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방법 논문

3개 방 개방형 수조 자유수영 과제를 이용한 제브라피시(Danio rerio)의 사회적 선호를 조사하는 저비용 대안

194 조회수

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DOI:

10.3791/70610

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2026년 8월 7일

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1Christopher Newport University, 2Virginia Governor's School for Science and Technology, 3Bay Path University

이 논문에서

요약

설치류에서 제브라피시까지 다방 사회적 선호 과제가 적용되어 모델 생물의 사회적 행동 연구를 용이하게 합니다. 이 프로토콜은 웹캠과 오픈소스 소프트웨어를 활용한 저비용 3챔버 오픈 탱크 작업을 검증하여 제브라피시의 사회적 선호도를 측정하여 학부 연구와 교육에 접근성을 높입니다.

초록

사회적 행동을 이해하는 것은 신경행동학 연구의 핵심 과제이며, 종종 사회적 선호 과제를 통해 연구됩니다. 이 과제들은 원래 설치류를 위해 개발되었고 이후 제브라피시에 적용되었으며, 사회적 역학과 반응을 연구하는 데 널리 사용되고 있습니다. 3개의 방 개방형 탱크 자유 수영 과제(OTFST)는 중앙 탱크 양옆에 두 개의 자극 탱크가 배치되어 있으며, 중앙 탱크 내 피험자의 행동을 기록하는 카메라와 편광 필름과 백라이트를 사용하여 영상 품질과 유효성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 USB 웹캠과 쉽게 구할 수 있는 자재를 이용한 저비용 설정을 사용합니다. 우리는 동물 움직임을 정확하게 비디오 추적하고 다양한 지표에 대해 분석할 수 있는 위치 시계열 데이터를 제공하는 오픈 소스 마커리스 포즈 추정 도구인 DeepLabCut을 활용하고 있습니다. 파일럿 세션은 시스템이 견고한 사회적 선호 행동을 포착할 수 있는 능력을 검증합니다. 이 예산 친화적인 접근법은 제브라피시의 사회적 상호작용을 연구하는 연구실에 접근성 있고 확장 가능한 플랫폼을 제공하며, 3-챔버 OTFST의 다재다능함과 비교적 단순함 덕분에 학부 교육 실험실과 연구 프로젝트에 적합합니다.

서론

사회적 선호는 개인이 사회적 자극에 참여하거나 추구하거나 회피하는 경향으로, 인간을 포함한 동물 집단 내에서 유대와 위계를 형성하는 데 중요한 역할을 하는 사회적 행동의 근본적인 측면입니다. 1,2,3,4. 사회적 선호를 이해하는 것은 사회적 상호작용의 신경 및 행동 메커니즘을 특성화하는 데 필수적입니다. 이전 연구에 따르면 사회적 선호 결핍이 신경발달 및 정신 질환과 연관될 수 있습니다 5,6,7,8. 동물 모델은 사회적 행동의 생물학적 기초에 대한 통찰을 제공하며, 사회적 장애를 진단하고 치료하는 번역 도구 개발에 도움을 줄 수 있습니다. 설치류 9.10부터 수생 종 11,12에 이르는 이 동물 모델들은 발견에 유용한 틀을 제공합니다.

설치류는 19세기 초 인간과 생리학적으로 유사하기 때문에 행동 연구에 처음 사용되었다 13. 공격성과 같은 행동은 원래 연구되었지만, 사회적 선호에 대한 체계적인 측정은 여전히 미미했다. 연구자들은 Nadler 등이 도입한 3방 사회적 선호 과제를 개발하여 이 공백을 메웠다. 이 장치는 세 개의 상호 연결된 챔버로 구성되어 있습니다. 일반적으로 한쪽 방에는 새로운 동종종이 있고, 다른 쪽 방은 비어 있습니다. 피험자는 모든 방을 자유롭게 탐색할 수 있으며, 각 방에서의 시간이 기록되어 선호도를 평가합니다. 이 장치와 절차는 여러 변형과 함께 널리 인기를 얻었으며, 자폐 스펙트럼 장애의 설치류 모델에서 사회적 수행17,18,19 및 사회적 결핍 연구에 사용되었습니다. 하지만 설치류 연구는 비용이 더 많이 들고 상당한 공간이 필요합니다. 이에 따라 많은 연구자들이 신경행동 연구를 위해 수생 생물을 활용하는 쪽으로 방향을 전환하고 있습니다.

