세포 생물학 응용을 위한 명확한 강성을 가진 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 세포외기질 기질 생성

요약

세포외 기질(ECM) 강성은 세포 행동의 핵심 조절 요인이지만, 근본적인 감지 및 전도 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이를 해결하기 위해, 세포-ECM 교차 대화에 대한 이해를 진전시키기 위해 강성을 조절할 수 있는 폴리아크릴아마이드 및 실리콘 기반 기판을 생성하는 프로토콜을 제공합니다.

초록

세포외기질(ECM)은 세포 행동을 조절하는 중요한 요인으로, ECM의 강성은 세포 신호, 형태, 운명을 조절하는 주요 기계적 신호 역할을 합니다. 그러나 강성 의존성 세포 반응에 대한 실험적 연구는 재현 가능하고 비용 효율적이며 접근 가능한 배양 플랫폼의 가용성에 의해 제한되는 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 폴리아크릴아마이드(PA) 및 실리콘 기반 방법을 사용하여 조정 가능한 강성을 가진 ECM 기판을 제작하는 방법을 설명합니다. 이 절차는 기질 준비, 표면 기능화, ECM 단백질 결합을 설명하여 생리학적으로 중요한 강성 범위 전반에 걸쳐 일관된 세포 부착을 보장합니다. PA 기반 기질은 단백질 및 RNA 추출을 포함한 하위 생화학적 분석과 고해상도 형광 영상 수행에 적합합니다. 실리콘 기반 기판은 전반사 형광(TIRF) 현미경에 최적화되어 기저막에서 세포-ECM 상호작용을 시각화할 수 있습니다. 또한, 연질 기판은 일정한 영상 평면 내에 위치한 구형 배양을 지원하도록 적응할 수 있어 일관된 이미지 획득을 가능하게 합니다. 이 방법들은 ECM 강성이 세포 과정을 어떻게 조절하는지를 체계적으로 탐구할 수 있는 견고하고 비용 효율적이며 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 생리학적·질병적 맥락에서 세포-ECM 교차 대화에 대한 메커니즘적 통찰을 발전시킵니다.

서론

세포외기질(ECM)은 조직의 기계적 특성을 정의하고 그 생물학적 기능을 지원하는 근본적인 구조적·생화학적 비계입니다. 예를 들어, 폐와 동맥과 같은 탄성 조직은 콜라겐 및 엘라스틴 기반 ECM으로 풍부하게 되어 호흡 중 반복적인 신장-반동 사이클에 필요한 기계적 탄력을 제공합니다. 반면, 중추신경계는 글리코사미노글리칸이 풍부한 ECM을 포함하고 있어 신경 분화와 신호 전달에 최적화된 매우 순응적인 환경을 만듭니다^. 신체 내 다양한 조직에서 조직 경직은 뇌와 폐 같은 연조직에서 수백 파스칼에서부터 힘줄과 뼈의 메가파스칼 및 기가파스칼 경직에 이르기까지 수십 배에 걸쳐 있습니다. 이러한 기계적 차이는 단순한 구조적 차이가 아니라 세포 행동 조절에 중요한 역할을 합니다 ^4,5. 예를 들어, 중간엽 줄기세포는 강성 의존적 계통 명세를 거치며, 부드러운 기질에서는 신경 운명을, 중간 기질에서는 근형성 운명을, 단단한 기질에서는 골생성 운명을 채택한다. ECM 강성의 병리학적 변화도 이상한 세포 반응을 유발하여 질병 시작과 진행에 기여할 수 있습니다 ^7,8,9. 마찬가지로, 세포 주변의 ECM 특성 변화도 소기관 기능과 다양한 세포 행동을 변화시킵니다^10,11. ECM이 신호 전달, 소기관 기능, 질병 발병 기전을 안내하는 데 중요한 역할을 한다는 점이 인정되었음에도 불구하고, 세포가 ECM 신호를 감지하고 생화학적 신호로 변환하는 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.

