 −20 °C에서 저장합니다. 해동되면 최대 10일간 사용할 수 있습니다.

2. 세포 해동 (3일차)

주의: 인간 세포와 접촉하는 모든 물질은 생물학적으로 오염된 것으로 간주되어 기관 생물안전 지침에 따라 폐기되어야 합니다. 노화 평가를 위해 우리는 성장 정지, SA-β-gal 활성, 추가 분자 표지자를 평가하는 보완 검사법을 사용합니다. 여기서는 이러한 검사 프로토콜과 노화 지표를 다룰 때 예상되는 결과를 제시합니다.

1. 20mL의 Dulbecco's Phosphate Buffer 식염수(세포 배양 등급)를 실온에서 50mL 원뿔형 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 해동될 때까지 세포가 들어 있는 바이알을 얼음 위에 보관하세요.
2. 셀이 들어 있는 바이알을 열기 전에 뚜껑에 불을 붙이고, 나사를 풀고 옆면을 다시 불태워 오염 가능성을 막으세요.
3. 세포가 들어 있는 바이알에 500 μL DPBS를 옮깁니다. 피펫을 위아래로 부드럽게 녹인 후 전체 내용을 튜브로 옮깁니다.
4. 100 × g 원심분리기를 실온에서 5분간 가열하세요. 결과물은 베이지색에서 갈색(또는 기증자의 민족에 따라 더 어두운 색)을 띠게 됩니다.
5. 멜라닌사이트 배지 14mL가 들어간 T75 플라스크를 준비하세요.
6. 유리 파스퇴르 피펫(멜라닌세포 다룰 때마다 불을 붙이기)을 불꽃으로 붙이고, DPBS를 조심스럽게 흡입한 후 펠릿을 1mL 배지에 재현탁합니다.
7. 미리 준비된 플라스크로 옮기세요.
8. 37°C, 5% CO₂에서 배양한 후 매일 현미경으로 관찰합니다. 최소 48시간마다 매체를 바꾸세요.
   참고: 각 냉동 보존 바이알에는 약 1× 10⁶개의 1차 인간 멜라닌 세포가 들어 있습니다. 모든 실험은 9번 통과 시 세포를 사용하여 수행되었습니다.

3. 세포 시딩 (0일차)

1. 씨앗 심는 날에 세포의 80–90%가 합쳐지도록 하세요.
2. 플라스크에서 배지를 흡입하고 DPBS로 두 번 세척하세요.
3. 2mL의 트립신-EDTA 용액을 추가하여 37°C, 5% CO₂에서 5분간 배양하여 세포를 분리합니다.
4. 플라스크를 부드럽게 두드리고 현미경으로 관찰하여 세포 박리가 완전히 이루어졌는지 확인하세요(필요하면 더 오래 배양하세요).
5. 반응을 멈추려면 트립신 억제제를 1.5배 양으로 추가하세요.
6. 세포 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 DPBS로 희석하여 최종 부피 10 mL로 만듭니다.
7. 셀 현탁액을 100 × g 에서 5분간 원심분리합니다.
8. 상정액을 흡인한 후 원하는 양으로 배지에 재현탁합니다.
9. tBHP 처리된 플레이트의 경우, 10cm 접시당 6×⁵ 셀 10개를 시드로 심으세요. 대조판은 4×^5셀 10개씩 시드하세요.
   참고: tBHP 처리된 플레이트의 경우, 실험에 충분한 세포가 확보되도록 더 높은 세포 밀도를 시드해야 하며, 처리 과정에서 성장 속도가 점차 감소합니다. 현미경 실험을 위해 커버슬립에 세포를 시딩할 경우, 커버슬립은 0.1 mg/mL 폴리-D-라이신으로 코팅하고 완전히 건조된 후 세포 시딩을 해야 합니다.
10. 5% CO₂와 함께 37°C에서 하룻밤 배양하세요. 대조판은 48시간마다 매번 매체를 교체하세요.