수생 종, 특히 제브라피시(Danio rerio)는 복잡한 사회적 상호작용을 포함한 정교한 행동 양식을 가지고 있습니다22. 생의학 연구 모델로서의 유용성과 행동 생태계에서 사회적 상호작용의 중요성 때문에, 제브라피시는 인간과 비교해 사용할 수 있는 사회적 반응의 의미 있는 틀을 제공합니다23. 제브라피시는 유지 비용이 저렴하고 비교적 작은 보관 공간이 필요해 행동 신경과학 연구에서 점점 인기를 얻고 있어, 대규모 사회 행동및 선호 연구에 비용 효율적이고 실용적인 모델로 자리 잡고 있습니다. 일부 연구에서는 인접한 수조 구성이 수생 생물의 사회적 상호작용 연구에 사용되었고, 그러나 이 구성은 단 하나의 자극만 제시되어 사회적 선호를 평가하는 데 다소 제한적인 처리량을 제공했습니다. 이 한계는 2018년에 제브라피시를 위한 쥐 3개 방 과제의 적응으로 해결되었습니다. 3개 방 개방 탱크 자유 수영 과제(OTFST)를 위한 개조된 장치는 단일 아크릴아마이드 탱크와 고정된 아크릴아마이드 장벽으로 나누어 중립 출발 구역을 제공하고, 각 측면 방에는 친숙하거나 새로운 동종 생물이 포함된 두 개의 측면 방으로 구성되어 있었습니다. 사회적 선호를 측정하기 위해 각 측면 방 근처에서 누적 시간을 기록하여, 에탄올 노출과 SAM2 녹아웃이 제브라피시27에서 신기성 선호를 감소시켰음을 입증하였다. 설치류 3방 사회적 상호작용 테스트는 시각, 화학, 촉각, 음향 양식을 통해 피험자와 실험 동종 간의 복잡한 다중 모달 상호작용을 가능하게 하는 반면, 수중 3 챔버 OTFST에 별도의 챔버를 사용하면 피실험자와 자극 동물 간의 상호작용이 시각적 모달리티만으로 축소됩니다. 이 단일 모달리티 상호작용은 생태학적 타당도가 낮을 수 있지만, 더 많은 실험적 통제를 제공하고 학부 연구자들이 수행하는 프로젝트의 간편성을 높여줍니다. 이후 여러 연구자들이 3챔버 OTFST의 적응을 탐구하여 제브라피시 28,29,30,31,32의 사회적 행동에 영향을 미치는 유전적 및 환경적 요인을 조사했습니다.

현재 3체방 OTFST의 변형은 다용도이고 학부생 친화적인 모델 기구로 설계되었습니다. 완전 학부생 연구실인 FishLab이 이 시스템을 만들고 활용했으며, 제브라피시의 사회적 선호를 연구하는 데 있어 고처리량 도구로서 효과적임을 입증했습니다. 이 구조를 활용한 연구들은 다양한 독립 변수 조작에 반응하는 제브라피시의 사회적 선호의 여러 측면을 탐구했습니다. 첫 번째 연구에서는 제브라피시가 실제사회적 자극과 모의 사회적 자극을 감지할 수 있음을 보여주었고, 두 번째 연구는 새로 형성된 여울보다 확립된 여울에 대한 선호도를 조사했다34. 가장 최근 연구는 제브라피시가 화학적으로 경보된 무리와 비경보된 무리를 구별하는 능력을 조사했습니다35. 이 연구들은 현실성, 친숙성, 위협 감지 등 사회적 행동의 다양한 측면을 다루며, 무리 지어 선호도와 포식 위험에 대한 반응 평가의 공통점을 보여줍니다. 하지만 이전 연구들에 사용된 장비는 전문 카메라 리깅에 장착된 디지털 IP 카메라, 전용 수중 랙 하우징 시스템, 그리고 비디오 획득과 분석을 위한 독점 소프트웨어를 사용했으며, 운영 예산이 적은 연구자나 강사에게는 비용이 부담스러울 수 있었습니다. 오픈 소스 소프트웨어와 고품질 USB 기반 웹캠의 등장으로, 학부 연구자와 함께 이 기술을 사용하고자 하는 연구자들이 저렴한 버전을 사용할 수 있게 되었으며, 총 비용(약 2,000달러; 컴퓨터 제외)은 고비용 시스템(약 20,000+달러, 컴퓨터 제외)의 비용보다 훨씬 저렴합니다.