세포-ECM 크로스토킹 이해의 진전은 ECM 특성을 정밀하게 제어하면서도 표준 생화학적 분석법과 영상 워크플로우와 완전히 호환되는 실험 플랫폼의 제한된 가용성 때문에 부분적으로 저해되었습니다. 또한, 세포-ECM 상호작용 연구는 재료 과학, 세포 생물학, 생명공학 등 다양한 학제적 전문성을 요구하기 때문에 기술적으로 도전적이라고 여겨집니다. 이 방법은 대부분의 습식 실험실 환경에서 쉽게 준비할 수 있는 명확한 기계적 특성을 가진 PA 및 실리콘 기반 ECM 기판을 생성하는 단계별 프로토콜을 제공하여 이러한 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다.

조절 가능한 강성을 가진 PA 하이드로겔은 기계생물학의 필수 재료입니다; 그러나 ECM 결합을 위한 시약 비용이 높고, 표면 기능화가 일관되지 않으며, 대규모 생화학적 작업 흐름과의 호환성 부족으로 인해 유용성이 자주 떨어집니다. 또한, 다양한 강성을 가진 기판에서 샘플 채취 및 영상 촬영을 위한 실용적이고 표준화된 접근법도 잘 확립되지 않았습니다. 이러한 병목 현상은 네 가지 핵심 혁신으로 특징지어지는 저희가 설명한 PA 겔 플랫폼을 통해 해결할 수 있습니다: (i) 상당한 비용 절감, (ii) 재현 가능한 기능화 화학, (iii) 재사용 가능한 하드웨어를 통한 확장 가능한 생산, (iv) 많은 기존 세포 생물학 및 생화학적 분석법과의 원활한 통합. 이 방법은 아크릴아마이드와 비사크릴아마이드의 서로 다른 비율을 활용하여 기계적 특성이 뚜렷한 하이드로겔을 생성합니다 (표 1). PA 겔은 불활성 상태이며 ECM 단백질과 직접 결합하지 못합니다. 따라서 UV 유도 자유 라디칼 중합 반응을 사용하여 디(트리메틸롤프로판) 테트라아크릴레이트, 아크릴산 N-하이드록시숙시니마이드 에스터(NHS-아크릴레이트), 비사크릴아마이드가 PA 겔 표면에 얇고 가교결합된 네트워크를 결합시킵니다 (그림 1). 이 네트워크는 ECM 단백질에 이중 작용 접착 표면을 만듭니다: NHS-아크릴레이트는 ECM 단백질에 안정적인 공유 결합 고정을 제공하고, 테트라아크릴레이트는 균일한 ECM 단백질 흡착을 촉진합니다^. 또한, 우리는 서부 블롯팅 및 역전사 정량 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)과 같은 하위 세포 생물학 분석과 호환되는 방식으로 단백질과 RNA와 같은 핵산을 이러한 기질에서 수확하는 방법을 시연합니다. 더 나아가, 결과적으로 순응하는 PA 기질은 구형 형성을 지원하고 구체를 일정한 초점면 내에 위치시키기 위해 3D 세포 행동의 체계적 분석을 가능하게 합니다¹³.

반면, PA 하이드로겔의 광학적 한계는 특히 전반사 형광(TIRF) 현미경과 같은 첨단 영상 방식에서의 사용을 제한합니다^. 이 제약을 해결하기 위해 TIRF 이미징에 최적화된 기계적으로 조정 가능한 실리콘 기반 ECM 기판을 개발했습니다. 이 재료들은 유리와 매우 가까운 굴절률을 가지면서도 넓은 범위에서 조절 가능한 강성을 유지합니다 (그림 2A). ECM 결합 전에 다양한 부품 비율의 얇은 실리콘 젤 코팅을 덮개 유리에 스핀 코팅합니다 (그림 2B 및 표 2). 그러나 실리콘의 고유한 소수성과 화학적 불활성 특성 때문에 직접적인 ECM 결합은 불가능합니다. 따라서 우리는 ECM 리간드의 공유 결합 결합을 가능하게 하는 표면 변형 전략을 구현합니다. 산소 플라즈마 처리는 실리콘 표면에 하이드록실기를 도입합니다 (그림 2C). 그 후 (3-아미노프로필)트리에톡실실란(APTES)이 이 하이드록실기를 반응성 아민으로 전환합니다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이마이드 하이드로클로라이드(EDC)는 0 길이의 카보디이마이드 가교제로, 젤 표면의 아민기와 ECM 단백질의 카복실기 사이에 공유 공유 아미드 결합 형성을 촉진합니다.

