뇌 내 유방암 전이 마우스 모델: 수막과 후각 구의 면역 및 기질 세포 특성 분석

요약

프로토콜은 두개내 접종을 통해 유방암 뇌전이를 규명하고, 뇌 면역을 조절하는 주요 림프세포 및 면역 세포 하위 집합을 유세포 분석으로 특성화합니다. 이 분석들은 뇌 미세환경을 형성하는 면역 및 기질 세포 역학에 대한 통찰을 제공하여 새로운 치료 전략 개발에 도움을 줍니다.

초록

중추신경계(CNS)는 수막과 후각 구를 포함한 특수 면역 인터페이스로 둘러싸여 있는데, 이 인터페이스는 전이 정착의 허용 경로이자 항종양 면역 반응의 진입 지점 역할을 할 수 있습니다. 전이 진행 과정에서 면역 세포 역학이 이러한 구조 내에서 어떻게 진화하는지 이해하는 것은 뇌에서 종양 성장을 지원하거나 제한하는 메커니즘을 규명하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 E0771 유방암 세포를 C57BL/6 마우스에 두개내 주입하여 유방암 뇌전이(BCBM) 마우스 모델을 구축하는 과정을 상세히 설명합니다. 종양이 형성된 후, 수막과 후각구는 신중하게 해부되어 효소로 소화되어 단일 세포 현탁액으로 처리됩니다. 이 집단들은 다중 매개변수 스펙트럼 유동 세포 분석을 통해 중추신경계 관련 면역 지적 내 림프구, 골수계, 기질 세포 하위 집합을 포괄적으로 특성화합니다. 이 워크플로우는 종양 보유 대조군과 비종양 대조군 간의 비교 분석을 가능하게 하며, 종양 면역 회피의 기저가 될 수 있는 중추신경계 면역 인터페이스 내 변화를 식별하고 잠재적 치료 표적을 나타냅니다. 전반적으로 이 프로토콜은 BCBM을 연구하고 CNS-말초 면역계 경계에서 면역 조절을 검증하는 재현 가능한 접근법을 제공합니다. 추가적인 암세포주, 면역치료제 또는 유전적 마우스 모델에 적응하여 뇌 미세환경 내 면역 저항 기전과 치료 반응을 조사할 수 있습니다.

서론

뇌 전이는 중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 가장 흔한 악성 종양으로, 원발성 뇌종양보다 더 자주 발생합니다. 폐암, 유방암, 흑색종은 가장 자주 뇌로 전이되는 주요 암입니다¹. 이 중 유방암 뇌전이(BCBM)는 전이 환자의 10%–30%에 영향을 미치는 주요 임상적 도전 과제이며, 전신 치료의 개선과 신경영상 기술의 발전으로 인해 발생률이 증가하고 있습니다^. BCBM 환자의 예후는 여전히 좋지 않으며, 수술, 방사선 치료, 화학요법 등 이용 가능한 치료법은 대부분 완화 효과에 그치고, 신경학적 증상은 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다^. 표적 치료와 면역치료가 보완적 전략으로 탐색되고 있지만, 뇌 전이에서 면역치료의 임상적 이점은 여전히 제한적입니다 ^4,5,6.

최근 연구는 뇌 면역에 대한 이해를 더욱 정교하게 하고, 중추신경계와 관련된 기능적 림프 경로, 특히 수막⁷ 과 비막⁸의 림프관에 대한 관심을 새롭게 부추겼습니다. 이 구조들은 뇌를 둘러싸고 후각과 방골판 인근까지 이어지는 연속적인 림프관 네트워크를 형성하며, 궁극적으로 경추 림프절과 연결됩니다. 이 시스템은 체액 항상성, 면역 감시, 중추신경계와 말초 림프구 기관 간의 면역 세포 수송에 중요한 역할을 합니다⁹. 뇌종양과 전이에 대한 면역치료적 접근법에 대한 관심이 높아지면서, 이러한 림프-면역 인터페이스는 전신 면역이 두개내 병변과 소통할 수 있는 유망하지만 아직 연구가 부족한 경로로 부상하고 있습니다. 또한, 뇌종양 미세환경으로의 면역 세포 모집과 이 세포들이 이 독특한 환경에서 어떻게 상호작용하는지에 대해서는 아직 잘 이해되지 않은 상태입니다. 이러한 공백은 종양-면역 상호작용을 포괄적으로 분석하고 뇌 전이에 대한 항종양 면역 개선 전략 개발을 지원하는 전임상 모델과 절차의 필요성을 강조합니다.