다음 프로토콜은 제브라피시용 3챔버 OTFST의 저비용 버전 개발 및 적용을 개략적으로 설명합니다. 저렴하고 단순하며 다재다능하여 자금이 제한된 소규모 실험실이나 교육 환경에 유용한 도구입니다. 일반적으로 구할 수 있는 10갤런 수족관과 같은 저비용 주택과 결합하면, 현재 설치는 설치 및 유지 비용이 훨씬 적게 듭니다. 또한, 실험 세션 녹화를 위한 오픈 브로드캐스팅 시스템(OBS)과 DeepLabCut, SLEAP 등 다양한 추적 애플리케이션의 사용은 저비용으로 접근성 높은 프레임워크를 제공하여 제브라피시의 사회적 상호작용에 대한 비디오 촬영과 시계열 데이터를 생성할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 크리스토퍼 뉴포트 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다(프로토콜 #2025-23).

1. 동물

  1. 성체 단지느러미 야생형 제브라피시23, 36, 37을 얻으나, 다른 품종도 사용할 수 있습니다. 또는 배아를 구해서 사내에서 키우는 방법도 있습니다.
  2. 물고기는 1갤런(38L) 크기의 독립형 수조에 약 두 마리의 물고기 밀도로 키우세요. 탱크에는 능동 바이오 필터, 에어 스톤, 잠수 히터를 장착하세요. 또는 수생 선반 시스템에서 하우스 피시를 키우는 방법도 있습니다.
  3. 수질 수질 매개변수는 pH 7.0–8.0, 전도도 400–700 μS, 온도 25–27 °C, 질산염 <40 ppm, 아질산염 <0.2 ppm, 암모니아 0.01–0.1 ppm 범위 내에서 유지하세요.
  4. 동물은 12시간 동안 빛 아래에서 12시간 어두운 광시를 유지하고, 상업용 플레이크로 하루에 한 번 먹이를 주세요.
  5. 이 수조들에서 무작위로 동물을 선별하여 실험 과제를 수행한다.
  6. 실험 완료 후에는 동물을 다른 연구/교육 목적으로 재활용하거나, 250-500 mg/mL 완충 트리카인에 30분간 담근 후 물리적 방법(예: 참수)을 통해 죽음을 보장하도록 안락사시킵니다. 안락사된 동물은 이후 생물분석법 및/또는 신경화학 분석에 활용하세요.