이 ECM 플랫폼들은 ECM 강성 의존적 신호 메커니즘을 탐침하기 위한 비용 효율적이고 재현 가능하며 확장 가능한 시스템을 제공합니다. 이들의 유연성은 생화학적 분석, 고해상도 영상, 고처리량 워크플로우와의 원활한 통합을 가능하게 하여, ECM 강성이 세포 행동에 어떻게 영향을 미치고 질병 진행을 촉진하는지 연구할 수 있게 합니다.

프로토콜

1. PA 기반 ECM 하이드로겔 생성

1. PA 젤 부착을 위한 유리 표면의 기능화
   참고: 모든 단계는 궤도 셰이커에서 실온에서 수행하세요. 단계 사이에 고품질 물로 꼼꼼히 헹구세요.
   1. 유리 표면을 화학물질 저항성 접시(예: 폴리스티렌)에서 3시간 동안 10% 표백제로 세척하세요. 유리를 완전히 덮을 만큼 충분한 부피를 사용하고, 거품이나 건조한 공간이 없도록 하세요.
      주의: 표백제는 매우 부식성이 강하고 반응성이 강한 화학물질입니다. 제조사의 안전 지침을 따르세요.
   2. 커버슬립을 0.2M 염산(HCl)에 16시간 동안 셰이커에서 부드럽게 저어주어 배양합니다.
      주의: HCl은 매우 부식성이 강하며 피부에 화상을 입힐 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   3. 0.1 M NaOH를 추가하고 1시간 배큐하세요.
      주의: NaOH 용액은 부식성이 있어 피부에 화상을 입힐 수 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   4. 커버슬립을 0.5% APTES의 고품질 물에 30분간 부화하세요.
      주의: APTES는 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 연기함에서 APTES와 함께 일하세요.
   5. 잔류 APTES를 제거하기 위해 많은 양의 물로 린스를 사용하세요.
      참고: 세척이 불완전하면 다음 단계에서 APTES와 글루타알데히드 사이에 반응이 일어나 흰색 침전물이 생성되어 유리 표면 활성화를 저해합니다.
   6. 커버슬립을 0.5% 글루타알데히드에 PBS에 1시간 배양하세요.
      주의: 글루타알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)와 함께 연기함에서 글루타알데히드를 다루세요.
   7. 커버슬립은 흡수성 재료(예: 종이 타월)에 하룻밤 말리세요. 커버슬립은 깨끗하고 밀봉된 용기에 보관해 두세요.
2. PA 하이드로겔 용액 및 젤 주조
   참고: 지정된 탄성 계수를 가진 하이드로겔을 얻기 위해 필요한 제형은 표 1에 제공되어 있습니다. 다양한 실험 응용에 권장되는 겔 부피와 유리 크기는 표 3에 제시되어 있습니다.
   1. PA 하이드로겔 성분을 1.7mL 마이크로 원심분리관에 혼합하며, 과황산암모늄(APS)과 테트라메틸렌디아민(TEMED)을 제외합니다.
      참고: 대량 준비는 하지 마세요. 고강도 젤은 빠르게 중합되어 주조가 완료되기 전에 경화될 수 있습니다.
   2. PA 젤 혼합물, APS, TEMED 튜브를 25 mmHg 진공 챔버에서 30분간 탈기합니다.
   3. 소수성 상커버슬립은 면봉으로 수수 발효 코팅을 발라서 준비하세요. 겔 중합을 일관되게 유지하려면 커버슬립에 얼룩이 없도록 하세요.
   4. 탈기된 용액에 APS와 TEMED를 추가한 후, 혼합물을 활성화된 커버슬립에 부드럽게 피펫팅하세요.
   5. 소수성 커버슬립을 용액 위에 올려 균일하고 얇은 하이드로겔 층을 만듭니다. 젤을 실온에서 35분간 중합시키세요. 커버슬립 사이에 기포가 끼지 않고, 용액이 가장자리로 흘러나가지 않도록 하세요.