4. tBHP 치료 (1일째–4일차)

1. tBHP 스톡(DPBS 또는 배지에 희석)으로 10 mM 작업 용액을 준비합니다.
   참고: tBHP는 빛에 민감합니다. 작업할 때는 용기를 덮어야 합니다. 작동 용액은 4 °C에서 적절히 보관하면 최대 일주일까지 사용할 수 있습니다. 치료 일정: 1일째(씨뿌린 다음 날)가 tBHP 노출 시작을 의미합니다. 멜라닌사이트는 하루 두 번 처리하며, 적용 간격은 최소 4시간 간격으로 둡니다. 이 방법은 1일째부터 4일째까지 반복되어 총 4일간 치료합니다. 선정된 tBHP 농도와 치료 일정은 이전 진피 섬유아세포 연구에서 채택되었으며, 낮은 농도가 노화를 유발하기에 충분했습니다. 그러나 1차 멜라닌사이트에서는 강력한 노화 유도를 달성하기 위해 더 높은 농도가 필요했으며, 노화 유도와 세포 생존성의 균형을 맞추는 적정 실험을 바탕으로 100 μM tBHP가 최적임이 확인되었습니다
2. 각 처리당 1시간 동안 세포에 100 μM tBHP를 첨가합니다 (시작하려면 적절한 양의 작업 용액을 추가하고, 반드시 액체 배지에 피펫을 넣어야 합니다.)
3. 플레이트를 앞뒤로, 좌우로 움직여 tBHP(tBHP)를 매체 전체에 고르게 분배하세요.
   참고: 원을 그리는 운동은 tBHP 매질을 통해 불균등하게 분포할 수 있으므로 피해야 합니다.
4. 5% CO₂와 함께 37°C에서 정확히 1시간 배양합니다.
5. tBHP 처리를 종료하려면 배지를 흡인하세요.
6. 미리 가열된 DPBS(37 °C)로 플레이트를 두 번 세척합니다.
7. 접시에 신선한 배지를 적당히 넣으세요.
8. 다음 치료를 시작하기 전에 최소 4시간 동안 인큐베이터에서 세포가 회복할 시간을 주세요.
9. 두 번째 치료는 같은 날에 이 절차를 반복하고, 나머지 며칠 동안도 계속하세요. 치료 종료 후 9일째까지 세포를 배양 상태로 유지하여 노화 표시자를 평가하세요.
10. 제어 판과 통로가 연결되어 있으면 모니터링하세요.

5. 성장 곡선 분석

1. 시딩 프로토콜에 따라 tBHP 처리된 세포와 대조군을 세세요.
2. 초기 밀도는 같거나 모든 셀을 다시 씨종하세요. tBHP 플레이트의 6개 ×¹⁰ 개 5개 셀보다 적을 수 있다면 말이죠.
3. 배양 4일, 9일, 15일차에 세포 수를 측정합니다.
4. 성장 곡선은 다음 공식으로 계산합니다:
   lg (count) - log (seed) / 0.301 + cPDL
   카운트: 통과 종료 시 얻은 셀 수.
   씨앗: 통과 시작 시 처음 플레이트링된 세포 수.
   cPDL: 누적 인구 두 배 수준은 이전 구절에서 이어집니다.

6. SA-β-갈락토시다제 활성

1. 9일째에는 PBS에서 세포를 두 번 세척한 후 2% 포름알데히드와 0.4% 글루타알데히드로 고정합니다.
2. 세포를 PBS로 두 번 세척하세요.
3. pH 6.0(150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 5 mM 페리시안화물 칼륨, 5 mM 페로시안화물 칼륨, 40 mM 구연산, 12 mM 인산나트륨, 1 mg/mL 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토사이드(X-gal))의 염색 용액으로 고정 세포를 인큐브합니다.
4. 37 °C에서 CO₂가 없는 상태에서 18시간 배양 후, PBS로 두 번 세척합니다.
5. 광학 현미경을 이용한 영상.
6. 현미경 아래에서 푸른 색이 염색된 세포 수를 세고 밭 내 총 세포 수로 나누어 정량화합니다. 결과를 양성 세포의 비율로 표현하세요.

7. 면역형광 염색

주의: 포름알데히드, 글루타알데히드 및 파라포름알데히드 함유 폐기물은 유해 화학 폐기물로 취급하여 기관 안전 규정에 따라 처리해야 합니다.