2. 3챔버 오픈 탱크 자유 수영 작업 장치 및 소프트웨어

  1. 시험 챔버 건설
    1. 각 5.5갤런 수조 바닥의 플라스틱 트림을 조심스럽게 제거하세요. 컷오프 휠이 달린 회전 공구를 사용해 모서리를 잘라 제거를 쉽게 하세요. 플라스틱 트림을 잘라낸 후에는 일반 퍼티 나이프로 플라스틱과 실리콘 접착제를 분리하세요.
    2. 백라이트를 분산시키기 위해 세 탱크 모두 뒤쪽, 한 탱크의 왼쪽 끝, 다른 탱크의 오른쪽 끝을 흰색 접착 선반 라이너로 덮으세요. 끝부분은 중앙 챔버로 사용할 탱크 위에 덮개를 벗겨 두세요.
    3. 각 챔버 앞쪽 상단 테두리 아래 4.5cm 지점에 에나멜 마커나 검은색 그래픽 레이아웃 테이프로 채움 수준을 표시하는 검은색 수평선을 표시하세요.
    4. 각 측면 탱크의 노출된 끝부분에 맞게 편광 필터 한 장을 잘라내세요. 필터 시트를 서로 90° 각도로 맞추세요. 네 모서리 모두에 투명 테이프를 붙여 수족관 유리와 필터 재료 사이 공간으로 물이 들어가지 않도록 하세요.
      참고: 편광 필터의 오프셋 방향은 한쪽 측면 자극 챔버에 있는 자극 동물이 다른 쪽 자극 챔버의 동물(또는 다른 자극)을 볼 수 없게 하면서도 피사체를 볼 수 있게 합니다. 중앙 탱크에 있는 피험자는 양쪽 방에서 시각 자극을 볼 수 있습니다.
    5. 탱크가 설치 작업대 위에 정확히 배치되도록 폴리염화비닐(PVC) 베이스를 제작하세요. 바닥 바닥은 두께 1/4인치(0.635cm) 흰색 PVC 시트(21cm x 122.5cm)에서 잘라내고, 끝부분은 1 x 2 PVC 트림 보드(길이 21cm)에서 잘라내세요.
    6. 세 개의 탱크를 모두 제자리에 두고 끝부분을 시험 장착해 보세요. 아래 칸막이 패널의 삽입과 제거가 용이하도록 하고, 측면 탱크가 중앙 탱크 측면에 밀착되어 있지 않은지 확인하세요. 시험 장착이 완료되면 PVC 시멘트로 끝부분을 PVC 베이스에 연결하세요.
    7. 각 챔버의 투명 뚜껑을 만들기 위해 폴리카보네이트 시트를 5.5갤런 탱크 상단 테두리 외측 크기에 맞춘 세 조각으로 잘라내× 21cm입니다. 뚜껑 가장자리에 6mm × 4mm 크기의 래빗 채널을 잘라 뚜껑이 챔버 위에 안전하게 고정되도록 합니다.
    8. 동물을 방에 넣을 때는 뚜껑으로 챔버를 덮으세요. 잠수 히터와 에어스톤을 수족관 공기 펌프에 연결하고, 동물들은 각자의 방에 머물며 온도 조절과 통기를 제공합니다. 세 개의 에어스톤 모두에 공기 흐름을 균형 있게 맞추기 위해 3방향 공기 밸브를 사용하세요.
    9. 중앙 챔버와 양쪽 챔버 사이에 간단한 불투명 칸막이를 만들어 피험자가 사회적 자극에 시각적으로 노출될 때를 조절하기 위해 A4 밝은 색상의 카드지 두 장을 라미네이팅합니다.
    10. 분할판을 걸고 원격 제거할 준비를 위해 각 적층 판의 210mm 가장자리를 따라 85mm와 125mm의 구멍을 두 개씩 뚫어 놓습니다.
    11. 75cm 길이의 고강도 끈 두 개를 잘라 각 구멍에 실을 통과시키고, 남은 끝을 묶어 두 시트를 중앙 요크로 연결합니다.
    12. 6m 길이의 끈을 자르세요. 6m 길이의 실의 한쪽 끝을 요크에 묶어 중앙에 연결된 줄을 만들고, 자유로운 끝을 회전식 아이 풀리에 통과시킵니다.
    13. 회전 아이 풀리를 가장 중앙 탱크 위 천장에 장착하고, 실의 끝이 실험 장비 외부에 매달려 있는지 확인하세요(그림 1A).
  2. 조명 설치 구성
    1. 패널 조명용 1/4인치(0.635cm) 두께의 흰색 PVC 시트로 프레임을 만드세요. 끝부분 두 개(10cm × 31.5cm)와 위와 아래쪽(10cm × 122cm)을 잘라냈습니다. 프레임 조각들을 시험 맞춰서 패널이 프레임 안에 들어갈 수 있도록 맞춰 보세요. 적합 여부를 확인한 후에는 PVC 시멘트로 프레임 조각을 연결하세요.
    2. 자격을 갖춘 전기기사에게 패널 조명에 3단 전선을 추가하게 하세요.
    3. 자격을 갖춘 전기기사에게 방수 케이스 내 출력 콘센트를 제어하기 위해 슬라이더 디머를 배선으로 연결하세요. 패널 조명을 이 콘센트에 꽂으세요.
    4. 슬라이더 디머를 조절해서 백라이트 밝기를 350럭스로 조절하세요. 챔버에 물을 채우고 슬라이더 디머를 움직여 챔버 앞쪽의 밝기를 15럭스로 조절하세요.
      참고: 연구자들은 밝기 설정이 유지되었는지 확인하기 위해 연구 전, 중, 후에 조명을 확인해야 합니다.
  3. 커튼과 카메라 프레임의 제작
    1. 패널 조명, 탱크 바닥 패널, 세 개의 챔버가 있는 테스트 벤치를 설치하세요. 두 개의 방수포 기둥을 수직으로 위치시키고 조정해서 바닥에서 천장까지 꼭 맞게 맞추세요. 탱크 앞쪽에서 최소 75cm 떨어진 곳에 위치하세요.
    2. 각 커튼마다 시트 한쪽 끝을 60cm 이상 접어 상단 접은 부분에서 6cm 떨어진 곳에 직선 코를 꿰매어 프레임 조각이 들어갈 수 있는 주머니를 만들어 주세요.
    3. 프레임 설치의 교차 연결 및 안정화 구간의 치수를 설치할 구역의 너비와 깊이에 따라 측정하세요.