여기서는 E0771 세포의 입체성 두개내 접종을 통해 재현 가능하고 면역 기능이 있는 BCBM 마우스 모델을 생성하고, 스펙트럼 유세포분석을 통한 면역표현형 분석을 위한 수막 및 후각 구의 분리 및 해리를 결합한 프로토콜을 설명합니다. 이 접근법은 BCBM의 통제된 모델링을 통해 치료 중재의 안전성과 효능을 평가할 수 있게 하며, 뇌 림프-면역 경계에서 면역 및 기질 집단을 심층적으로 특성화하여 뇌종양 미세환경을 형성하고 치료 반응에 영향을 미치는 세포 역할을 이해하는 데 도움을 줍니다.

동물 모델은 뇌 전이 연구에 필수적이며, 전이성 진행의 많은 중요한 측면은 시험관 내에서 재현할 수 없습니다. 뇌 전이를 생성하기 위해 여러 생체 내 마우스 모델이 개발되었으며, 각각 고유한 장단점을 가지고 있습니다¹⁰. 자연전이 모델은 정형전위 이식이나 유전공학 마우스 모델을 포함해 임상 질환 진행을 더 잘 모방하지만 두개내 병변을 거의 발생시키지 않으며, 긴 실험 기간이 필요하고, 광범위한 두개외 질환으로 인해 변동성이 큰 경우가 많습니다. 심장 내 주사, 경동맥 주사, 꼬리정맥 주사 등 전신적 접근법은 종양 세포를 순환계에 도입하여 혈구성 확산, 혈뇌장벽 유출, 정착을 더 잘 모방합니다. 그러나 이러한 모델들은 원발성 종양 침범의 초기 단계를 포착하지 못하며, 특히 폐에서 광범위하고 변동성 있는 두개외 전이를 자주 발생시킵니다. 전신 모델 중에서 경동맥내 주사는 변동성이 가장 낮지만, 고급 외과적 전문 지식이 필요합니다. 또는 두개내 주사는 종양 위치를 정밀하게 조절하고, 종양의 신속하고 재현 가능한 발달, 실험 간 변동성 감소 등 여러 장점을 제공합니다. 이 접근법은 전이 경과를 보다 정확하게 모방하기 위해 정형성 원발성 종양 착상 후 외과적 절제를 시행하는 방법으로도 보완될 수 있습니다. 두개내 주사는 전이 전체 연쇄 과정을 재현하지는 못하며 초기 침습 및 전이 연구에는 적합하지 않지만, 기존 병변에 대한 치료 효능을 평가하고 뇌 미세환경 내 상호작용을 조사하는 견고한 모델을 제공합니다. 알려진 한계는 주사 자체가 국소 신경 염증을 유발하여 면역 수치에 영향을 줄 수 있다는 점이며, 이는 주사 접종 마우스와 비주사 마우스의 면역 프로필을 비교하여 평가할 수 있습니다.

수막과 후각구의 면역 특성 분석은 비교적 새롭고 충분히 탐구되지 않은 연구 분야입니다. 대부분의 연구는 전체 뇌 또는 자궁경부 림프^{절 샘플에} 의존하지만, 이 림프관 관련 조직의 뚜렷한 세포 구성과 특수한 면역 기능을 포착하지 못합니다. 두 구조를 모두 회복하면 뇌 면역에 대한 더 넓고 유익한 시각을 얻을 수 있습니다. 다중파라미터 스펙트럼 유세포분석과 결합하면, 이 워크플로우는 중추신경계-말초 면역 통신에 관여하는 풍부하고 희귀한 면역 세포 집단의 고처리량 프로파일링을 지원합니다. 여기에는 세포 하위 집합을 식별하고, 활성화 상태를 평가하며, 치료로 인한 변화를 평가하기 위한 표면 및 세포 내 마커의 정량화가 포함됩니다. 이 프로토콜에서 다루지 않는 다른 중추신경계 면역분석 방법론으로는 면역조직화학(IHC)과 면역형광(IF)이 있는데, 이들은 면역세포의 공간적 분포를 보존하지만 낮은 마커 다중화, 주관적 정량화, 희귀 세포 유형의 과소 대표로 인해 제한됩니다¹². 최근에는 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)이 세포 상태와 전사 프로그램을 고해상도로 발견함으로써 중추신경계 면역 집단의 프로파일링 능력을 확장했습니다. 강력한 전사체학적 통찰을 제공함에도 불구하고, scRNA-seq는 비용, 해리 인공물, 전사체 손실, 단백질 수준 해상도 손실 등으로 제한됩니다 ^13,14. 플로우 사이토메트리는 공간 분석이 부족하고 해리 관련 영향에 민감하지만, 고급 다중파라미터 패널을 통해 우수한 표현형 해상도를 제공하며 견고한 정량적 면역 프로파일링을 제공합니다.