      참고: 적절한 두께를 위해 젤 주조 권장 부피를 따르세요; 지나치게 얇은 젤은 세포가 밑에 있는 유리를 감지할 수 있게 합니다^. 젤 샌드위치를 분해하기 전에 마이크로 원심분리기 튜브 내 잔류 혼합물을 확인하여 중합 여부를 확인하세요.
   6. 하이드로겔 샌드위치를 PBS에 담가서 층을 분리하세요. 하이드로겔이 활성화된 하단 커버슬립에 계속 부착되어 있어야 하며, 소수성 상단 커버슬립은 쉽게 분리됩니다.
3. ECM 리간드를 이용한 하이드로겔의 기능화
   참고: 이 섹션의 모든 단계는 생물안전 캐비닛 내부의 멸균 조건 하에서 수행되어야 합니다.
   1. 하이드로겔을 70% 에탄올에 담가 멸균한 후, 멸균 PBS가 포함된 조직 배양용 플라스틱웨어로 옮깁니다.
      참고: 하이드로겔을 에탄올에 장기간 두지 마세요. 젤이 탈수되고 ECM 결합이 손상됩니다.
   2. 물, 에탄올, HEPES, 비사크릴아마이드로 구성된 마스터 믹스 기능화 용액을 준비합니다(표 4).
      주의: 비사크릴아마이드는 흡입 또는 섭취 시 독성이 있습니다.
   3. 희석된 UV 광시작제와 테트라아크릴레이트 용액을 준비합니다. 두 시약 모두 에탄올에 용해되어 있습니다(표 4).
      참고: 과도한 양이 있으면 과중합과 검은 표면 침전물이 발생할 수 있으므로, 매번 연속적으로 희석해야 합니다( 그림 3A 참조).
   4. 분석 저울을 사용해 필요한 NHS-아크릴레이트 양을 계량하세요. 사용 직전에 NHS-아크릴레이트를 50% 에탄올/50% 물에 재현탁하세요.
      참고: NHS-아크릴레이트가 과도하면 눈에 띄는 검은 표면 침전물이 형성되고 ECM 코팅이 고르지 않을 수 있습니다(그림 3B).
   5. 1.3.2단계에서 준비된 마스터 믹스에 UV 광이니시에이터, 테트라아크릴레이트, NHS-아크릴레이트 용액을 추가합니다. PBS를 흡입한 후 마스터 믹스를 젤에 넣어 완전히 덮이도록 하세요.
   6. 하이드로겔을 조직 배양 접시 뚜껑 없이 400초간 자외선에 노출시킵니다(파장 365nm 미만의 자외선원).
      주의: 자외선을 사용할 때는 적절한 안구 보호구를 착용하세요.
   7. 젤을 꺼내 얼음 위에 올려두세요. 기능화 용액을 흡입한 후, 젤을 미리 냉각된 멸균 25 mM HEPES(pH 6.0)로 세 번 세척한 후, 0.9% NaCl 염료를 미리 냉각한 무균으로 세 번 세척합니다.
   8. 수소겔을 ECM 리간드와 함께 선정 냉장 무균 100 mM HEPES(pH 8.0)와 100 mM NaCl, 4 °C에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 배양합니다.
      참고: ECM 리간드의 농도는 사용자의 재량에 따라 선택할 수 있습니다; 그러나 동일한 배치 내에서 다양한 강성을 가진 모든 기판에서 동일한 리간드 농도를 유지하는 것이 매우 중요합니다.
   9. 16시간 후에 ECM 리간드 용액을 조심스럽게 흡입하세요. 하이드로겔을 PBS로 세 번 세척하고, 혈청 없는 베이스 미디어(PBS)를 추가해 수분을 유지하세요. 젤을 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 배양하여 세포 시딩을 하기 전에 멸균성을 확인하세요.
      참고: 오염이 있을 경우 37°C에서 베이스 배양 배지에서 하룻밤 배양한 후 배지가 흐릿하게 보일 수 있습니다.
   10. 젤은 즉시 세포 씨앗을 사용하거나 4°C의 베이스 배지에서 3주를 넘지 않게 보관하세요.