      참고: 현재 The FishLab의 설치에서는 수직 방수포 폴이 실험실 뒷벽에서 146.5cm 떨어진 구석에 설치되었습니다. 내부 방수포 기둥은 측벽에서 6.5cm 떨어진 곳에 위치하며, 외부 방수포 기둥은 측벽에서 142.5cm 떨어진 곳에 위치해 있습니다.
    4. 프레임 측면의 안정화 구간으로 사용할 전기 금속 튜브(EMT) 전관을 143cm 간격으로 세 구간으로 절단합니다. 이동식 커튼의 상단 주머니를 통과시켜 바닥에서 190cm 높이에 수평으로 배치하세요.
    5. 한쪽 끝에는 T-클램프로, 다른 쪽 끝에는 맞춤형 3D 프린팅 소켓을 사용해 외부 방수포 기둥에 섹션을 부착하세요. 3D 프린팅된 소켓을 나사로 뒷벽에 고정하세요. 나머지 두 부분은 내부 방수포 기둥에 부착하세요.
    6. 고정 커튼 중 하나의 상단 포켓을 통과시켜 바닥에서 190cm 높이에 위치시킵니다. 한쪽 끝에는 T-클램프를, 다른 쪽 끝에는 3D 프린팅 소켓을 넣어 내부 방수포 기둥에 부착하세요.
    7. 3D 프린팅된 소켓을 나사로 옆벽에 고정하세요. 마지막 안정화 구간을 바닥에서 120cm 높이에 놓고 다른 두 안정화 구간과 비슷하게 부착하세요.
    8. 프레임 앞부분의 안정화 구간으로 사용할 127cm EMT 관로를 또 하나 잘라내세요. 이 부분을 두 번째 고정 커튼의 상단 주머니를 통과시키고, 양 끝을 방수포 기둥에 T-클램프로 고정하여 바닥에서 193cm 높이에 설치하세요.
    9. 남은 EMT 관로를 145cm 높이로 잘라 카메라 장착 바로 사용하세요. 이 부분을 바닥에서 88cm 높이에 수평으로 배치하여 카메라를 탱크 중심과 정렬시키세요. 한쪽 끝을 벽에 나사로 고정한 3D 프린팅 소켓에 끼우고, 맞춤형 3D 프린팅 크로스클램프를 사용해 카메라 바를 방수포 기둥에 단단히 고정하세요(그림 1B).
  4. 카메라 설치 구성
    1. 카메라 바에 카메라 마운트 하나를 고정하여 카메라의 수평 및 수직 중심이 센터 챔버의 수평 및 수직 중심과 일치하도록 합니다.
      참고: 연구자들이 시각 자극으로 사용된 살아있는 동물의 반응을 디지털 영상으로 촬영하고자 할 경우, 각 측면 방 앞에 추가 카메라를 설치할 수 있습니다. 가장 간단한 방법은 단일 카메라를 설치해 중앙 실험실의 영상을 촬영하는 것입니다. 자극실 내 실시간 사회 자극을 위해 연구자들은 챔버의 영상도 수집하고자 할 수 있습니다.
    2. 각 카메라를 각 카메라 마운트의 나사산 포스트에 장착하세요. 각 카메라를 해당 챔버의 관측 구역에 초점을 맞추도록 조정하세요.
    3. 각 카메라의 USB 케이블을 스트랩이나 타이로 고정해 케이블이 늘어지는 것을 방지하세요.
    4. 140cm 길이의 와이어랙 선반 조각을 잘라서 프레임 앞쪽 바깥쪽에 수직으로 부착해 카메라가 정렬에서 벗어나지 않도록 하세요. '카메라 케이지'는 방수포 기둥에 부착된 T-클램프를 사용해 장착하세요.
      참고: 두 번째 카메라 케이지를 프레임 안쪽에 장착하여 카메라가 정렬이 어긋나는 것을 방지할 수 있습니다; 카메라 전면이 탱크 이미지의 가림을 방지하기 위해 '케이지' 상태일 경우, 와이어 그리드의 작은 부분을 제거해야 할 수도 있습니다.
  5. 획득 소프트웨어 로드 및 구성 - 오픈 방송 스튜디오(OBS)
    1. OBS를 다운로드하여 윈도우가 작동하는 로컬 컴퓨터에 설치하세요. OBS Studio를 실행하고 자동 구성 마법사 를 실행하여 특정 녹화 요구, 하드웨어 자원, 네트워크 조건에 맞게 설정을 최적화하세요.
      참고: 이 도구는 자동 구성 마법사> 도구에서 사용할 수 있습니다.
    2. 카메라 설정 전에 기본 설정을 확인하세요. 베이스(캔버스) 해상도를 디스플레이 해상도와 맞추고, 출력(스케일드) 해상도를 녹화 해상도(예: 720픽셀)로 설정하세요.
    3. 씬 박스를 우클릭하거나 하단의 십자가를 사용해 장면을 생성하세요. 장면에 이름을 붙이세요. 씬을 사용해 스트림 레이아웃을 정의하세요.
    4. 출처 박스를 우클릭하거나 하단의 플러스 기호를 사용해 새 출처를 추가하세요. 웹캠을 추가하려면 비디오 캡처 장치를 선택하세요. 각 카메라에 고유한 이름을 부여하세요(예: "카메라-왼쪽", "카메라-중앙", "카메라-오른쪽"). 필요에 따라 추가 카메라나 소스에 대해서도 이 과정을 반복하세요.
    5. 미리보기 창에서 소스를 위치시키고 크기 조절하세요. 카메라가 다른 소스보다 위에 위치하는지 확인하여 카메라가 보이도록 하세요. 카메라 뷰를 캔버스에서 중앙에 맞추려면 소스 목록에서 소스를 선택하세요(빨간 경계 상자가 나타납니다), CTRL+D (중앙 화면 전환)를 누르세요.
    6. 원한다면 CTRL+F (화면에 맞추기) 또는 CTRL+S (화면으로 늘리기)를 눌러 화면 전체를 소스로 채울 수 있습니다. Alt 키를 누 른 채 바운딩 박스를 드래그해서 소스를 자르세요. 가장자리가 초록색으로 변하는지 확인해서 크롭을 확인하세요.
    7. 소스 목록에서 선택한 카메라를 더블 클릭한 후 비디오 구성 옵션을 선택해 밝기와 대비 같은 비디오 속성을 조정하세요. 속성 메뉴에서 설정을 수정하세요.

3. 행동 검사

  1. 적응
    1. 3개의 챔버 모두에 하우징 탱크에서 물을 채우세요. 각 방 사이에 불투명 장벽을 설치하고 적응 기간 내내 그대로 두세요. 피실험체 한 명을 중앙 실험실로 옮기고 최소 1시간 동안 적응시키고 테스트 전에 두세요.
      참고: 대표 결과의 적응 기간은 3시로 설정되었습니다. 적응 기간은 동물이 순간적인 전달 스트레스에서 회복하고 행동 검사 전에 챔버 환경에 적응하는 데 필요합니다.
    2. 적응 시기 초반에는 사회적 자극을 측면 자극실에 배치합니다. 인공 사회 자극을 왼쪽 자극 챔버에 배치하고, 크기, 나이, 친숙도가 비슷한 수컷 2마리와 암컷 2마리의 작은 무리를 오른쪽 자극 챔버로 옮깁니다.
      참고: 인공 사회 자극과 실시간 사회 자극의 위치는 고정되어 있으며 균형을 맞지 않았으며, 이전 연구들33,34명은 OTFST를 사용한 자극 위치의 영향을 발견하지 못했습니다. 이 경우 균형을 맞추려면 연구에 사용되는 동물 수를 불필요하게 두 배로 늘려야 하는데, 이는 동물 연구의 '3R' 원칙에 반합니다. 이 프로토콜은 정적 모델, 공존 또는 신종 등 테스트할 자극의 성격에 유연성을 제공합니다.
    3. 적응 과정 동안, 모든 살아있는 동물 챔버에 26 °C로 설정된 잠수 히터, 수족관 공기 펌프에 연결된 버블러 스톤, 그리고 안정적인 보관 조건을 유지하기 위한 탱크 뚜껑을 공급합니다. 실험 세션을 시작하기 전에 히터와 버블러스톤을 제거하세요.
  2. 실험 시험
    1. 양쪽 탱크와 중앙 탱크의 실험 대상에서 사회적 자극의 활동 상태를 확인하세요. 중앙 탱크에 있는 단일 카메라를 사용해 각 실험 대상자의 영상을 녹화하세요.
      참고: 이 프로토콜의 대표 결과는 Velkey 등33 의 단일 조건을 복제하여 저충실도(모바일 모델)와 고충실도(라이브 어울) 사회적 자극 사이에서 제브라피시의 선호도를 테스트한 것입니다.
    2. OBS Studio를 열어 세션 녹화를 시작하세요. 영상의 모서리를 클릭하고 드래그하여 중앙 카메라 뷰의 크기를 조절해 화면을 채우게 하세요. 화면 오른쪽 하단의 컨트롤에서 녹화 시작을 선택하세요.
    3. 녹화가 시작되면 도르래 줄을 통해 불투명 장벽을 제거하세요. 10분간 계속 녹화하면서 피험자가 두 사회적 자극에 동시에 노출되도록 하고, 실험실 안에서 자유롭게 움직이도록 합니다.
    4. 세션을 종료하려면 컨트롤에서 녹화 중지를 선택하세요. 녹화된 세션에 접근하려면 왼쪽 상단 메뉴에서 'File'을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 '녹화 기록 보기'를 선택하세요.
      참고: 결과된 영상들은 다양한 분석에 적합한 비구조화 데이터를 제공합니다.
    5. 살아있는 물고기를 저장 탱크로 옮기고, 세 개의 챔버 모두에서 물을 제거한 뒤, 분광 필름 사이에 물이 들어가지 않도록 물로 깨끗이 씻고, 각 챔버에 5% 구연산을 분사해 살균하고, 챔버를 하룻밤 자연 건조시키고, 다음 실험일 초에 세척한 후 다시 시험대에 올려놓습니다.

4. 분석을 위한 구조화된 데이터 획득

  1. 모션 분석 소프트웨어 애플리케이션(예: DeepLabCut; https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut 참조)을 선택하세요. https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html 의 사용자 가이드를 따라 컴퓨터에 DeepLabCut을 설치하세요. DeepLabCut을 사용하지 않는 경우 추가 안내는 선택한 소프트웨어의 정보와 사용자 가이드를 참고하세요.
  2. DeepLabCut에 네다섯 개의 비디오를 불러와 모델 훈련을 위해 각 비디오당 20–30프레임을 추출하세요. 최소 세 개의 주요 추적 지점(예: 헤드, 트렁크, 테일)을 정의하고, 이 포인트들을 프레임 전반에 걸쳐 추적하도록 네트워크를 훈련시킵니다.
    참고: 자세한 내용은 https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html 의 DeepLabCut 사용자 가이드를 참조하십시오. 대표적인 결과는 3개의 추적 지점이 있는 5개의 영상에서 라벨이 붙은 22프레임을 사용합니다.
  3. ResNet-101 기반 신경망을 사용해 모델을 학습하세요. 훈련을 완료하는 데 필요한 반복 횟수를 결정하세요(권장 100,000에서 200,000 사이). 0.5에서 1 사이의 p-컷오프 값을 결정합니다.
    참고: 대표 결과는 150,000회 반복을 사용해 p-컷오프 0.7로 모델을 훈련시켰습니다. 만약 훈련된 네트워크가 0.7 p-컷오프 이하로 떨어지면, 비디오 대비를 높이거나 라벨링 규칙을 변경하면 이 문제를 해결할 수 있습니다.
  4. 나머지 실험 영상에는 완전히 훈련된 DeepLabCut 모델을 적용하세요. 각 시험의 위치 데이터를 추출합니다. 사용자 가이드를 따라 https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html.
    참고: 대표적인 결과는 2번의 셔플을 통해 검증했으며, 테스트 오차는 2 pixels: train 4 pixel(이미지 크기 1600 x 820 픽셀)임을 확인했습니다. 그 네트워크는 현재 실험 환경에서 얻은 실험 영상을 분석하는 데 사용되었습니다.
  5. 파이썬과 같은 코딩 소프트웨어를 사용해 동일한 너비의 세 수직 경기장 구역 간 이동을 정의하고 분석하여 선호도를 정량화하세요. 추적 노이즈를 줄이기 위해 식별된 존 내 최소 두 개의 신체 지점으로 구역 내 시간을 측정하세요. 공식을 사용하세요: 존 내 총 시간 = (존 내 총 프레임) / (총 프레임 수).
  6. 삼각성 측정이 필요하다면, 탱크 벽에서 제브라피시의 몸 전체 길이로 구역을 정량화하면, 피험자가 수직 경계 근처에 머무르는 수동적 경향을 측정할 수 있습니다. 이 측정은 비교적 큰 실험용 탱크에 가장 적합합니다.
  7. 같은 코딩 소프트웨어를 사용해 정지 시간(예: 얼음)을 정의하고 측정하세요. 프레임당 2–5픽셀 이동 임계값을 정의하고, 최소 연속 프레임 수는 15프레임이어야 합니다.
    참고: 대표적인 결과에서는 15프레임 동안 프레임당 3픽셀의 임계값으로 고정이 확인되었습니다.
  8. 통계 분석 및 시각화를 위한 측정 자료를 수집하고 내보내세요.
    참고: 데이터 분석은 https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts 을 참고하세요. 우리는

