방법 논문

Xenopus mini 배아를 생성하기 위한 신체 조작

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DOI:

10.3791/70602

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2026년 4월 10일

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

이 논문에서

요약

우리는 Xenopus laevis 1세포 배아로부터 미니 배아를 만드는 물리적 수축 방법을 설명합니다.

초록

초기 배아 발생의 특징 중 하나는 전체 배아 부피는 일정한 반면, 개별 세포 크기는 급격하고 기하급수적으로 감소한다는 점입니다. 핵세포질 비율(N:C) 비율은 초기 배아 발생에 필수적인 세포 및 분자 활동을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 따라서 배아 크기의 물리적 조작은 이러한 발달 메커니즘을 연구하는 중요한 방법입니다. Xenopus laevis 초기 배아의 큰 크기(~ 1.2mm)와 높은 발달 가소성은 발달 조절 메커니즘을 조사하기 위한 물리적 해부 및 조작에 이상적인 모델이 됩니다. 여기서는 모발 매듭으로 1세포 Xenopus laevis 배아를 조여 세포질 부피와 N:C 비율이 변화한 미니 배아를 생성하는 방법을 설명합니다. 이렇게 만들어진 미니 배아들은 세포 크기 감소와 N:C 비율 성장에 의해 직접 유도되는 초기 접합 유전체 활성화(ZGA)를 시작하는 것으로 나타났습니다. 이러한 미니 배아는 다른 배아 시스템으로 일반화할 수 있어, 초기 배아 발달의 크기 매개 메커니즘을 해부하는 독특하고 강력한 도구를 제공합니다.

서론

초기 배아 발생에서 가장 두드러진 특징 중 하나는 일정한 부피를 유지하는 배아 내에서 개별 세포 크기가 기하급수적으로 감소한다는 점입니다. 빠른 DNA 합성과 세포 크기 감소는 핵세포질 비율(N:C 비율)을 증가시키며, 이는 접합 유전자 전사, 세포 주기 연장, 세포 운동성 1,2,3,4 등 모델 배아 시스템에서 중간 배반 전이(MBT)의 여러 주요 활동을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 . DNA 배수면을 변화시켜 N:C 비율을 조작하는 결과, 여러 모델 시스템 3,4,5,6에서 초기 배아 발생에서 기능적 중요성을 뒷받침합니다.

배아 크기의 물리적 조작은 초기 배아 발달에서 조절 메커니즘을 연구하는 데 중요한 기법입니다7. 흡인에 의한 세포질 제거는 초기 쥐 배아에서 N:C 비율을 변화시키며, 조기 압축을 유도합니다8. 더불어, 절단하여 제브라피시 배아 크기를 줄이면서 체석 스케일링이라는 새로운 구배 기반 메커니즘이 밝혀졌다. 더 나아가, Xenopus 배아에서 세포질 부피를 줄였을 때 N:C 비율에 따라 세포 주기 역학이 나타나10. 중요하게도, 세포 크기를 줄여 Xenopus mini 배아를 생성하고 단일 세포에서 5-에티닐-우리딘(5-EU)으로 신생 전사체를 표지함으로써, 세포 크기 축소가 용량 의존적으로 접합 게놈 활성화(ZGA)를 유도한다는 것을 입증했습니다11. 이 결과들은 초기 배아 발생에서 세포 크기가 중요한 역할을 한다는 점을 뒷받침합니다.

여기서는 모발 매듭을 이용한 물리적 조작을 통해 Xenopus laevis 미니 배아를 생성하는 상세한 절차를 설명합니다(그림 1)10,11. 이 접근법은 Newport와 Kirschner(1982)가 초기 Xenopus 1 배아에 대해 헤어 루프 수축을 기초적으로 사용한 바위에 기반을 두어, 실험 도구로서 미니 배아를 생성하는 명확하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 또한 이 방법은 초기 배아 발생의 새로운 메커니즘을 밝혀내는 데 도움을 줄 수 있는 다른 배아 시스템에도 적용 가능합니다.

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프로토콜

여기서 설명된 동물 작업은 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 재료 준비

  1. 솔루션 준비
    1. 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2를 혼합하여 20× MMR을 준비합니다. NaOH로 pH를 7.8로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
    2. 3% 밀도 구배 배지(wt/vol) 용액을 1.5g 밀도 구배 배지를 0.5× MMR 50mL에 섞어 만듭니다. 자기 저어주는 막대로 부드럽게 저어 폴리머가 녹을 때까지 조절하세요. 사용 전까지 4°C에서 유지하세요.
    3. 60mm 페트리 접시에 0.5g의 아가로스 젤을 0.1× MMR 50mL에 섞어 1% 아가로스 젤을 준비합니다. 전자레인지로 아가로스를 녹인 후 5mL의 아가로스를 넣어 60mm 페트리 접시 바닥에 얇은 층을 발라줍니다.
  2. 배아를 조이기 위한 머리 매듭 준비
    1. 가느다란 머리카락을 골라 ~5cm 크기로 잘라주세요.
    2. 핀셋을 사용해 머리카락 한쪽 끝을 약 ~1cm 깊이의 P10 팁에 꽂으세요.
    3. 숟가락에 왁스를 바르고 왁스를 녹이도록 가열하세요. 머리카락이 붙은 P10 팁을 왁스에 빠르게 담갔다가 1분간 말리세요. P10 끝부분의 머리카락이 고정되었는지 확인하세요.
    4. 핀셋을 사용해 머리카락을 조심스럽게 오버핸드 매듭으로 묶으세요. 루프 크기를 ~1.5 mm로 조절하세요. 필요하면 돌출부를 다듬으세요. 매듭은 나중에 쓸 걸 위해 따로 두세요.
    5. 필요에 따라 위 단계를 반복해서 머리 매듭을 더 만듭니다.

2. 백노개 미니 배아 만들기

  1. Xenopus 배아를 얻으려면 표준 프로토콜을 따라 시험관 수정(IVF)을 수행해야 합니다(예: Sive et al., 2007 참조)12. 배아는 0.1× MMR로 사용 준비가 되어 있어야 합니다.
  2. 초기 배아의 단일 세포에서 ZGA를 시각화하고 그 조절 기전을 연구하기 위해, 1세포 단계 배아에 5-에티닐-우리딘(5-EU)을 미세주입하여 초기 전사체11,13을 대사적으로 표지한 후 다음 절차를 진행합니다.
  3. 배아가 수정 후 ~1시간(hpf)일 때, 플라스틱 이송 피펫을 사용해 60mm 페트리 접시(1% 아가로스 젤로 덮임)에 ~15mL 3% 밀도 구배 배지/0.5× MMR을 넣어 20개의 배아를 이식합니다.
  4. 한 손에 핀셋을 사용해 입체현미경으로 배아를 약 ~45–60도 회전시켜 식물 극(창백한 반구)에 접근하세요. 기울어진 배아를 핀셋으로 잡고, 다른 손에는 30G 바늘로 식물 기둥을 조심스럽게 찔러 주세요. 배아를 부드럽게 눌러 세포질을 방출하세요.
  5. 배아에 P10 팁으로 고정된 머리 매듭을 조심스럽게 덮어 동물 끝(어두운 반구)이 머리 매듭 안에 들어가도록 하세요. 원하는 미니 배아 크기에 맞게 매듭 위치를 조정하세요.
  6. 한 손으로 P10 피펫을 잡고 다른 손으로 핀셋을 사용해 매듭의 두 오버핸드 끝을 반대 방향으로 당기세요. 머리카락 매듭은 동물 극(온전한 상태)과 식물 극(세포질이 방출된 상태) 사이에서 배아를 조여 만듭니다. 머리 매듭이 P10 팁에 붙는 부위에서 잘라내세요.
  7. 위 2.4–2.6단계를 반복하여 원하는 수의 미니 배아를 만듭니다.
  8. 배아는 3% 밀도 구배 배지/0.5× MMR 상태에서 ~1–2시간 동안 머물게 합니다. 그 후 배아를 교란시키지 않고 P1000 피펫으로 배지를 제거하고, 0.1× MMR 15mL를 보충합니다.
  9. 배아가 원하는 단계에 도달하도록 기다린 후, 핀셋을 사용해 미니 배아의 매듭을 조심스럽게 풀어내세요.
  10. 배아를 채취하여 원하는 분석을 수행하며, 예를 들어단일 세포에서 ZGA를 시각화하는 작업을 수행합니다.

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결과

1세포 단계의 Xenopus laevis 배아는 위에서 설명한 것처럼 털 매듭으로 수축되었습니다. 대조군과 미니 배아는 ~9단계(23 °C에서 8.5 hpf)로 입체현미경으로 촬영되었습니다. 그림 2에서 보듯이, 일부 미니 배아의 부피는 대조 배아의 부피 ~1/3입니다. 이 결과는 초기 Xenopus 배아를 조작하여 미니 배아를 생성할 수 있음을 시사하며, 초기 배아 발생 중 세포 주기10과 유전체 활성화11의 역학에 대한 세포 크기의 영향을 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이 모델은 초기 배아 발달의 조절 메커니즘을 조사하는 데에도 유용한 도구가 될 수 있습니다.

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토론

여기서는 1세포 단계 배아를 털 매듭으로 물리적으로 수축하여 백 발피스 에서 미니 배아를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 세포 크기 축소가 모델 배아11에서 ZGA를 유도한다는 직접적인 증거를 제공합니다.

이 프로토콜의 여러 측면은 미니 배아를 성공적으로 생성하는 데 매우 중요합니다. 머리 매듭을 만들 때는 가늘고 튼튼한 머리카락, 가능하면 아기용 머리카락을 사용하는 것이 중요합니다. 털이 두껍고 연약할수록 매듭을 만들거나 사용하는 것이 더 어렵습니다. 또한, 염색약이나 인공 연화제로 처리한 모발은 배아에 독성이 있을 수 있으므로 피해야 합니다. 또는 일부 수술용 봉합사는 머리 매듭보다 비용이 더 들지만 배아를 수축시키는 데도 사용될 수 있습니다; 하지만 재료에 따라 강도와 유연성을 테스트하여 미니 배아를 생성하는 데 사용해야 합니다.

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공개 사항

저자는 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

펜실베이니아 대학교의 매튜 굿 연구실에 교육을 제공해 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(R03HD105802)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
30G 바늘BD 메디컬305128배아 천공을 위해
60mm 일회용 페트리 접시VWR25384-092배아 부양을 위해
ACCU-SCOPE 3075 줌 입체 현미경VWR470351-130배아 시각화를 위해
아가로스시그마-올드리치A-9414페트리 접시 코팅을 위해
듀몽 핀셋, 스타일 5전자현미경 과학72701-D배아를 조정하고 보유하는 데
피콜 400시그마-올드리치GE17-0300-10배아 부양을 위해
팁원 피펫 팁, 10 & 마이크로; LUSA 사이언티픽1111-3700머리 매듭을 붙일 때
왁스 블록, 검정캐롤라이나 바이오컬 서플라이 컴퍼니974228머리 매듭을 붙일 때

참고문헌

  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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재인쇄 및 허가

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