여기서 설명한 방법론들은 BCBM 모델링과 CNS 림프 경계 면역 역학 탐구를 위한 유연하고 강력한 플랫폼을 제공하여 뇌종양 미세환경과 관련 면역 조절 경로를 모두 표적으로 하는 치료법의 전임상 개발을 지원합니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 리스본 대학교 약학부 지침에 따라 진행되었습니다. 이 프로토콜은 포르투갈 동물보호를 관할 당국인 Direção-Geral de Alimentação e Veterinária(참조 0421/000/000/2021)에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 생체 내 이식을 위한 E0771 세포 준비

1. 멸균 후드에서 E0771 세포를 T75 플라스크에서 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS)과 1%(v/v) 페니실린 및 스트렙토마이신(PEST)을 보조하여 배양합니다.
   1. 공급자로부터 받은 세포가 STR 프로파일링으로 인증되었고, 정기 검사를 통해 마이코플라즈마 없는 것이 확인되었는지 확인하세요. 뇌 착상 전 해동 후 최소 2–8회 동안 종양 세포를 배양합니다.
2. 착상 당일에는 세포가 건강하고 80-90% 융합 상태를 확인하세요. 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
3. 플라스크에 트립신을 넣고 37°C에서 5분간 배큐합니다. 그 다음 보충 배지(DMEM, 10% v/v FBS, 1% v/v PEST 포함)를 3배 추가하여 트립신을 중화하고 세포를 해리시킵니다.
4. 세포를 튜브로 옮기고 300 x g 의 원심분리기에서 5분간 실온(RT)에서 투여합니다. 상정액을 제거하고 펠릿을 PBS에 재현탁하여 세포 수를 측정합니다.
5. 다시 원심분리기(300 x g 5분간 5분), 상청혈을 버리고 PBS에 세포를 1 x 10⁵ E0771 세포를 2 μL에 재현탁합니다. 종양 접종 전까지 세포 현탁액을 얼음 보관하세요. 주사 직전에 세포 현탁액을 준비하세요.