2. 기계적으로 조절 가능한 실리콘 기반 ECM 기판 생성

1. 실리콘 젤 코팅용 유리 커버슬립 준비
   1. 3M NaOH를 넣은 깨끗한 유리 커버 슬립을 20분간 사용하세요.
   2. 고급 물로 다섯 번 깨끗이 씻고 마지막에 물을 흡입하세요. 자연 건조시키고 남은 물방울이나 이물질을 제거하기 위해 질소 공기 분사기를 사용하세요.
2. 실리콘 젤 제조
   1. 표 2에 명시된 무게 비율에 따라 분석 저울을 사용하여 2성분 실리콘 엘라스토머의 성분 A와 성분 B를 무게 측정합니다. 잘라낸 피펫 팁을 사용해 점성이 높은 용액을 흡입하세요.
   2. 성분 A와 성분 B를 피펫 팁을 사용해 완전히 혼합되도록 하세요.
   3. 혼합물을 진공 챔버에서 25 mmHg로 10분간 탈기합니다.
3. 젤 주조물, 유리 커버슬립
   1. 커버슬립을 스핀 코터 위에 놓은 고무 매트 위에 올려 중심이 잘 맞도록 하세요.
      참고: 고무 매트는 적절한 진공 밀봉을 보장합니다. 적절한 밀봉이 없으면 커버슬립이 밀려나 파손될 수 있습니다. 부적절한 중심 맞추는 경우 코팅이 균일하지 않을 수 있습니다.
   2. 커버슬립을 고정하기 위해 진공청소기를 작동시키세요.
   3. 커버슬립 중앙에 젤 혼합액 100 μL을 추가하세요. 500rpm에서 10초간 스핀 코팅을 한 뒤, 8,000rpm에서 60초간 회전합니다.
   4. 코팅된 커버슬립을 80°C에서 2시간 동안 구워요. 상온까지 식히세요.
      참고: 사용 전 최대 한 달간 실온에서 보관하세요.
4. ECM 리간드를 이용한 실리콘 겔의 기능화
   1. 실리콘 젤 코팅된 커버슬립을 산소 플라즈마에 5분간 11W 출력으로 노출시킵니다.
      참고: 산소 플라즈마에 더 오랜 시간 또는 더 높은 출력으로 노출되면 젤이 균열될 수 있습니다. 사용되는 장비에 따라 전력과 시간의 최적의 조합을 테스트해야 할 수도 있습니다.
   2. 95% 에탄올, 0.5% APTES, 4.5% dH₂O를 포함한 실란화 용액을 준비합니다.
      참고: 이후 모든 단계는 생물안전 캐비닛 내에서 멸균 조건에서 수행하십시오.
      주의: APTES는 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 연기함에서 APTES와 함께 일하세요.
   3. 젤로 코팅된 커버슬립을 실란화 용액과 함께 10분간 배양하세요.
   4. PBS로 다섯 번 깨끗이 세척하세요.
   5. 100 μg/mL EDC와 원하는 ECM을 PBS 농도로 포함한 ECM 용액을 준비합니다.
      참고: EDC는 용액 내에서 불안정하고 습기에 민감합니다. 사용 전에 신선하게 준비한 후, 습기와 직사광선으로부터 보호된 서늘하고 건조한 곳에 꼭 밀봉해 보관하세요.
      주의: 일기용 약물은 삼키면 해롭고 흡입하면 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 연기구 작업장에서 일하세요.
   6. 커버슬립을 ECM 용액과 함께 37°C에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 정도 배양하세요.
   7. 커버 슬립을 PBS로 다섯 번 세탁하세요. 베이스 배지로 씻고 세포를 추가하세요.
      참고: 최적의 세포 밀도는 특정 세포주와 실험 목표(예: 형태학적 하위 결합 또는 세포 간 부착을 위한 단층)에 따라 달라집니다. 예를 들어, 섬유아세포가 48시간 내에 50% 합류를 달성할 때 0.1 x 10⁶ cells/^{cm 2} 의 밀도가 일반적으로 사용됩니다.

3. 면역염색 및 영상 촬영을 위한 ECM 기질 준비

1. PA 기반 기질에서의 면역염색 및 영상
   참고: 18밀리미터 PA 하이드로겔은 일반적으로 정량적 분석을 위한 충분한 영상 면적을 제공합니다. 영상 응용을 위해 하이드로겔을 주조하고 15 mL 튜브로 만든 '오렌지 챔버'에서 면역염색을 수행합니다. 구조적 완전성을 유지할 경우 오렌지 챔버를 여러 차례 젤 주조 및 염색에 재사용하세요.
   1. 폴리카보네이트 필름과 실리콘 고무 필름으로 만든 펀치 링은 18mm 외경과 14mm 내부 구멍 펀치를 사용해 스페이서와 개스킷을 준비합니다.
   2. 가위로 15mL 원심분리관 캡 중앙에 구멍을 내어 젤 주조 및 염색을 위한 챔버를 만드세요.
   3. 원심분리기 튜브가 14mL 지점에 있는 걸 봤어요. 고르지 않은 가장자리는 메스로 다듬고, 캡 가장자리를 줄질로 다듬어 표준 12웰 플레이트에 맞도록 하세요.
   4. 하이드로겔-커버슬립 샌드위치(섹션 1에 설명됨)를 조립하고, 스페이서 링을 활성화된 커버슬립에 올립니다.
   5. 젤이 완전히 중합되면 샌드위치를 분해하세요.
   6. 18mm 하이드로겔을 멸균한 후 멸균 PBS가 포함된 12웰 조직 배양 플레이트로 옮깁니다.
   7. 1절에 설명된 대로 ECM 리간드 기능화를 수행합니다.
   8. 세포를 씨앗 채우고 4% 포름알데히드로 고정하세요.
      참고: 알코올 기반 고정제는 젤을 탈수 시키고 구조적 완전성을 해칠 수 있으므로 피하세요.
      주의: 포름알데히드는 독성이 있으므로 반드시 연기구 내부에서 사용해야 합니다.
   9. (선택 사항) 샘플을 원심분리기 튜브 캡 챔버에 다시 조립하세요. 실리콘 가스켓을 사용해 챔버를 밀봉하세요.
      참고: 착색 전 몇 시간 동안 PBS로 누수 테스트를 수행하세요. 이 방법은 더 번거로워 보일 수 있지만, 균일한 염색을 촉진하고 항체 소비를 줄여줍니다.
   10. 사용자가 선호하는 프로토콜에 따라 면역형광 염색을 진행하세요.
   11. 염색 후 샘플을 50% 글리세롤을 보충한 PBS에 보관하세요. 샘플을 가능한 한 빨리 촬영하세요.
       참고: 경화되는 표준 마운팅 매체는 피하세요. 시간이 지남에 따라 하이드로겔이 균열이 크고 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 형광 강도는 시간이 지남에 따라 감소합니다; 최적의 신호 품질을 위해 1주 이내에 이미지를 작성하세요.
   12. 조직배양 접시의 유리 바닥 표면에 PBS(또는 마운팅 매체)를 소량 떨어뜨립니다. 착색된 하이드로겔을 조심스럽게 방울 위에 뒤집어 세포가 유리 커버 유리를 향하게 한 후 영상 촬영을 진행하세요.
2. 실리콘 기반 ECM 기판에서의 면역염색 및 영상
   1. 샘플을 4% 포름알데히드로 고정한 후 표준 면역형광 프로토콜에 따라 유리 바닥 접시에 직접 염색합니다. 알코올 기반 고정제는 ECM 기판을 갈라지게 하므로 피하세요.
   2. 전통적인 형광 현미경을 이용해 직접 샘플을 촬영할 수 있습니다.

4. ECM 기판에 플레이트된 세포에서 단백질과 RNA를 채취하는 것

1. 겸자를 사용해 배양 접시에서 젤을 조심스럽게 제거하고 멸균 PBS에 담가 잔여 배양 배지와 혈청을 헹구세요.
   참고: 커버슬립은 매우 약하고 쉽게 깨질 수 있으니 조심스럽게 다루세요.
2. 하이드로겔 가장자리를 낮은 보풀 물티슈로 부드럽게 두드려 과도한 PBS를 제거하세요.
3. 조직 배양 접시 뚜껑에 적절한 양의 RNA 추출 완충제를 추가하세요.
   참고: 페놀-구아니딘 기반 시약은 PA 겔에서 RNA 추출과 호환됩니다. 단백질 용해 완충제는 실험적 요구사항에 따라 사용될 수 있습니다. 용해 버퍼 인큐베이션 후 현미경으로 샘플을 시각화하여 세포가 완전히 파괴되도록 하세요.
4. 커버슬립(젤 면이 아래쪽)을 용해 용액 위에 올려놓으세요. 모든 세포의 균일한 용해를 위해 하이드로겔을 여러 번 조심스럽게 들어 올렸다 내렸다 합니다.
5. 젤 표면을 부드럽게 긁어 분해액을 방출하세요.
   참고: 상업용 플라스틱 셀 스크레이퍼는 사용하지 마세요. 단단한 플라스틱이 부드러운 하이드로겔을 손상시키고 용해물을 젤 조각으로 오염시킬 수 있습니다. 스페이서 제작에 사용되는 부드러운 플라스틱(3.1.1 단계 참조)은 이 목적에 적합하며, 맞춤형 스크레이퍼를 만드는 데 재활용할 수 있습니다.
6. RNA 또는 단백질 용해액은 -80°C에 보관하여 기존 생화학적 방법으로 추가 가공하거나 즉시 사용하세요.

5. 단면체 구형 문화의 생성

1. 75 Pa PA 하이드로겔을 18mm 커버슬립에 제비하고, 세포 부착을 용이하게 하기 위해 기저막 추출물(BME) 또는 다른 적절한 ECM 리간드로 표면을 기능화합니다.
2. 원하는 밀도로 ECM 코팅된 하이드로겔 또는 실리콘 젤에 세포를 시딩합니다.
3. 2시간 후에는 부드럽게 분리된 세포를 제거하고, 미리 냉각된 기저 배지에 희석한 BME 오버레이를 추가하세요.
   참고: BME는 가열 과정에서 중합됩니다. 피펫팅 전에 미리 냉각하세요. 포함된 BME의 비율은 결과물인 3D 스캐폴드의 원하는 기계적 완전성과 안정성에 따라 결정됩니다.
4. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 1.5시간 배양하여 BME 중합을 가능하게 합니다.
5. 세포 배양지를 부드럽게 넣어 3D 젤을 완전히 덮습니다.
6. 배양 상태를 표준 조건에서 유지하세요. 세포는 원하는 실험 종점에 도달할 때까지 시간이 지남에 따라 자기 성장하고 3D 구상체로 조립됩니다.

결과

표 1의 제형을 사용하여 생성된 PA 겔 강성은 리오미터를 사용해 실험적으로 테스트되었습니다. 명목상 강성 값이 0.4 kPa, 6 kPa, 3자릿수 크기의 겔을 선택했습니다. 측정된 강성 값은 400 Pa 겔± 363 76 Pa, 6 kPa 겔 ± 6.41 0.50 kPa, 60 kPa 겔 36 ± 8 kPa였습니다(그림 4A). PA 겔에 균일한 ECM 부착 상태를 평가하기 위해, 형광 표지된 피브로넥틴을 젤 표면에 결합하였다. 겔당 다섯 개의 무작위 시야를 촬영하고 평균 형광 강도를 정량화하였습니다. 0.4 kPa 및 6 kPa 코팅된 형광 표지 피브로넥틴 겔은 표지되지 않은 피브로넥틴 코팅된 젤에 비해 형광 강도가 더 높았습니다. 각 젤의 다섯 개 영역에서 형광 강도가 일관되어 있어 표면 결합이 균일함을 나타냈다(그림 4B).

토론

설명된 ECM 제조 프로토콜은 재현 가능하고 확장 가능하며 비용 효율적인 워크플로우를 제공하며 대부분의 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 전통적인 유리 및 플라스틱 배양 도구는 편리하고 빠른 데이터 수집을 가능하게 하지만, 합성 기질은 생리학적으로 중요한 조직 강성을 재현하지 못합니다. 폴리디메틸실록산(PDMS)이나 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)과 같은 대체 기계적으로 조절 가능한 기판은 제작이 더 쉽지만, 일반적으로 서브 킬로패스칼 범위의 강성 값을 달성하지 못해 뇌와 폐와 같은 연조직 모델링에 적합성이 제한됩니다^19,20. 반면, PA 하이드로겔과 실리콘 젤은 조직 역학 범위 내에서 강성 값을 제공하며, 단순한 리간드 결합을 지원하면서도 많은 세포 기반 분석과 호환됩니다. 또한 이 방법은 현재 비용이 많이 들지만 편리한 Sulfo-SANPAH 방법보다 저렴...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
1.7 mL 마이크로센트리퓨지 튜브	-	LMCT1.7B	FroggaBio
12웰 조직 배양처리 플레이트	-	83.3921	Sarstedt
주황색 챔버용 15 mL 원심분리기 튜브	-	CLS430790	Corning
2-하이드록시-4'-(2-하이드록시에토시)-2-메틸프로피오페논(Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
2% 비사크릴아마이드 용액	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-디메틸아미노프로필)-1-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드	28718-90-3	-	Sigma
4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)	-	D1306	Invitrogen
40% 아크릴아마이드 용액	01/06/1979	-	Bio-Rad
50% 글루타르알데히드	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
6 cm 조직 배양처리 접시	-	83.3901	Sarstedt
A549 세포	-	CCL-185	ATCC
아크릴산 N-하이드록시석신임에스터	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
알렉사 플루오르 488 염소 항-토끼 항체	-	A11008	Invitrogen
알렉사 플루오르 594 NHS 에스터(tris(트리에틸암모늄 염))	-	A37572	Invitrogen
암모늄 퍼설페이트	7727-54-0	-	Bio-Rad
투명한 충격 저항성 폴리카보네이트 필름(0.005인치; 스페이서)	-	85585K72	McMaster-Carr
CY 52-276 실리콘 젤, 구성 요소 A와 B	2624028	-	Dow
듈베코의 수정된 독수리 중간(DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
무수 에탄올	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
태아 소 혈청	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
피브로넥틴	-	356008	Corning
포름알데히드(16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
고온 실리콘 고무 시트(0.020인치; 개스킷)	-	86435K452	McMaster-Carr
염산	7647-01-0	-	BioShop
대형 중공 구멍 펀치 도구 세트	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
250 mL 미디어 저장용 보로실리케이트 유리 병	-	CLS1395250	Corning
500 mL 미디어 저장용 보로실리케이트 유리 병	-	CLS1395500	Corning
MicroAmp Fast Optical 96웰 반응 플레이트	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
18mm 직경의 현미경 슬라이드 커버슬립	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
50mm 직경의 현미경 슬라이드 커버슬립	-	1.84E+16	eBay
PBS(1배)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS(10배)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
파로이딘	17466-45-4	-	Biotium
인산화-FAK(Tyr397) 항체	-	85567	Cell Signaling Technology
인산화-MLC(Ser19) 항체	-	3671	Cell Signaling Technology
플라즈마 청소기	-	PDC-32G	Harrick Plasma
qPCR 프라이머(순방향 및 역방향)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
qScript cDNA 합성 키트	-	95047	QuantaBio
레인-X	-	-	Rain-X
스크류 캡 튜브, 원추형 바닥, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
스크류 캡 튜브, 원추형 바닥, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
10 mL 세릴로지클 피펫	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
25 mL 세릴로지클 피��