1. 0.1 mg/mL 폴리-D-라이신으로 미리 코팅된 커버슬립에 배양된 세포를 사용하세요.
2. 9일째에는 세포를 두 번 세척한 후 4% 파라포름알데히드로 15분간 고정합니다.
3. 세포를 PBS로 두 번 세척하세요.
4. PBS에 0.3% 트리톤-X와 0.1% 시트레이트 나트륨을 사용해 투과됩니다.
5. 1% BSA를 PBS-T에 넣어 상온에서 30분간 블록을 사용하세요.
6. 1차 항체 γH2AX로 세포를 배양하여 4°C의 가습 챔버에서 밤새 영구적인 DNA 손상 반응을 검출합니다.
7. 다음 날에는 PBS로 두 번 세안하세요.
8. 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 도포하세요.
9. 원한다면 DAPI로 염색핵을 염색해도 됩니다.
10. PBS-T로 두 번 세척한 뒤, PBS로 두 번 세척, ddH₂O로 두 번 세척합니다.
11. 커버슬립을 부착하고 완전히 말린 후 영상을 찍으세요.
12. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 평균 형광 강도 및/또는 γH2AX 초점을 분석합니다.

8. RNA 분리 및 RT-qPCR

주의: β-머캅토에탄올은 매우 독성이 강하므로 반드시 연기함에서 처리해야 합니다. β-머캡토에탄올이 포함된 폐기물은 유해 화학 폐기물로 폐기되어야 합니다.

1. 9일째에는 2mL의 트립신-EDTA를 사용해 세포를 트립신화합니다.
2. 반응을 멈추려면 트립신 억제제의 1.5배를 바르세요.
3. 세포 현탁액을 15mL 원뿔관에 옮기고, 100 x g 에서 원심분리기를 5분간 보관합니다.
4. 상정액을 조심스럽게 흡취하세요.
5. 용해 세포 펠릿은 1% β-머캅토에탄올을 포함한 350 μL RLT 버퍼에 재현탁하여 생성됩니다.
6. 컬럼 기반 RNA 정제 키트를 사용해 RNA를 분리합니다.
7. 분광광도계(260 nm)를 사용해 RNA 농도를 측정합니다.
8. cDNA 합성을 위해서는 표준 역전사 혼합물(RT 버퍼, dNTP, 무작위 프라이머, 역전사효소, RNase 억제제 포함)을 사용하여 총 반응 부피 10 μL의 역전사를 위해 1 μg RNA를 사용하고, 제조사 지침에 따라 열순환 조건을 거칩니다.
9. SASP 인자에 대해 RT-qPCR 수행
   참고: 선택된 SASP 인자(IL-8, IL-6, MMP-1)는 노화 관련 분비 표현형의 잘 확립된 구성 요소를 나타내며, 염증 신호 전달 및 세포외 기질 재형성 등 피부 생물학과의 관련성을 기준으로 선정되었습니다
   IL-6 (전우: 5' AAGCCAGCTGTGTGCAGATGAGTA 3' 회전: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
   IL-8 (전진: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' 회전: 5' AAACTGCACCTTCACACAGAG 3')
   MMP-1 (전진: 5' CATCGTGTGTGCAGCTCATCATGA 3' 회전: 5' ATGGGCTGGAGGAGGATTTTG 3')
   GAPDH (전진: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' 회전: 5' GATCTCGCTCCTCTGGAGAGAG 3')
10. 하우스키핑 유전자 GAPDH에 정규화하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 mRNA 발현을 분석합니다.

9. 단백질 분리 및 웨스턴 블롯

1. 9일째에는 단백질 용해체를 채취하세요.
2. 매체를 흡입하고 냉각 DPBS로 플레이트를 두 번 세척하세요.
3. 용해세포는 150 μL RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트나트륨, 0.1% SDS, 2 mM EDTA)를 첨가한 후 세포 스크레이퍼를 이용해 기계적으로 사용하며, 프로테아제 억제제를 보충하여 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.
4. 냉동과 해동을 3회 반복한 후 얼음 위에서 30분간 부화합니다.
5. 원심분리기는 9600 x g , 4 °C에서 10분간 가열합니다.
6. BCA 분석법을 사용하여 상청액의 단백질 농도를 측정합니다.
7. 단백질을 같은 양(20 μg)을 폴리아크릴아마이드 겔에 분리하여 활성화된 PVDF 막으로 옮깁니다.
8. TBS-T 5% 탈지유에 막을 차단하세요.
9. 1차 항체 pRB와 LaminB1을 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
10. 다음 날에는 막을 TBS-T로 3번 세척하세요.
11. HRP 결합된 적절한 2차 항체에 상온에서 1시간 인큐베이팅.
12. 화학발광으로 단백질을 검출하고 덴시토미터 분석을 수행합니다.

결과

tBHP 치료는 인간 신생아 멜라닌 세포에서 성장 정체를 유도합니다.
tBHP 처리는 치료받지 않은 대조군에 비해 멜라닌세포 증식을 억제합니다(n = 3)(그림 2A). 9일째에는 처리된 세포가 1.4 cPDL에 도달하는 반면, 대조군은 3.1 cPDL에 도달합니다. 이 차이는 시간이 지남에 따라 커져, 치료된 멜라닌세포는 15일째에 1.9 cPDL의 정체기에 근접하는 반면, 대조군은 거의 5.1 cPDL까지 확장됩니다. 증식 능력의 지속적인 감소는 스트레스로 인한 조기 노화 표현형과 일치합니다.

세포 크기 증가와 형태 변화는 세포 노화의 특징을 강조합니다.
tBHP로 처리된 멜라닌세포는 모든 측정 시점에서 대조군에 비해 세포 표면적이 증가한 것으로 나타났습니다(n = 3)(

토론

이 프로토콜은 tBHP를 사용하여 인간 신생아 멜라닌세포에서 스트레스 유발 조기 노화(SIPS)를 유도하는 표준화된 접근법을 확립하여, 이 세포 유형에서 노화를 연구할 수 있는 견고한 모델을 제공합니다. 증식, 형태, SA-β-gal 활성, DNA 손상 마커, SASP 구성 요소의 일관된 변화가 유도된 표현형을 뒷받침합니다. 피부 생리학과 색소침착 질환에서 핵심적인 역할을 함에도 불구하고 노화 연구에서 아직 연구가 부족한 멜라닌세포에 집중함으로써 이 모델은 이 분야의 중요한 격차를 해소하는 데 도움을 줍니다. 원발 멜라닌세포에서 산화 스트레스를 조절하여 유도하는 과정은 이러한 세포가 스트레스에 어떻게 반응하는지, 그리고 노화가 피부 노화 과정에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 생리학적으로 중요한 시스템을 제공합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 µm membrane filter	Merck	SLGVR33RS
1 M citric acid	Merck	K91567844	aq. dest.에서 준비
1 M MgCl2	Merck	A649033	aq. dest.에서 준비
1 M Na2HPO4	Merck	K56036736	aq. dest.에서 준비
10 M NaOH	Lab Honeywell	30620	aq. dest.에서 준비
37% formaldehyde	Sigma	252549
4% paraformaldehyde	CarlRoth	0335.3
5 M Sodium Chloride	Sigma	S3014	aq. dest.에서 준비
50% glutaraldehyde	Sigma	G6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)	Sigma	B9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mL	Invitrogen	A11008
BSA (bovine serum albumin)	Sigma	A7030
Chemiluminescent substrate	Sigma	WBKLS0500
Costar CellLifter	Corning	3008
Coverslips for cell culture/microscopy	Epredia	CB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal Medium	CellSystems	LM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit	CellSystems	LS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Human neonatal melanocytes	CellSystems	FC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)	Abcam	AB16048	5% BSA에서 1:1000으로 희석
Mounting medium containing DAPI	Abcam	AB104139
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P4333
Polyacrylamide gradient gels	Bio-Rad	456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL	Gibco	A38904-01
Potassium ferricyanide	Sigma	P8131
Potassium ferrocyanide	Sigma	P-9387
pRB antibody (rabbit)	CellSignalling	93085	5% BSA에서 1:1000으로 희석
Protease inhibitor cocktail	자체 제조	N/A	500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer	자체 제조	N/A	50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA 포함
RLT buffer	Qiagen	1015762	RNeasy Mini Kit에 포함
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)	Sigma	70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)	Sigma	S4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL	Thermofisher	17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)	Sigma	458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)	Sigma	T9284
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-mercaptoethanol	CarlRoth	4227.3
γH2AX antibody (rabbit)	CellSignalling	2577S	1:200으로 희석