2. 입체형 장치를 이용한 두개내 종양 접종

1. 암컷 C57BL/6 마우스(6-8주)를 구입하여 수술 최소 7일 전부터 동물 시설에 적응시키세요. 집쥐는 12시간 동안 빛과 어둠 주기를 유지하는 통제된 환경에서 키우고, 음식과 물을 자유 롭게 제공하세요.
   참고: 종양 보유 조건과 대조군 간의 의미 있는 비교 면역 프로파일링을 위해 충분한 통계적 검정력을 확보하기 위해 실험군당 최소 5마리의 동물을 권장합니다.
2. 수술 시작 전에 수술 부위와 필요한 모든 재료를 준비하세요:
   1. 수술 기구: 메스 칼날, 가위, 겸자, 바늘 홀더, 봉합 와이어.
   2. 장비 및 기타 장비: 입체 탐지 기기, 유리 주사기, 드릴, 면도기, 면봉, 온열 패드.
   3. 마취: 15mL 튜브 내에서 케타민-자일라진(K-X)(각각 25 mg/mL 및 2 mg/mL)을 PBS 내에서 제조합니다.
   4. 진통제: 15 mL 튜브에 PBS 내 15 μg/mL 부프레노르핀을 준비합니다.
   5. 다른 용액으로는 포비돈-요오드, 과산화수소 3% v/v (H₂O₂), 안과 연고가 있습니다.
      주의:_H2O₂ 는 삼키면 해롭고 피부 자극을 유발할 수 있습니다.
3. 복강 내 주사(복막 내 K-X, 체중 10g 당 100 μL)로 마취합니다. 발가락 꼬임에 반응이 없다는 점에서 적절한 마취를 확인하세요.
4. 탈수를 막기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르고, 시술 내내 쥐를 온열 패드 위에 올려놓으세요.
5. 두피를 면도하고 수술 부위를 포비돈-요오딘으로 소독하세요. 두개골을 노출시키기 위해 중앙선을 따라 1cm 세로 절개를 하세요.
6. 노출된 두개골을 H₂O₂ 로 면봉으로 원을 그리며 세척하여 브레그마를 시각화하세요. 거품이 과도하게 생기면 마른 면봉으로 제거하세요.
7. 마우스를 입체 프레임에 위치시킵니다. 브레그마를 기준점(0.0)으로 설정하고, 브레그마보다 측면 2.5mm, 앞쪽 0.5mm를 측정합니다. 주사 부위를 표시해.
8. 마우스를 제거하고 표시된 좌표에 작은 구멍을 뚫으세요. 뇌 손상을 막기 위해 너무 깊게 드릴링하는 것은 피하세요.
9. 주사기를 인젝터에 장착하세요. 세포를 재현지하고 유리 주사기에 두 번의 주사(4–5 μL)를 충분히 주입하세요. 세포 침전을 방지하기 위해 한 번에 두 번 이상 주사를 준비하지 마세요.
10. 마우스를 입체주행 상태에서 다시 위치시키고, 바늘을 구멍에 맞추고, 천천히 뇌 실질에 3.0mm 깊이로 내려가세요. 세포(또는 가짜 조절을 위한 멸균 PBS)를 분당 1 μL로 주입하세요.
11. 주사 후에는 바늘을 최소 1분간 고정한 후 1.5mm를 빼고 1분 더 버티다가 완전히 빼세요. 이로 인해 역류가 최소화되고 적절한 세포 침착이 보장됩니다.
12. 절개 부위를 봉합하고 포비돈-요오딘을 바르세요. 부프레노르핀(100 μL)을 피하 투여합니다.
13. 마취에서 완전히 회복할 때까지 온열 패드에 마우스를 올려두세요. 쥐를 깨끗한 우리에 다시 넣고 매일 고통, 신경학적 징후, 감염 여부를 관찰하세요.

3. 마우스 심장 내 관류

1. 마우스를 K-X(체중 10g당 100 μL) 주사하여 마취합니다. 발가락 꼬임에 반응이 없다는 점에서 적절한 마취를 확인하세요.
2. 가위를 사용해 복벽을 따라 5–6cm 절개를 하고, 갈비뼈를 따라 쇄골까지 두 개의 절개를 합니다. 주요 혈관을 다치지 않도록 조심하세요.
3. 심장이 노출된 상태에서 오른쪽 심방을 절개해 혈류를 허용하세요. 25G × 1인치 바늘이 장착된 20mL 주사기로 왼쪽 심실에 얼음처럼 차가운 PBS를 주입하세요.
4. 혈액이 없으면 흐르는 액체를 중단하세요. 성체 쥐의 경우 약 20mL PBS가 필요합니다.

4. 쥐의 수막과 후각 구절 분리

1. 심장 내 관류 후에는 수술용 가위로 쥐의 목을 제거합니다. 두피를 완전히 제거해서 두개골을 드러내세요.
2. 가위를 사용해 두개골을 뒤쪽 부위에서 눈 쪽으로 가로로 잘라내며, 뇌 조직을 손상시키지 않도록 주의합니다. 두개골 내부 표면과의 접촉이나 긁힘을 피하면서 가느다란 겸자를 사용해 뇌를 부드럽게 적출하세요.
3. 뇌 제거 후에도 경막 뇌막은 두개골 내부 표면에 붙어 있습니다. 두개골을 얼음처럼 차가운 PBS에 최소 5분간 담가서 뇌막이 온전하게 분리되도록 하세요.
4. 뇌 전방 부위의 후각구를 분리하여 얼음처럼 차가운 PBS로 옮겨 임시 저장 후 처리됩니다.
5. 가는 꼬렛을 사용해 얇은 조직층을 조심스럽게 들어 올리고 벗겨내며 뇌막을 두개골 내부 표면에서 부드럽게 분리합니다. 수막을 얼음처럼 차가운 PBS로 옮기고 추가 처리를 기다립니다. 조직을 찢지 않도록 하여 최적의 하류 세포 회복을 보장하세요.