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결과

위에서 설명한 저비용 방법들을 검증하기 위해, Velkey 등에서 수행된 실험에서 한 가지 조건이 있습니다. Al.33은 현재의 저비용 구성으로 복제되었다. 피험자들(N = 23, 남성 11명, 여성 12명)은 왼쪽에 인공 이동 이동(저충실도) 사회 자극을, 오른쪽에 생 무리(고충실도) 사회 자극을 제시했다(그림 2); 이전 연구들33,34명이 OTFST를 이용한 자극 위치의 효과나 상호작용을 발견하지 못했기 때문에, 인공 사회 자극과 실시간 사회 자극의 위치는 고정되어 있었으며 균형을 맞추지 않았습니다. 샘플 기법의 디지털 비디오는 DeepLabCut으로 특성화되어 각 피험자의 테스트 세션 동안 이동 속도에 대해 초당 30프레임의 위치 시계열 데이터를 제공했습니다(

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토론

현재 프로토콜은 3-챔버 OTFST의 저비용 적응이 성체 제브라피시의 사회적 선호를 존속 시간에 측정해 신뢰성 있게 특성화할 수 있음을 입증합니다. 저렴한 건축 자재, USB 연결 웹캠, 오픈소스 획득 및 분석 소프트웨어 애플리케이션을 사용하여 본 시스템은 제브라피시가 저충실도 이동 모델보다 살아있는 동종 떼를 선호한다는 발견을 성공적으로 재현했습니다. 이 결과는 어류의 시각 매개 사회적 선호를 조사하기 위한 저비용 3-챔버 OTFST 모델의 적용을 검증합니다. 현재 프로토콜에서는 중앙 챔버 측면 벽에 편광 필름을 포함시켜, 피실험체만 양쪽 측면 챔버의 시각 자극을 볼 수 있게 하고, 살아있는 물고기가 반대쪽 측면 챔버의 시각 자극을 볼 수 없도록 하는 것이 중요합니다. 마찬가지로, 비디오 프레이밍의 일관성을 유지하기 위해 PVC 프레임 옆에 설치된 테스트 챔버를 등록하는 것이 필요합니다. 조명 일정을 유지하기 위해 챔버 뒤에 LED 백라이트가 설치되었고, 15럭스에서...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다. 연구의 설계에는 자금 지원자들이 관여하지 않았으며; 데이터 수집, 분석 또는 해석에 관해; 원고 작성 과정에서; 또는 결과를 발표할지 결정하는 데 있어서도 말이다.

감사의 글

저자들은 크리스토퍼 뉴포트 대학교 TheFishLab 팀의 Rommel Pagkalinawan, Robby Buck, Elizabeth Hiltz, Haley Dewitt, Maia Tankersley, Alexis Thai-Nguyen, Grady Fleming, Jacob Young, Jack Medlin에게 축산 및 검증 실험 데이터 수집에 기여해 주신 것에 대해 감사드립니다. 저자들은 또한 2025년 커뮤니티 캡틴 여름 프로그램 동안 기존 고비용 및 저비용 구성의 모든 구성 요소 재고 조사를 수행한 사만다 커먼스에게 감사드립니다. 저자들은 또한 학부 여름 장학자 프로그램을 통해 K.K.에 지원해 준 크리스토퍼 뉴포트 대학교 학생 연구 및 창작 활동 사무국에 감사의 뜻을 전합니다. 그림 2는 Kinslow, K.(2025)가 BioRender에서 작성한 것입니다. https://BioRender.com/wbf0wph.

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재료

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