5. 조직이 단일 세포로 해리됨

1. 뇌뇌
   1. 수막을 0.05% 콜라게나제 II와 DNase I를 포함한 3 mL RPMI 1640에 옮깁니다. 37 °C에서 20분간 배양하고, 10분마다 부드럽게 저어줍니다. 과도한 소화는 세포 생존력을 저하시키므로 피해야 합니다.
   2. 소화된 조직을 40μm 세포 체를 통과시켜 50mL 튜브로 통과시킵니다. 남은 조직을 기계적으로 분리시키기 위해 주사기 플런저를 체에 부드럽게 대고 5mL PBS로 세척합니다.
   3. 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상정액을 버리고 3mL PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
   4. 원심분리 반복. 상청액을 버리고 마지막 부피에 최종 펠릿을 재현탁한 뒤, U 바텀 96웰 플레이트로 옮깁니다.
2. 후각 구구
   1. PBS를 제거하고 주사기 플런저를 사용해 조직을 기계적으로 해리합니다. 행크스 밸런스 소금 용액(HBSS)에 0.02% 콜라겐제 II를 포함한 3 mL 소화액을 첨가합니다. 37°C에서 20분간 부양시키고, 10분마다 부드럽게 저어줍니다.
   2. 세포 현탁액을 70 μm 체에 통과시켜 50 mL 튜브에 넣고 10 mL PBS로 세척합니다.
   3. 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상청액을 버리고 남은 부피에 최종 펠릿을 다시 부탁하세요. U-bottom 96-웰 플레이트로 옮깁니다.
3. 플레이트를 4°C에서 보관해 염색이 될 때까지 보관하세요.
   참고: 최적의 세포 생존 가능성을 보장하기 위해 같은 날 염색을 수행하세요.

6. 세포 염색 및 유세포 분석 획득

1. 패널 설계
   1. 표 1을 참고해 주십시오.
      참고: 이 프로토콜의 패널은 4개의 레이저(보라색, 파랑색, 노란-녹색, 빨강)와 총 51개의 검출기(형광 48개 + 산란 채널 3개)를 갖춘 스펙트럼 유동 세포계를 위해 설계되었습니다. 패널은 유세포계의 구성과 관심 있는 단백질/마커를 기준으로 설계되어야 합니다.
2. 세포 염색
   1. U-bottom 96-웰 플레이트를 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 상정액을 조심스럽게 버리세요. 이 단계부터는 플레이트를 빛으로부터 보호하세요.
   2. 적절한 웰에 50 μL 생존 염료(FVD, PBS 1:5000 희석)를 추가하고 RT 20분간 배양합니다. 150 μL PBS로 세척한 후 300 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다. 생존 염료는 생존 조절군과 샘플에만 첨가하세요.
   3. Fc 수용체를 30 μL 항체(FACS 완충액: PBS 2 mM EDTA, 0.5% BSA 포함)를 10분 동안 적층 배양하여 Fc 수용체를 차단합니다. 170 μL FACS 완충제로 세척하고, 4 °C에서 300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   4. 30 μL 항체 혼합물 또는 단색 대조군(재료 표에 명시된 항체 희석도에 따라 FACS 버퍼에서 준비됨)을 추가하고 얼음 위에서 20분간 배양합니다. 170 μL FACS 완충제로 세척하고, 4 °C에서 300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   5. 세포를 100 μL 2% 파라포름알데히드(PFA)를 PBS에 20분간 RT에서 고정합니다. 100 μL PBS로 세척한 후 300 x g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 세척한 후 상원액을 버립니다.
      참고: 세포 내 마커의 경우, 이 단계를 상용 완충 세트를 이용한 고정 및 투과화로 대체한 후 최종 재현탁 전에 세포 내 염색을 수행하십시오.
   6. 최종 세포 펠릿을 200 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다. 플레이트는 유세포계에서 획득할 때까지 4°C에 보관합니다.
3. 단색 염색 및 형광 마이너스 1(FMO) 대조군
   1. 혼합 최적화를 위해 단일 색상 염색 샘플이 필요합니다. 셀은 양성 및 음성적 피크를 나타내는 마커를 위해 단일 색상 염색 샘플에 사용됩니다. 그렇지 않으면 최적의 혼합 효과를 위해 보상 비즈를 사용하는 것이 권장됩니다. 제조업체 프로토콜에 따라 형광 결합 항체용 보상 구슬을 준비하세요.
      참고: FMO 제어 준비는 특히 명확한 양음 피크가 보이지 않는 마커에 대해 적절한 게이팅을 달성하기 위한 중요한 단계입니다. 필요에 따라 다양한 형광색소를 위해 여러 개의 FMO 샘플을 준비하세요.
   2. 세포 표면 항원용 FMO 샘플은 6.2부의 단계를 따라 준비하되, 6.2.4단계에서는 관심 항체를 항체 혼합물에서 제외합니다.
4. 유세포 분석 획득 및 분석
   1. 세포계를 켜고, 유량세포계 획득 소프트웨어를 실행한 후, 머신이 예열되는 동안(최소 30분 동안) 12 x 75mm 샘플 튜브에 품질 관리(QC) 비즈(300 μL PBS 1방울)를 준비하세요.
   2. 세척 방법은 다음과 같습니다: 3분 동안 10% v/v 표백제, 30분 H_2O,고유량 상태로 사용하세요. 다음 단계를 위해 유량을 다시 낮게 설정하세요.
   3. QC 탭을 선택하고 튜브를 로드한 뒤 시작 버튼을 눌러 비즈를 돌리세요. 품질 관리가 완료되면 "통과됨"이라는 메시지가 뜹니다.
   4. 획득 탭으로 가서 실험을 선택하거나 생성한 후 FSC와 SSC에 따라 세포를 게이팅하여 획득을 시작하세요. 스테인이 없는 단일 색상 컨트롤을 구하고, 혼합 해제 마법사를 실행한 후 설정을 저장하세요. 착색된 샘플을 채취하세요.

결과

E0771 세포에 두개내 접종을 한 후, 쥐들은 표적 입체 위치 좌표에 국소적인 유방암 병변이 발생했습니다. 선조체 실질을 표적으로 하는 입체 좌표(외측 2.5mm, 브레그마 앞쪽 0.5mm, 복측 3.0mm)는 표준 마우스 뇌 지도와 이전에 기술된 두개내 이식 접근법을 바탕으로 선택^{되었습니다.} 이 부위는 접근성이 높고 종양 이식을 지원하면서 뇌실이나 주사로의 누출을 최소화할 수 있기 때문에 두개내 종양 이식에 널리 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 1× 10 5^개의 E0771 세포를 주입하면 10일째에 명확한 종양 부담이 형성되었으나(그림 1A), 최대 종양 성장은 보통 13일째에서 14일째 사이에 발생한다. 이러한 성장 반응학을 바탕으로, 10일째를 종양 확장의 후기, 공격적인 단계 이전의 종양-면역 상호작용을 조사하는 실험 종료 지점으로 선정되었습니다...

토론

두개내 종양 이식과 수막 및 후각구의 분리, 해리 및 면역 특성 분석을 결합함으로써, 이 프로토콜은 뇌종양 미세환경과 중추신경계 관련 면역 인터페이스 간의 동적 상호작용을 상세히 조사할 수 있게 합니다. 이 방법은 두개내 종양 형성을 재현 가능하게 하고, 고품질의 세포 현탁액, 그리고 강력한 면역 하위 집합 해상도를 제공합니다. 그러나 두개내 이식은 전이 연쇄 초기 단계를 우회하여 자발성 뇌 전이를 완전히 재현하지 못합니다. 따라서 조기 확산에 관심 있는 연구자들은 전신 접종 방식을 선호할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜의 면역 프로파일링 요소는 다양한 뇌 전이 모델에 걸쳐 널리 적용 가능합니다.

조직 처리는 추가적인 도전 과제를 도입합니다. 수막과 후각구는 세포 수가 제한된 작은 조직이며, 과도한 기계적 교란, 효소 과소화 또는 장기간 배양은 생존 가능한 세포 회복을 크게 감소시킬 수 있습니다. 반복적인...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	1:300 희석으로 사용
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	1:50 희석으로 사용
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	1:80 희석으로 사용
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	FACS Buffer 준비용
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	1:80 희석으로 사용
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	1:30 희석으로 사용
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	1:40 희석으로 사용
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	1:50 희석으로 사용
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	1:80 희석으로 사용
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	1:40 희석으로 사용
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	부프레노르핀
Cell strainer 40-μm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-μm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	FACS Buffer 준비용
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	1:50 희석으로 사용
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	생존율 염료 (1:5000 희석으로 사용)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	케타민
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	고정 완충액 준비용
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	1:50 희석으로 사용
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	1:300 희석으로 사용
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	1:80 희석으로 사용
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	1:80 희석으로 사용
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	1:100 희석으로 사용
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	1:160 희석으로 사용
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	1:300 희석으로 사용
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	1:80 희석으로 사용
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg