액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

Summary

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

Abstract

액상 인터페이스 이중층(DIB)은 통제된 전기 자극 하에서 지질 및 지질-펩타이드 막의 전기기계적 특성을 탐구할 수 있는 조절 가능한 플랫폼을 제공합니다. DIB는 단일 채널 및 앙상블 이온 전도도 측정을 기존 패치 클램프 기법보다 훨씬 큰 막 면적에 대해 가능하게 하여, 전기기계적 변형과 이온 전도 펩타이드에 미치는 영향에 대한 막 수준의 분석을 가능하게 합니다. 벌크 탄화수소 오일 상(예: 헥사데케인 [C16] 대 도데케인/헥사데케인 [C12/C16] [25%/75%, v/v])을 체계적으로 조정함으로써, 이 하향식 플랫폼은 막 조성과 오일 환경의 체계적인 변화를 가능하게 하며, 이는 막의 점탄성과 구조 재조직, 그리고 펩타이드 이온 전도에 영향을 미칩니다. 다양한 탄화수소 오일 조성을 이용한 그라마시딘 A-도핑 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC) 막의 조립과, 막을 준안정 전기기계 상태로 유도하는 전압-펄스 프로토콜의 적용에 대한 상세한 절차가 제공됩니다. 적응성 막 이온 전도가 특징지어지며, 모델 막 시스템에서 단기 가소성 유사(STP 유사) 반응과 장기적 증강 및 억제 유사(LTP 유사/LTD 유사) 반응을 포함합니다. 더 넓게는, 이 프로토콜은 조성 의존적이고 막 수준의 전기기계적 기여가 시냅스와 유사한 전도성 거동에 대해 체계적으로 조사하고, 지질막 환경이 이온 채널 기능을 어떻게 조절하는지 이해하기 위한 견고하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

Introduction

생물학적 막은 이온 전도를 조절하고 전기 및 화학적 시냅스(^1,2,3,4)를 통해 뉴런 간 통신을 가능하게 하는 중요한 초분자 구조입니다^. 이러한 유형의 소통은 시냅스 가소성에 의해 추가로 조절되며, 시냅스의 구조적 변화가 시냅스의 강도와 지속성을 ^5,6 범위 동안 조절하며, 이는 일반적으로 단기 가소성(STP)과 장기 증강 또는 억제(LTP 또는 LTD)로 설명됩니다. 이러한 현상은 신경 활동에 반응하여 막 전도도의 동적 변화를 포함하며, 종종 학습과 기억⁸의 기초인 신경가소성⁷과 연관된다. 전통적인 가소성 모델은 단백질 합성, 운송, 인산화를 통한 이온 채널의 생화학적 조절을 강조하는 경우가 많습니다. 그러나 가소성 모델에서 신경세포 원형질막의 역할은 대부분 간과되어 왔다^10,11.

패치 클램프 방법은 단일 이온 채널 전기생리학을 연구하는 데 반세기 이상 사용되어 왔습니다. 그러나 이들은 온전한 시냅스나 대규모 합성 모델보다 훨씬 작은 막 영역만 조사할 수 있습니다. 따라서 중규모 막 재조직 및 변형 연구에는 기술적 한계가 있습니다. 메소스케일은 막 생물물리학의 여러 측면을 이해하는 데 있어 점점 더 중요한 길이 척도로 인식되고 있습니다^12,13.

1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC) 액상 인터페이스 이중층(DIBs)^14,15를 단가 펩타이드 양이온 이온포체인 그라마시딘-A(gA)와 도핑하여 전기 시냅스에서 일어나는 이온전도와 유사한 방식으로 모델링하는 방법론이 제시되었습니다. 이 시스템은 여러 가지 주요 장점을 제공합니다: (i) DIB는 체계적인 막 재조직을 가능하게 하는 조절 가능한 지질 및 오일 플랫폼을 제공합니다¹⁶; (ii) DIB는 단일 채널 및 앙상블 채널 이벤트를 다양한 길이 척도에서 연구할 수 있게 합니다^17,18; 그리고 (iii) DIB는 전기기계적으로 유도된 집단 막 재구조화를 포착하는 2 이하^{크기의 막} 패치를 조사할 수 있게 하면서도, 단일 채널 이온 전도 사건을 해소하는 능력을 보존할 수 있게 한다^19,20. 이 방법은 기존 패치 클램프로 접근 가능한 막 영역보다 넓은 막 영역에 대해 동시에 전기적·광학적 전기역학을 조사해야 하는 연구에 가장 적합합니다. 동시에 이산 채널 이벤트를 해석할 수 있는 능력을 유지할 수 있습니다. 특히 막 조성, 오일 환경, 부과된 전압 파형이 집단적인 막 재구조화와 펩타이드 전도에 어떤 영향을 미치는지 실험 목표에 조사하는 데 유용합니다. 이 방법은 원래의 세포 구조나 온전한 생물학적 막에서 단백질 구조 변화의 직접 분자 판독을 요구하는 실험에는 덜 적합하다 19,20,21.

생리학적으로 관련된 전기 자극을 적용함으로써 DIB는 동적 전기기계적 재구조화가 펩타이드 이온 채널 전도에 변화하는 비평형 정상 상태로 유도됩니다. 이러한 이온 전도의 출현 변화는 신경과학 22,23,24에서 논의된 신경학적 STP, LTP, LTD 현상과 기술적으로 유사합니다. 본 연구에서는 이러한 행동들이 주로 점탄성 및 모델 멤브레인 시스템²⁵의 내재 막 기계적 특성과 관련된 전기 자극에 대한 막 수준의 물리적 반응으로 해석됩니다. 특히, 본 연구는 지질 이중층이 자극 후 지속적인 전도 이동과 정전 전하 저장을 통해 기본적인 전기 기억을 보일 수 있다는 기존 증거를 기반으로 합니다 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, 복잡한 세포 기전 없이 지질 이중층이 적응적이고 시냅스와 유사한 기능을 지원할 수 있는 메커니즘에 대한 새로운 통찰을 제공한다. 마지막으로, 이 방법론은 구조-기능 관계와 단순한 구조적 재조직에서 어떻게 거시적 행동이 발생하는지를 직접 검토할 수 있게 합니다 21,25,27.

Protocol

모든 유리기구와 준비 장비를 적절한 실험실 세제로 철저히 세척하고, 샘플 준비 전에 증류수로 헹구세요. 항상 안전안경을 착용하고, 오염을 방지하기 위해 니트릴 또는 라텍스 장갑을 착용하세요. 모든 화학 폐기물은 기관 안전 지침에 따라 처리해야 합니다. 휘발성 용매가 기관 안전 지침에 따라 적절히 보관되도록 하세요. 실험실 공간과 하드웨어(그림 1A), 실험 용기(그림 1B), 전기 및 광학 연결(그림 1C)이 장애물이 없고 방해물이 없도록 해야 합니다.

1. 수용성 완충액 제조

1. 원하는 최종 농도(예: 10 mM MOPS, 500 mL에 0.1 M KCl)를 얻기 위해 적절한 양의 3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산(MOPS)과 염화칼륨(KCl)을 계량합니다.
2. MOPS와 KCl을 500mL 용량의 액체 플라스크나 눈달 원통에 ~450mL 증류수에 넣고, 자기 교반봉으로 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
3. 보정된 pH 측정기로 pH를 측정하세요. 0.25 mL 단위로 1M 수산화칼륨(KOH) 또는 염산(HCl)을 계속 저으며 pH를 7.4로 조절하세요.
4. 전체 부피를 증류수와 함께 500mL로 모아 충분히 섞으세요. 완충제를 깨끗하고 라벨이 붙은 병으로 옮긴 후 밀봉한 후 4°C에서 보관합니다.
   참고: 완충 기간은 최대 ~2개월까지 사용하세요. 사용 전에 pH를 7.4로 다시 조정하고 확인하세요.

2. 그라마니시딘 스톡 용액 제제

1. 화학 훈기 후드에서 깨끗한 20mL 유리병에 5mg의 그라마시딘 A(gA)를 첨가합니다. 유리 또는 가스 밀봉 주사기로 메탄올 10mL를 추가한 뒤, 펩타이드가 완전히 용해될 때까지 보텍스(votex)합니다. 바이알에 'gA 스톡'이라고 라벨을 붙이고 -80 °C에서 보관하세요.
   참고: 앙상블 실험에서는 지질: 펩타이드 몰 비율을 ~1:^10-4로 사용합니다. 단일 채널 실험은 하부 펩타이드를 ~10–100배(1:^10-5–^10-6)로 사용하여 짧은 기록 시간(<1분) 내에 개별 사건을 분리합니다. 희석 스톡을 준비하면 낮은 몰 비율(< ~ 1:^10-4)에서 피페팅 정확도가 향상됩니다.
2. 먼지를 제거하기 위해 아르곤 가스가 담긴 깨끗한 20mL 유리병 두 개를 각각 ~5초간 퍼지하세요.
3. 깨끗한 가스 밀폐 주사기를 사용해 각 정화 바이알에 9.9mL의 메탄올을 투여합니다.
4. 멸균 가스 밀폐 주사기로 100 μL gA 스톡 용액을 한 바이알에 피펫팅하여 총 부피 10.0 mL를 얻습니다. 이 바이알을 "A"라고 라벨링하세요. 메탄올 농도 = 2.66 μM gA.
5. 두 번째 유리 바이알에 100 μL 용액 "A"를 피펫팅하여 총 부피 10.0 mL를 얻습니다. 이 바이알을 용액 "B"로 표시하세요. 메탄올 내 농도 = 26.6 nM gA.
6. 병은 뚜껑으로 밀봉하고 파라필름으로 감싸세요.
7. 모든 gA 용액은 -80°C에서 보관하다가 사용하세요.

3. 지질-펩타이드 소포의 준비

1. 깨끗한 20mL 유리병에 아르곤 가스를 담아 ~5초간 퍼레이시하세요.
2. 바이알에 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPhPC) 지질 4mg을 추가하세요.
3. 후드에서 유리 피펫을 사용해 1mL의 메탄올을 첨가합니다. 부드럽게 돌리거나 소용돌이치며 모든 지질이 녹을 때까지 반복하세요.
4. 500 μL 기밀 주사기를 사용하여 178 μL 용액 "A"를 추가하세요 (앙상블 레벨 STP 실험용; DPhPC:gA 몰라비 = 1:^10-4) 또는 890 μL 용액 "B"(단일 채널 실험 기준; DPhPC:gA 몰 비율 = 1:5×^10-6)를 DPhPC 메탄올 용액에 넣습니다. 부드럽게 소용돌이를 섞으세요.
5. 연기구 후드에서 부드러운 아르곤 기류 아래에서 메탄올을 증발시켜 바이알 바닥에 얇고 균일한 지질막이 형성되도록 합니다.
6. 열린 바이알을 40°C 진공 오븐에 넣고 10–12시간 또는 하룻밤 동안 완전히 진공 상태로 당겨 잔류 용매를 제거합니다.
7. 진공 오븐에서 바이알을 꺼내고 STP 실험을 위해 섹션 1에서 준비한 0.1 M KCl 버퍼 2mL를 추가하면, 최종 현탁 지질과 그라마티딘 농도가 각각 2.36 mM과 236 nM이 됩니다. 단일 채널 실험의 경우, 섹션 1에서 준비한 1 M KCl 버퍼 2 mL를 추가합니다. 지질 막을 재수화시키고 2 mg/mL의 지질 현탁액을 얻기 위해 소용돌이를 사용하여, 최종 현탁 내 지질과 그라마티딘 농도는 각각 2.36 mM과 11.8 nM이 됩니다.
8. 바이알을 -80°C에서 최소 6분간 냉동한 후, 40°C 뜨거운 판이나 물욕에서 6분간 해동하세요. 잠깐 보텍스를 섞어. 이 동결-해동 과정을 여섯 번 반복하여 다층 소포 형성을 촉진합니다.
9. 제조사의 지침에 따라 0.1 μm 기공 직경의 트랙 에칭 멤브레인으로 지질 소포 익스트루더를 조립합니다. 500 μL 버퍼를 익스트루더에 3번 통과시켜 멤브레인에 수화를 주고, 누수가 없는지 확인한 후 버퍼를 버립니다.
10. 녹인 지질-펩타이드 현탁액 1mL를 익스트루더에 주입하고 0.1 μm 막을 31회 통과시켜 ~100 nm 직경의 단층 소포를 얻고 크기의 균일성을 보장합니다.
11. 압출된 소포(대형 단층 소포, LUV)를 1mL PCR 튜브로 옮기고 라벨링하여 4 °C에서 보관합니다. 준비 후 2주 이내에 사용하세요.
12. 남아 있는 비압출된 지질-단백질 현탁액을 원래 바이알에 밀봉하고, 파라필름으로 감싼 후 -80 °C에서 보관하여 나중에 사용하세요.
13. 이전에 냉동된 비압출 샘플을 사용할 경우, 핫플레이트를 사용해 40°C에서 다시 녹이거나 시료를 실온으로 데운 후 압출합니다.

4. 아가로스 젤 제조

1. 깨끗한 50mL 유리 비커를 뜨거운 판 위에 올려놓으세요. 지질 막을 수화시키는 데 사용하는 동일한 완충제(예: 10 mM MOPS, 0.1 M KCl, pH 7.4)에 아가로스 정제 1개를 첨가하여 1% 아가로스 젤 용액을 만듭니다.
2. 깨끗한 테플론 저어버를 넣고 정제가 흩어질 때까지 세게 저어주세요.
3. 비커를 알루미늄 호일로 덮고 금속 주걱으로 작은 통풍구를 뚫으세요. 핫플레이트 온도를 220–230 °C로 설정하세요. 용액은 투명해지고 끓는 상태에 도달하여 아가로스가 완전히 용해되었음을 나타냅니다.
4. 불을 끄고 조심스럽게 호일을 제거하세요. 깨끗한 금속 주걱으로 표면 필름을 휩쓸어내세요. 뜨거운 아가로당 용액은 즉시 전극 코팅용으로 사용하거나, 나중에 사용하기 위해 비커에서 식혀 굳히도록 하세요.
5. 전극 아가로스 코팅 후, 굳은 아가로스를 호일로 덮고, 파라필름으로 밀봉한 후 라벨을 붙인 후 4 °C에서 보관합니다. 필요할 때는 끓기 시작하고 저어서 완전히 녹일 때까지 다시 가열하세요.

5. 전극 준비

1. 0.125mm 직경의 은선을 헤드스테이지 전극용으로 ~70mm 길이, 접지 전극용으로 ~130mm 길이로 절단합니다.
2. 개방불(예: 휴대용 라이터나 번젠 버너)을 사용하여, 각 은선 끝을 가장 뜨거운 중앙 원뿔에 수평으로 고정해 끝이 녹아 ~0.2mm 직경의 구형 공을 형성합니다(그림 2A).
3. 선을 깨끗한 표면에 놓고 현미경으로 볼이 구형이고 크기가 비슷한지 확인하세요. 공이 타원형이거나 불규칙하다면 끝을 잘라내고 다시 녹이는 과정을 반복하세요(5.2단계).
4. 두 은선 끝을 신선한 가정용 표백제(차아염소산나트륨, NaClO)가 담긴 유리 용기에 넣으세요. 공을 완전히 잠기게 하고 최소 1시간 배양하여 표면에 염소를 공급하고 Ag/AgCl을 형성하세요. 칙칙한 갈회색 외관은 성공적인 염소 처리를 확인시켜 줍니다(그림 2B).
5. 공 끝이 칙칙한 회색이 되면 표백제에서 와이어를 제거하고, 증류수로 깨끗하게 헹군 후 깨끗하고 보풀 없는 표면 위에 올려 말리세요.
6. 헤드스테이지 피펫 홀더 1개와 접지 전극 홀더 1개를 준비하세요. 유리 절단기를 사용해 100mm 붕규산 유리 모세관(외경 1.0mm, 내경 0.58mm)을 반으로 잘라내세요.
7. 헤드스테이지 피펫 홀더에 반모세관 하나를 삽입하고 홀더를 조여 고정하세요. 접지 전극 홀더에 100mm 모세관 전체를 장착하고 고정하세요.
8. 130mm 은선의 비볼 끝을 접지 전극 모세관에 삽입하여 볼 끝이 ~20mm 정도 돌출될 때까지 넣습니다. 선 반대쪽 끝을 홀더에 테이프로 붙이고, 접지 연결을 위해 ~5mm 정도 노출시키세요.
9. 다음 단계를 70mm 와이어로 헤드스테이지 전극에 연결해 와이어와 헤드스테이지 커넥터(금색 부품) 사이에 단단한 접촉을 보장합니다. 헤드스테이지 커넥터 쪽에서 남는 선은 모두 잘라내세요.
10. 각 염소 처리된 은공을 볼-샤프트 접합부 바로 위 아가로스에 담가서 얇고 균일한 코팅을 만듭니다. 최소 10번은 들락날락하세요.
11. 전극을 빼내고 아가로스를 실온에서 겔화시키세요. 필요하면 수십 마이크로미터 두께의 매끄럽고 고른 아가로스 껍질을 만들기 위해 반복 담근 작업을 하세요. 와이어에 너무 높거나 너무 낮은 코팅을 피하세요(그림 2C).
12. 헤드스테이지와 접지 전극을 마이크로매니퓰레이터에 장착하세요. 노출된 접지선(~5mm)을 악어 클립으로 앰프 접지에 연결하세요.
13. 핀셋을 사용해 볼 끝과 모세관 중간 지점에서 각 전극을 부드럽게 구부려 현미경 스테이지에 수직이 되도록 합니다. 현미경 시각 및 영상 촬영 시야에서 광학 왜곡을 최소화하기 위해 90° 이상의 굽힘은 피해야 합니다.
14. 홀더의 전극 방향을 조정하여 아가로스 코팅된 볼 끝이 현미경의 영상면에 수직이 되도록 합니다(그림 3A).

6. 액적 계면 이중층(DIB) 형성

1. 깨끗하고 바닥이 깨끗한 페트리 접시를 거꾸로 현미경 스테이지 위에 올려놓으세요. 접시에 알케인 오일(예: 100% 헥사데케인 또는 25%/75% v/v 도데케인/헥사데케인)을 ~ 5mm 깊이까지 채우세요(그림 1B).
2. 마이크로매니퓰레이터 컨트롤을 사용하여, 아가로스 코팅된 두 볼 끝을 오일 표면에서 ~2.5mm 깊이까지 오일 안에 내립니다. 마이크로매니퓰레이터의 빠른 움직임을 피하여 전극 볼헤드가 페트리 접시와 충돌하는 것을 방지하세요.
3. 현미경 초점을 조절하여 양쪽 볼 끝과 아가로스 코팅이 선명하게 초점을 맞추세요. 전극을 시야 가장자리 근처에 배치하여 두 전극을 동시에 관찰할 수 있게 합니다.
4. 보정된 2 μL 피펫을 사용해 압출된 지질-펩타이드 소포 현탁액을 주입합니다. 각 아가로스 코팅된 볼 끝에 별도의 피펫 팁을 사용해 천천히 250 nL의 현탁액을 직접 분사하며, 피펫 팁으로 아가로스 껍질에 닿지 않습니다.
   참고: 손 진동을 최소화하고 안정성을 높이기 위해 양쪽 팔꿈치를 진동 방지 테이블 선반에 고정하세요. 피펫팅하지 않는 손으로 피펫 손목을 안정시키고, 피펫을 천천히 오일에 담근 후 전극에 점차 다가갑니다. 방울 적재 시 짧은 숨 참기를 하면 의도치 않은 움직임을 더욱 줄일 수 있습니다.
5. 방울이 퍼져 아가로스 껍질을 덮고 중력에 의해 전극에서 떨어지도록 하세요. 피가 맑으면 페트리 접시 벽을 통해 옆으로 처지는 것을 관찰하세요(그림 3B).
   참고: 방울 처짐에 걸리는 시간은 소포 크기 분포, 온도, 아가로스 지형에 따라 달라집니다. DPhPC DIB는 방울 침착 후 최소 5분 후에¹⁵분을 기다리세요.
6. 진동 방지 테이블을 살짝 밀어 방울 준비 상태를 평가하세요. 처진 방울이 전극 움직임에 대해 약간의 지연을 가지고 움직이는지 확인하여, 완전히 코팅된 지질 단일층 방울이 형성되었음을 나타냅니다.
   참고: 지연 운동은 수성 방울 주위에 지질 단일층이 형성되어 표면 장력이 크게 낮아져 전극을 오일 내에서 이동시킬 때 물리적 반응이 지연되기 때문에 발생합니다.
7. 이 행동이 관찰되지 않으면 2–3분 더 기다렸다가 과정을 반복합니다.

7. 전기 설치 및 이중 계층 모니터링(시각 및 전기)

1. 현미경, 진동 방지 테이블, 패러데이 케이지, 그리고 증폭기, 디지타이저, 기능 발생기, 컴퓨터를 포함한 모든 전기 부품이 공통 접지에 연결되어 있는지 확인하세요(그림 1).
2. 제조사의 설치 가이드에 따라 기기 연결을 배치하세요. Figure 1C를 필수 전기 및 광학 구성의 회로 참조로 사용하세요. DIB 실험을 위한 접지³⁵, 하드웨어/소프트웨어 구성, 피펫 오프셋 조정에 관한 자세한 지침을 참고하세요.
   참고: 재료표에 나열된 모든 소프트웨어 및 하드웨어에 대해 장비별 설치 지침을 따르십시오.
3. 헤드스테이지와 접지 전극을 패치 클램프 앰프에 연결하세요.
4. 외부 함수 발생기(또는 획득 소프트웨어의 출력 채널)를 구성하여 10 Hz, 10 mV 삼각형 전압 파형을 생성합니다. 연결된 오실로스코프와 획득 소프트웨어 내에서 진폭과 주파수를 확인하세요.
5. 비방울이 ~ 10분 정도 떨어진 후, 마이크로매니퓰레이터를 사용해 두 비울을 부드럽게 접촉시키세요. 전극 위치를 조정하여 방울의 접촉 면적이 처음에^{직경의 ~} 1/4 이하로 유지되도록 하세요.
6. 10 Hz, 10 mV 삼각형 파형을 켜고 증폭기와 획득 소프트웨어로 정전 전류 응답을 모니터링하세요.
7. 전기적으로는 확장되는 피크 투 피크 커패시티브 전류 반응으로, 광학적으로는 이중층 접촉으로 인한 내부 반사(타원형 형태)가 증가하는 것으로 나타나는 자발적 이중층 형성을 기다립니다(그림 4). 순수 지질 이중층은 삼각형 전압 자극에 대해 직사각형 전류 평원을 보이는 반면, 지질이 ~1:^10-4 인 gA 도핑 이중층은 앙상블 이온 전도를 반영하는 경사진 평원을 보인다는 것을 확인한다.
8. 전극을 약간 움직여 액적 접촉 면적을 조절하면, C16 또는 C12/C16 오일 내 ~250 nL DIB에 대해 10Hz, 10 mV 삼각형 파형에 대한 피크 투 피크 정전 용량 전류 응답이 ~100–200 pA 사이로 되며, 정전용량 범위는 ~250–500 pF³³에 해당합니다.
   참고: 고주파 펄스나 0이 아닌 직류 유지 전압은 전기습윤과 과도한 이중층 팽창을 유도하여 방울 결합과 이중층 파열을 초래할 수 있습니다. 100–200 pA 범위는 이중층 안정성과 신호 대 잡음 비율 사이의 균형을 제공하여 자극 시 충분한 면적 확장을 허용합니다.
9. DIB가 응집되면 전극을 오일에서 들어 올려야 합니다. 지질 샘플과 아가로스 샘플에 사용된 것과 동일한 수용성 완충제로 전극 머리를 철저히 헹구세요.
10. 멸균 주사기로 페트리 접시의 수성 방울을 제거하세요. 필요하면 새 오일을 다시 채우고, 전극을 다시 잠기세요. 6절에 설명된 대로 LUV 용액을 전극에 다시 적재하고 과정을 반복합니다.
11. 안정적인 정전용량 또는 전도성 반응이 확인되면 삼각형 파형을 끄고 DIB가 최소 15분간 평형을 맞춘 후 자극 프로토콜을 적용하세요.

8. 전기 자극 프로토콜

1. 펄스 실험 (앙상블 STP 유사 및 LTP/LTD유사 반응)
   1. 함수 생성기나 획득 소프트웨어를 설정하여 원하는 진폭, 지속 시간, 펄스 간 간격(예: PPF[쌍 펄스 촉진] 및 PPD[쌍 펄스 감소] 패턴)을 전달합니다.
   2. 비디오 캡처 소프트웨어를 열어. 적절한 카메라 및 대물렌즈 설정을 선택하세요. 프레임 속도를 최소 20프레임/초로 설정하고 녹화 중에도 안정적인지 확인하세요.
   3. 데이터 수집 소프트웨어에서 현재 신호에 대해 샘플링 주파수를 최소 5kHz로 설정하세요.
   4. 새로운 프로토콜을 생성하려면 ' Acquire > New Protocol '을 클릭하거나, 기존 프로토콜을 수정하려면 Acquire > Edit Protocol 을 클릭하세요. 획득 모드 탭에서 에피소딕 자극을 선택하세요. 런/트라이얼을 1, 스윕/런 을 1로 설정하세요.
   5. 스윕 시간을 전체 실험 시간보다 4초 더 길게 설정하세요. 120초 STP 프로토콜(60초 PPF + 60초 PPD)의 경우, 스윕 시간을 124초로 설정하여 자극 전후 기준선으로 2초를 허용합니다.
   6. 입력 탭에서 녹음 채널을 현재 입력에 할당하세요. 출력 탭에서 자극 채널을 전극을 제어하는 전압 출력에 할당하세요.
   7. 파형 탭을 열어보세요. A열에서 Type을 Step, First Level을 0 mV, First Duration을 2000ms로 설정하여 자극 전 기준선을 정의합니다.
   8. 열(PPF)에서 Type을 Step으로 설정하세요. 원하는 전압 진폭(예: +100 mV), 펄스 지속 시간(예: 100 ms), 트레인 속도를 지정하여 목표 듀티 사이클에 해당하는 펄스 간 간격(예: 90.9%)을 설정합니다.
   9. C 열( PPD)에서는 타 입 을 스텝 으로 설정하여 같은 진폭과 펄스 지속 시간을 유지하되, 원하는 낮은 듀티 사이클(예: 28.6%)을 달성하기 위해 트레인 속도 또는 인터펄스 간격을 늘립니다.
   10. D열에서는 A열과 동일한 자극 후 기준선(0 mV, 2000ms)을 설정합니다.
       참고: Waveform 탭의 모든 에포크의 총 지속 시간이 Mode/Rate 탭의 스윕 지속 시간을 초과하면, 오류가 해결될 때까지 스윕 시간을 약간 늘려 주세요.
   11. 프로토콜을 설명 이름(예: "STP_120s")으로 저장하세요.
   12. 비디오 녹화를 시작한 후 즉시 빨간 원 "녹화" 버튼을 눌러 전기 수집/자극을 시작하세요. 또는 자극 시작 시 비디오 녹화와 전기 획득이 동시에 작동하도록 디지털 트리거를 구성할 수도 있습니다.
   13. 자극의 처음 60초 동안(PPF) 동안 측정된 전류 반응은 일반적으로 첫 펄스보다 증가하여 t = 60초 동안 가시적인 정체기에 도달할 수 있지만, 자극 후 60초(PPD)에서는 측정된 전류 반응이 일반적으로 감소합니다(그림 5). 프로토콜 종료 시에는 전기 획득과 비디오 녹화를 동시에 중지하세요.
2. 단일 채널 실험
   1. 패치 클램프 앰프 전면 패널에서 외부 명령 입력 스위치를 OFF로 설정하세요. 홀딩 전압을 +200 mV로 설정하세요. 앰프의 내장된 저역 통과 필터를 1 kHz로 설정하세요. 획득 소프트웨어에서 샘플링 속도를 10–50 kHz로 설정하고 연속적인 "간극 없는" 녹음 모드를 선택하세요.
      참고: 높은 샘플링 속도는 획득된 데이터의 신호 대 잡음비를 감소시킬 수 있습니다. 빠른 게이팅 전이나 단명한 깜박임 상태를 해석할 때 더 높은 샘플링 속도를 사용하는 것이 중요합니다. 그라미시딘 A의 평균 열린 수명은 일반적으로 0.1초에서 10초 범위이며, 깜빡임 상태는 서브-ms 및 μs 시간 척도에서 발생할 수 있습니다; 따라서^{이러한 사건을} 포착하기 위해 ~50 kHz의 샘플링 속도가 필요할 수 있습니다. 이후 JSMURF를 이용한 단일 채널 이상화 분석은 가변 신호 대 잡음비 녹음 전반에 걸쳐 견고한 이벤트 탐지를 가능하게^합니다.
   2. 외부 명령이 적용되지 않은 상태에서 기준 전류 신호 기록을 시작하세요. 앰프에서 전압 명령을 OFF에서 "+"로 전환하면 DIB에 +200 mV DC 전압이 가해집니다.
   3. 기준선 드리프트를 제한하면서 단일 채널 이벤트를 포착하기 위해 ~15초 동안 기록하세요. 지질:gA 몰 농도가 1:5×^10-6일 때_, 기록된 전류는 채널 전도도 게이팅 이벤트의 형성과 제거로 인해 단계적으로 나타납니다.
   4. 녹음을 멈추기 전에 전압 명령을 "+" 에서 다시 꺼짐으로 전환 하세요. 데이터 수집을 중단하고 녹화 파일을 설명 파일명(예: "DIB_C16_postPPF_200mV.abf")으로 저장하세요.
      참고: 정의된 지속 시간의 단일 채널 녹화는 PPF/PPD에 대해 8절에 설명된 고정된 진폭과 지속 시간의 프로그램된 에피소딕 자극을 통해서도 수행할 수 있습니다. "포스트-PPF" 단일 채널 실험에서는 60초 PPF 직후 +200 mV DC 전압을 이용한 에피소딕 자극 이 피기백 방식으로 진행됩니다.

9. 막 면적과 플럭스 외삽

1. 각 앙상블 실험(STP, LTP/LTD)이 끝날 때, 마이크로매니퓰레이터로 한 전극을 천천히 옆으로 움직여 DIB를 분리합니다.
2. 마이크로매니퓰레이터 전극 홀더를 느슨하게 하고, 홀더 안에서 전극을 ~45° 회전시켜 125 μm 은선이 영상면에 위치하도록 합니다.
3. 전극 높이를 현미경 아래에서 선명하게 볼 때까지 조절하세요. 카메라 소프트웨어로 초점이 맞춰진 은색 전선의 정지 이미지나 스크린샷을 캡처하세요. 픽셀 크기를 밀리미터 단위로 보정할 때 나중에 스케일 이미지를 저장하세요.
4. 참고문헌 28에 명시된 절차에 따라 기록된 전류 흐름을 처리하여 연속적이고 아티팩트 없는 전류 대비 데이터를 얻습니다(그림 6A).
5. 프레임 인덱스를 측정된 프레임 속도로 나누고 획득 타임스탬프와 일치시켜 프레임-시간 매핑을 결정합니다.
6. 스케일 보정 이미지와 실험 프레임을 이미지 분석 소프트웨어로 가져오세요.
7. 스케일 보정 이미지에서 알려진 와이어 직경(125 μm)을 사용해 소프트웨어 보정 기능(Analyze > Set Scale)을 사용해 공간 스케일을 설정하세요.
8. 각 실험의 플럭스 계산을 위해 전체 자극 주기를 포함하는 N개의 시간점을 선택하세요(예: 120초 실험 동안 30개의 시간점). 첫 번째 시점이 첫 자극 펄스와 일치하는지 확인하세요.
9. 각 시점에서 DIB 직경을 측정하여 이중층 모서리 교차점을 가로지르는 선을 그고 길이를 보정된 단위로 기록합니다.
10. 측정된 각 직경을 원형 기하학을 가정하거나 특정 지질-기름 구성에 맞는 타원 기하학적 축소 인자를 사용하여 막 면적(A)으로 변환합니다. 결과 영역을 사용하여 다양한 실험 조건에 따른 막 면적 변화를 평가합니다(그림 6B).
11. 각 시점마다 해당 현재 값을 면적로 나누어 플럭스(I/A)를 얻습니다. 모든 N개의 플럭스 데이터 포인트를 첫 번째 플럭스 값으로 나누어 정규화된 플럭스 분석을 원할 때 첫 번째 펄스 (I/A) / (I₀/A₀)에 정규화된 플럭스를 얻습니다(그림 6C).
12. 플럭스 또는 정규화된 플럭스 대 시간, 또는 펄스 수와 시간을 그래프로 표시하세요. 모든 앙상블 실험(STP, LTP/LTD)에 대한 반복 플럭스 분석(그림 6D).
13. PPD 중 첫 펄스 대비 2분 이상 지속된 플럭스 상승 또는 정규화 플럭스는 전도 강화로 해석하며, 기준선으로 돌아오거나 첫 번째 펄스 값 이하로 감소하면 전도 억제를 나타냅니다. 결과 시간 척도를 이용해 반응을 단기적 가소성 유사 행동(<2분) 또는 장기 강화/우울과 유사한 행동(> ~5분)으로 분류하세요.

10. 단일 채널 분석

1. 원시 단일 채널 녹음을 선호하는 분석 환경이나 clampSeg 인터페이스로 가져오고, 소프트웨어 기능에 대한 완전한 설명과 설명은³⁷ 을 참고하세요.
2. 실험적 획득 필터(예: 1 kHz 베셀)와 일치하는 디지털 저역 통과 필터를 적용합니다.
3. 매개변수 구성.
   1. 알파 (α) = 0.05를 설정하며, 각 감지된 단계가 무작위 잡음 변동일 확률이 <5%가 되도록 통계적 신뢰 수준을 정의합니다.
   2. 노이즈 분포를 추정하고 이벤트 탐지의 통계적 견고성을 높이기 위해 1초 구간당 5,000-10,000회의 몬테카를로 반복을 지정하세요.
      참고: 분석 시간을 줄이기 위해 가능하다면 1 '청크' 단위의 병렬 계산 처리를 사용하세요.
   3. 필터링된 전류 트레이스에 대해 JSMURF 알고리즘을 실행하세요.
4. 모델 검증.
   1. 이상화된 (사각파) 전도 트레이스를 필터링된 전류 트레이스 위에 겹쳐 보고, 스텝 전이가 실험 신호의 급격한 변화와 일치하는지 시각적으로 확인합니다.
   2. 알려진 저역 통과 필터 특성을 사용하여 이상화된 트레이스의 합성 재구성을 생성하고, 원시 트레이스³⁷ 위에 겹쳐 보입니다. 재구성된 신호가 기록된 전류의 타이밍과 진폭 범위와 매우 일치하는지 확인하세요.
5. 전도도와 수명의 정량화.
   1. 이상화된 트레이스에서 가장 낮은 안정 고원을 닫힌 기준선 상태로 정의합니다. 첫 번째 0이 아닌 고원 진폭을 1차 개방 상태 전도도(단일 채널 레벨)로 식별합니다.
   2. 이 진폭의 더 큰 정수 배수를 다중 채널 열린 상태(2+, 3+ 등)로 분류합니다. 완전 개방 준위보다 낮은 안정적이지만 중간 고원을 서브전도성 상태로 식별합니다.
   3. 이상화된 트레이스에서 각 이벤트의 진폭과 지속 시간을 추출하여 전도도 진폭 히스토그램과 평생 히스토그램을 생성합니다.
6. 진폭 히스토그램과 생애 분포
   1. 이상화된 전도도 진폭 히스토그램과 필터링된 데이터에서 직접 생성된 진폭 히스토그램을 비교해 보십시오. 이상화된 히스토그램이 이산적인 전도 상태³⁷에 해당하는 더 선명하고 더 잘 분리된 피크를 보여준다는 것을 확인한다.
   2. 각 실험 조건에 대해 생존 함수 N(t)/N(0)을 계산하는데, 여기서 N(0)은 열린 사건(완전 및 서브컨덕턴스)의 총 수이고 N(t)는 t보다 긴 지속 시간을 가진 사건의 수입니다. 이 분석에서 폐쇄 상태 구간은 제외합니다.
   3. 비선형 최소제곱법 루틴을 사용하는 N(t)/N(0) 대 시간 및 적합 지수 감쇠 함수를 선호하는 소프트웨어에서 그래프 작성.
   4. 진폭 히스토그램에서 전도도 분포의 우측 이동 피크를 전도 증가로 해석하고, N(t)/N(0) 대 시간 플롯의 더 긴 붕괴 시간 상수를 열린 상태 안정성 증가로, 좌측 이동 분포를 더 짧은 채널 수명으로 해석합니다.
      참고: 공기 흐름, 진동, 주변의 움직이는 물체와 같은 환경 교란을 최소화하세요. 안경 테이블에 기대지 말고 실험 장비에 대한 대화를 피하세요. 휴대전화, 태블릿, 노트북 및 기타 개인 전자기기는 파라데이 케이지에서 최소 1.5m 이상 떨어져 전자기 간섭을 줄이도록 하세요. 광학 투명한 오일 저장소를 사용하고, 현미경 조명과 대비를 최적화하여 물방울과 이중층의 가장자리를 선명하게 만드세요. 경계 대비가 개선되고 DIB 직경의 수동 측정이 간소화된다면 그레이스케일로 영상을 획득하거나 내보내세요. 온도 영향을 조사하지 않는 실험의 경우, 실험실 환경, 현미경 스탠드, 오일을 21–22 °C 유지해야 합니다.

Results

DIB 실험 장비
녹화 시스템은 진동 방지 테이블 위의 패러데이 케이지 안에 보관되며, 전기 및 비디오 데이터는 두 대의 별도 컴퓨터에서 수집됩니다(그림 1A). 분할 화면 기능이 있는 단일 컴퓨터도 사용할 수 있습니다. DIB 시료 환경은 정의된 알케인 오일 부피에 잠긴 두 개의 아가로스 코팅 전극으로 구성됩니다(그림 1B). 그림 1C 이 원고에서 설명한 실험 장치에 필수적인 전기 및 광적 연결의 회로도를 보여줍니다.

그림 1: 실험 장비. (A) 진동 방지 테이블과 주요 부품인 파라데이 케이지 인클로저(증폭기, 디지타이저, 노이즈 필터, 함수 발생기, 전기 및 비디오 획득용 듀얼 컴퓨터 인터페이스 포함)가 표시됨. (B) DIB 샘플 환경과 전극의 전면 상단 모습. (C) 이 원고에 설명된 실험 장비와 관련된 전기 및 광적 연결 회로도. 모든 개별 부품은 실험실 건물 내에서 공통 접지에 사용됩니다. 모든 실험은 상온(21–22°C)에서 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

농업/농융 전극의 준비 및 품질 관리
은선 끝을 녹이면 구형의 공이 형성됩니다(그림 2A); 품질이 낮은 용융물은 타원형이거나 불규칙하게 보입니다. 표백제 내 염소 처리는 칙칙한 갈색 회색 Ag/AgCl 표면을 생성합니다(그림 2B). 볼에 수십 마이크로미터 두께의 얇고 균일한 아가로스 코팅은 안정적인 방울 지지와 저임피던스 전기화학 결합에 필수적이며, 불균일한 코팅은 방울 부착이 불안정하게 작용합니다(그림 2C).

그림 2: 전극 준비. (A) 양질 및 저품질 전극 용융물의 현미경 이미지. (B) 비염소 및 염소 전극 헤드 비교. (C) 품질 좋은 아가로스 코팅과 저품질 코팅의 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 전극 구성. (A) 장착된 전극 각도 정렬의 상단 모습. (B) LUV 하중직 직후 비처진 방울과 단일층 형성 후 처지는 방울을 비교한 측면 모습. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

전극 위치 및 방울 처짐 현상
탑다운 뷰는 광학적 왜곡을 최소화하기 위해 전극의 적절한 각도 위치를 보여줍니다(그림 3A). 측면 모습은 LUV 용액 로딩 직후의 비처진 방울과 5분 후의 처진 지질 코팅 방울을 비교한다(그림 3B). DIB를 형성하는 데 사용되는 처진 방울은 지질 단일층의 표면 장력이 현저히 감소하여 움직임에 대한 물리적 반응이 지연되어, 지질 단일층으로 완전히 코팅된 현수된 수성 방울의 형성을 시각적으로 확인한다. 처짐이 형성된 후에는 삼각파 자극을 사용하여 이중층 형성과 안정성을 전기적으로 확인한다³⁵.

그림 4: 방울 계면 이중층 형성. (A) 방울 접촉 후 이중층 형성과 팽창을 보여주는 타임랩스 시퀀스. (B) 이중층 직경과 면적 추정에 사용되는 내부 막 반사. DIB 이미징은 장비 아래에서 역현미경을 통해 수행됩니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

DIB 형성 및 면적 측정
순차적인 이미지는 두 처진 방울이 접촉할 때 자발적인 이중층 '지퍼'와 면적 확장을 포착합니다(그림 4A). 방울 접촉부의 밝고 내부 타원형 반사는 이중층 직경과 확장하여 시간에 따른 막 면적을 추정하는 데 사용됩니다(그림 4B).

그림 5: STP 프로토콜—자극과 반응. 쌍 펄스 촉진(PPF, 0–60초, 빨간색)과 쌍 펄스 억제(PPD, 60–120초, 파란색) 동안의 대표적인 현재 반응과 해당 자극 프로토콜(하단)이 표시되어 있습니다(상단). PPF와 PPD 펄스는 각각 100ms의 지속 시간과 250ms의 OFF 시간을 가지며, 90.9%와 28.6%의 듀티 사이클을 제공합니다. 촉진은 이온 전류의 순증가에 해당하며; 우울은 순감소에 해당합니다. 현재 응답은 ON 기간 동안에만 기록되며; 시각화를 위해 펄스 간 데이터를 보간하여 전류의 전반적인 추세를 강조합니다. PPF 및 PPD 위상 내 펄스 회로 시간 길이와 펄스 수는 축척으로 그려지지 않으며 시각화 목적으로 그림으로 제공됩니다. 대표적인 현재 반응 데이터는 Podar PT 등, ²⁵에서 CC BY-NC-ND 4.0에 따라 재현되었습니다. 저작권 © 2025 저자(들) PNAS 출판. 자극 도식은 본 원고에 맞게 수정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

단기 가소성 유사 행동(STP 유사)을 유도하기 위한 전기 자극 프로토콜
여기서 언급된 자극 패턴은 신경과학 용어에 비유하여 쌍펄스 촉진(PPF)과 우울증(PPD)을 나타내며, Koner와 Najem^28,29와 유사하다. 쌍 펄스 촉진(PPF; 0–60초)과 쌍 펄스 감소(PPD; 60–120초)는 각각 100ms 펄스와 250ms의 OFF 시간을 가진 펄스를 사용하여 전달되며, PPF는 90.9%, PPD는 28.6%의 듀티 사이클에 해당합니다. 상단 패널은 ON 기간 동안의 대표적인 현재 반응을 보여주고, 하단 패널은 자극 패턴을 보여줍니다.

STP 및 이후 장기 자극 중 전류, 면적, 이온 플럭스
C16 및 C12/C16 오일 내 gA 도핑 DPhPC 이중층의 정규화 전류(I/I₀)는 PPF 및 PPD 동안 나타난다(그림 6A). 30개 시점에서 측정된 정규화된 막면적(A/A₀)은 전류가 다르음에도 불구하고 두 오일 조건에서 유사한 면적 변화를 보여줍니다(그림 6B). 정규화된 전류와 면적은 각각 28개의 독립 DIB에 걸쳐 평균 ± S.D. 구름과 막대로 표현되어 있습니다. 정규화된 플럭스(J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)는 면적에 따라 무관한 전도 변화를 분리하며, 단순 면적 확장을 넘어 막 전도 변화와 일치합니다(그림 6C). 그러나 이러한 변화는 단일 채널 전도도와 활성 전도 채널 수 모두에 기여했을 수 있습니다. 최대 30분간 장기간 PPD 자극을 하면 C16 막에서 장기 억제 유사(LTD) 행동이 나타나지만, C12/C16 막에서는 LTP 유사 행동과 일치하는 상승된 플럭스를 유지합니다(그림 6D). 이 데이터를 종합해 보면, 막 조성이 이온 플럭스의 단기 및 장기 가소성 유사 변화를 모두 조절한다는 것을 알 수 있습니다.

그림 6: C16(주황색) 및 C12/C16(파란색) 오일 내 gA 도핑 DPhPC 막의 STP 및 LTP/LTD로의 전이 과정에서 DIB의 전류, 면적 및 계산된 이온 플럭스. (A) p2 도핑 DPhPC 막의 PPF(0–60초, 흰색 배경)와 PPD(60–120초, 회색 배경) 동안 정규화된 전류(I/I₀)는 각 조건에 n=28개의 독립적으로 형성된 DIB로 구성됩니다. (B) 30개 시점에서 측정된 정규화된 막 면적(A/A₀), 현재 반응이 달라도 면적 궤적이 유사함; 데이터는 동일한 n=28개의 독립 DIB에 대해 동일한 n± S.D.의 평균으로 표시됩니다. (C) 정규화된 플럭스, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀))는 해당 전류와 면적 측정값을 기반으로 계산되며, 면적 효과를 넘어선 전도 변화를 강조합니다. (D) 장기간 PPD 자극 하에서의 장기 행동: 초기 120초 STP(회색 음영) 후 DIB는 ON = 100 ms, OFF = 250 ms (빨강/녹색 고정) 또는 30초(주황/회색) 펄스를 가진 30분 PPD를 받았습니다. C16 막에서는 플럭스가 기준선 이하로 감소하여 LTD 유사 행동을 나타내지만, C12/C16 막에서는 여전히 상승하여 지속적인 LTP 유사 행동을 나타냅니다. 음영 처리된 영역은 I/I₀와 A/A₀에서 전파된 오차를 나타냅니다. (D)의 확장 PPD 데이터셋은 120초 프로토콜에서 오일 조건당 n=6개의 독립 DIB를 얻었고, 이어서 확장 PPD 조건마다 3개의 DIB가 이어졌습니다. 모든 데이터 포인트는 시각화 목적으로만 연결되어 있습니다. 패널 A, B, D는 CC BY-NC-ND 4.0에 따라 재현되었습니다. 저작권 © 2025 저자(들) PNAS 출판. 패널 C는 Podar PT 외, ²⁵에 보고된 데이터를 바탕으로 본 원고를 위해 새로 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

PPF 자극 후 C16 오일에서 형성된 gA 도핑 DIB에서 나온 대표적인 15 s 단일 채널 전류 추적
트레이스에는 1 kHz 저역 통과 필터, 250 Hz 8폴 베셀 필터링 트레이스, 그리고 이상화된 JSMURF 적합을 사용하여 50 kHz에서 캡처한 원시 신호가 포함됩니다. 가장 낮은 안정 수준이 닫힌 상태를 정의하며, 더 높은 수준은 단일 채널, 다중 채널, 서브컨덕턴스 이벤트에 해당합니다. 이 트레이스는 전도 진폭과 수명 분석의 기초가 됩니다. 예시로 표시된 전도-상태 체류 시간은 특정 전도 수준의 지속 시간을 나타내며, 그 진폭과 지속 시간은 여러 개의 동시 완전 및/또는 아전도 사건의 결합 기여를 반영합니다.

전도도 진폭과 수명 분포
C16 및 C12/C16 막의 전도 진폭 히스토그램(그림 7A–B)은 PPF 전후 상태를 DPhPC:gA 몰 비율 1:5×^10-6에서 비교합니다. 데이터 아래의 가우시안 근사는 PPF 이후 평균 전도 피크의 이동을 나타내며, 서브컨덕턴스 및 다중 채널 상태에 해당하는 별도의 피크를 해석합니다. 전도 분포의 통계적 비교는 웰치 t-검정과 Mann-Whitney U-검정(α = 0.05)을 사용하여 통합 이벤트 수준 데이터를 대상으로 수행되었으며, 각 조건은 3개의 독립적인 DIB 기록으로 구성되었고, N은 해당 기록 전체에 걸쳐 검출된 사건 수를 나타내는 n으로 구성되었습니다. 수명 확률 분포인 N(t)/N(0), 전후(그림 7C–D)는 C12/C16 막이 더 긴 꼬리 전도 분포와 C16에 비해 수명 변화를 형성하여 채널 안정성 변화를 나타냅니다. 히스토그램 데이터는 각 조건에 대해 획득한 필터링된 15초 추적(빨간 추적)을 대표합니다. 전도도 상태 수명 분포는 각 조건별로 3개의 독립적인 DIB 기록에서 생성되었으며; 점선은 개별 복제를 나타내고, 실선 곡선은 N(t) / N(0) 대 t에 대한 전역 지수 적합을 나타냅니다.

그림 7: 전도도 진폭 히스토그램과 전도-상태 유지 시간 분포. (A) C16 및 (B) C12/C16 막의 gA 활성에 대한 전도도 진폭 히스토그램은 PPF 전(회색)과 PPF 후(주황/파랑) 상태를 5 × 10-6 gA:지질 몰 비율에서 비교합니다. 히스토그램 아래의 가우시안 근사는 단일 및 다중 채널 상태의 평균 전도 피크와 표준편차의 이동을 나타냅니다. PPF 이후 평균 전도도의 변화는 점선(검은색 = PPF 전, 파랑/주황색 = PPF 이후)과 화살표로 표시됩니다. 각 조건은 3개의 독립적인 DIB 녹음을 나타냅니다. 전도도 분포의 통계적 비교는 웰치 t-검정과 Mann-Whitney U-검정(α = 0.05)을 사용하여 통합 이벤트 수준 데이터에 대해 수행되었으며, 여기서 N은 해당 세 기록에 걸쳐 검출된 사건의 총수를 나타냅니다. 분석에는 서브컨덕턴스 이벤트도 포함되었으며, 각 막 상태별 첫 번째 개방 상태 피크 왼쪽에 대표적인 서브컨덕턴스 분포가 표시되었습니다. 5×^10-6 M gA:지질에서의 C16 (C) 및 C12/C16 (D) 막에서 PPF 자극 전후(주황색/파란색) 및 후(짙은 주황색/짙은 파란색) 전도성 상태 사건의 평생 확률 분포는 그림 7A–B에 나타난 전도도 분석과 일치 합니다 . 여기서 N(t)는 시간 t보다 긴 지속 시간을 가진 완전 및 서브컨덕턴스 사건의 누적 수를 나타냅니다. 점선은 개별 복제의 수명 분포(조건당 n = 3개의 독립 DIB)를 나타내며, 실선 삽입은 비선형 곡선 적합 소프트웨어를 사용해 수행한 전역 지수 적합을 나타냅니다. 패널 A–D는 Podar PT 외, ²⁵에서 재현되어 CC BY-NC-ND 4.0에 따라 본 원고를 위해 편집되었다. 저작권 © 2025 저자(들) PNAS 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: PPF 자극 후 C16 내 DIB의 단일 채널 탐침 행동—현재 반응 추적. (A) 원시 데이터를 보여주는 15초 전류 트레이스(파란색), 250Hz 8극 베셀 저역 통과 필터(빨간색)로 필터링된 경우, 그리고 전도 상태를 식별하는 데 사용되는 이상화된 트레이스(녹색)입니다. 가장 낮은 안정 수준이 기준선의 "닫힌" 상태를 정의합니다. (B) 2^차 및 3^차 전도 수준 사이에 감지된 대표적인 하위 전도도 수준, 진폭 히스토그램에서 뚜렷한 중간 봉우리로 확인됨(그림 7A, 주황색 참조). 전도도 체류 시간은 각 식별된 전도 준위(닫힌 상태 제외)의 지속 시간에서 추출하여 N(t)/N(0) 수명 분포를 산출합니다. Podar PT 외, CC BY-NC-ND 4.0 ²⁵에서 인용됨. 저작권 © 2025 저자(들) PNAS 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

PPF 이후, C12/C16 막은 전도 진폭 분포가 뚜렷하게 우측으로 이동하여 단일 채널 전도도 증가를 나타내고, 전도도 상태 수명 분포가 왼쪽으로 이동하는 것을 보이며, 이는 채널 개방 시간이 짧아진 것과 일치합니다. 이러한 변화는 PPF 과정에서 C12/C16 이중층의 전기기계적 희석과 일치하며, 참고문헌 25에 보고된 직접적인 기계적 및 두께 측정에 의해 뒷받침됩니다. 이는 gA를 통한 이온 수송의 에너지 장벽을 낮추고 개방당 이온 처리량을 증가시키면서 채널 안정성을 감소시킵니다. 반면, C16 막은 어느 분포에서도 변화가 거의 없어 구조적 적응력이 제한적임을 보여줍니다. 이 결과들을 종합하여 DIB 플랫폼이 막 조성 의존적 역학에서 발생하는 이온 전도 변화를 포함한 막 전기기계적 적응의 앙상블 및 단일 채널 상관관계를 모두 포착함을 보여줍니다(그림 8).

Discussion

실질적으로 이 방법은 지질 조성과 유상을 통한 이중층 조성 변화의 조절 가능, 막 재구조화의 광학 및 전기적 동시 모니터링, 그리고 단일 채널 전기생리학과 중규모 막 역학을 연결하는 막 영역 영역 접근을 제공하는 세 가지 핵심 실험적 능력을 제공합니다 14,15,20,21,25. 이러한 특징들은 이 방법을 단순화된 막 시스템에서 구조-기능 연구에 특히 유용하게 만듭니다. 여기서 완전한 세포 복잡성보다는 막 전기역학이 실험적 관점인 14,15,20,21,25,39.

이 프로토콜은 알케인 오일 내 그라마시딘 A 도핑 DIB를 조립하고 분석하여 생리학적으로 관련된 전기 자극 14,15,25,35,38 하에서 지질막이 재구조화하는 능력을 조사하는 과정을 설명합니다. 패치 클램프 기법²¹과 비교하면, DIB 플랫폼은 이산 이온 채널 이벤트를 포착할 수 있는 해상도를 유지하면서도 14,15,19,20,21,28,38을 포착할 수 있는 충분한 해상도를 유지하면서도 훨씬 큰 막 패치를 조사합니다. 이 능력은 중규모 전기기계적 재형성(예: 전기습윤 및 전기압축)을 해명하고, 생리학적으로 영감을 받은 자극 하에서 STP, LTP, LTD 유사 막 전도도 표현형을 생성하는 미세한 채널 거동과 연계하는 데 특히 가치가 있습니다 ^13,25,27,38. 현재의 DIB 시스템은 생물학적 시냅스 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11의 분자 복잡성을 재현하기 위해 설계되었습니다.. 따라서 STP, LTP, LTD, PPF, PPD와 같은 용어는 정의된 자극 프로토콜 하에서 단기 및 장기 시간 척도의 증감을 설명적이고 유추 기반으로 사용한다. 따라서 이 연구의 주요 발견은 DIB에서의 막 전기역학, 전도도 적응, 조성 의존적 비평형 재구조화 측면에서 가장 직접적으로 해석되며, 이는 신경 회로나 생화학적 시냅스 조절과 기전적 동등성을 의미하지 않으면서도 시냅스 가소성에 대한 유용한 개념적 유사성과 물리적 관점을 제공할 수 있다 10,11,25,38.

재현 가능한 결과를 얻기 위해서는 여러 기술적 단계가 매우 중요합니다. Ag/AgCl 전극의 신중한 준비, 즉 은 구형 끝의 균일한 녹임, 철저한 염소 처리, 얇고 고르게 아가로스 코팅을 통해 안정적인 방울 부착과 저임피던스 전기화학 결합을 보장합니다^20,35. 방울 처짐의 시각적 확인과 올바른 전극 방향은 비디오 녹화 중 광학 왜곡을 최소화하고 막 면적 측정의 정확도를 향상시킵니다. 획득 후 스케일 보정은 알려진 은선 직경을 사용하여 견고한 픽셀-mm 변환을 제공하며, 이는 막 면적과 이온 플럭스의 신뢰성 높은 계산에 필수적입니다. 이 연구에서 막 전도도(플럭스)는 단위면적당 전류(I/A)로 정의되며, 전기습윤 중 DIB 면적이 변하기 때문에 정확한 플럭스 정량화를 위해서는 시간 매칭 전류와 이중층 면적^{측정값 13, 25, 27, 35}가 필요합니다.

이 방식은 동일한 플랫폼 내에서^{14, 15, 20, 25, 35, 38} 등 상호 보완적인 앙상블 레벨 및 단일 채널 읽기도 지원합니다. 앙상블 수준에서는 동기화된 비디오 및 전기 기록이 면적(전기습윤)과 전류의 동적 변화를 정량화하며, 이로부터 이온 플럭스(전류/면적)가 도출됩니다. 전기 자극 하에서 막은 비평형 정상 상태(NESS)로 전환되며, 조성 의존적 막 재구조화가 단기 소성 유사 반응을 생성하고, 이는 장기간에 걸쳐 증강 유사 또는 억제 유사 행동으로 진화할 수 있습니다 (min)25,26,28,29,30,31,32,^{33, 38}. 단일 채널 수준에서는 전류 트레이스를 단계별 전도도 수준(닫힌 상태, 단일 채널, 다중 채널, 서브컨덕턴스 상태)으로 이상화하는 분석이 포함됩니다. 전통적인 정사파 이상화 도구는 일반적으로 제한된 수의 이산 레벨만 해석합니다; 더 복잡하거나 노이즈가 많은 데이터의 경우, JSMURF와 같은 모델이 없는 이상화^{방법이 선호됩니다}. JSMURF로 분석한 짧은 DC 유지 전위는 이질적 잡음 하에서도 통계적으로 엄밀한 사건 검출을 제공하며, 전도도 진폭 히스토그램(정수 및 부분전도 수준)과 N(t)/N(0) 수명 분포를 산출합니다. 이상화 및 필터링된 진폭 히스토그램을 겹치면 전도도 상태 할당의 시각적·정량적 교차 검증이 가능하며, 컨볼브드 재구성(알려진 저역 통과 필터를 통과한 이상화된 트레이스)은 매개변수 선택과 이벤트 충실도를 확인합니다³⁷.

여기서 주변 오일 상을 통해 조율된 막 조성(예: C16 대 C12/C16)은 전기 자극 하에서 이중층 점탄성과 재구조화 능력을 조절할 것으로 예상되며, 이는 이전 연구^{22, 25, 39}에서 보고된 직접 측정과 일치합니다. 더 순응하는 막은 PPF 22,23,25 동안 더 큰 EC 기반 얇아짐과 gA와의 소수성 매칭 개선을 보이며, 이는 단일 채널 전도도와 촉진 증가를 이끌어 LTP 유사 행동으로 안정화될 수 있습니다^25,38. 반대로 단단한 막은 구조적 반응성이 제한적이며, PPF와 PPD 동안 전도도 변화가 작고, 장시간 맥박 시 LTD 경향이 있습니다. 이러한 조성 의존적 결과는 물질 특성이 막을 명확하고 기능적으로 관련된 장기 체계로 유도한다는 점을 강조합니다 ^22,23,25,39.

DIB 플랫폼에는 중요한 제한 사항도 있습니다²¹. 여기서 제시된 기계론적 해석은 오일 조성의 차이가 이중층 재료의 특성과 전기기계적 재구조화에 대한 감수성을 변화시키며, 이는 다시 그라마키딘 A 전도도를 22,23,25로 변조한다는 것입니다. 이 해석은 이전 연구에서 지지되는데, 이 연구는 막 점탄성, 전면 장력, 그리고 이러한 막 조건과 자극 하에서의 동적 막 두께 변화를 직접 측정^{했습니다.} 그러나 본 연구에서는 이러한 재료 특성이 각 실험에서 동시에 측정되지 않아, 데이터의 기계적 해석을 독립적으로 확립하기보다는 C16 및 C12/C16 환경에서 막의 전기 자극에 대한 구조적·기계적 반응의 차이를 지원하는 데 사용된다. 또한 앙상블 전류와 플럭스는 단일 채널 전도도 변화와 전도 채널 수의 변화를 모두 반영할 수 있으며, 이는 비평형 조건에서 막 면적, 펩타이드 확산, 이합체화에 따라 달라질 수 있습니다.^{17, 18, 22, 23}. 주변 오일 상은 자극 시 동적으로 이중층 코어에서 침투하거나 후퇴할 수 있으며, 이는 단일 채널 기록에서 기준선 드리프트와 시간이 지남에 따른 막 조성 변화에 기여합니다 13,21,25. 이 요인들은 정적 막 특성을 정의하기 위한 장기 일정 전압 기록 사용을 제한하며, DIB가 닫힌 평형 막이 아닌 개방적이고 동적인 시스템으로 동작함을 강조합니다 13,21,25. 따라서 현재 프로토콜은 의도된 실험 시간 척도(^25,38)에서 자극 의존적이고 가소성 유사 전도 변화를 포착하지만, 향후 직접적인 기계적 측정과 동시 전기적·광학 기록을 결합하고, 형광 기반 단일 분자 영상과 병행하여 막 재구조화, 채널 전도도, 채널 개체군의 기여를 보다 완전하게 해결하기 위해 필요할 것입니다^{21, 25}.

일반적인 실패 모드로는 불안정한 물방울 부착, 불완전한 물방울 처짐, 이중층 형성 중 조기 비말 응집, 면적 분석 중 이중층 가장자리의 불완전한 광학 정의 등이 있습니다. 불안정한 방울 부착은 종종 불규칙한 은공 형상이나 고르지 않은 아가로스 코팅에 의해 발생하며, 공 대칭성을 확인하고 매끄러운 아가로스 껍질을 유지함으로써 줄일 수 있습니다. 전극 부하는 또한 나노리터 크기의 수성 방울을 서브밀리미터 전극 헤드에 수동으로 증착해야 하며, 이는 서로 다른 굴절률(공기 대 기름)을 가진 매질에서 상당한 손과 눈의 협응력과 깊이 인식을 요구합니다. 그 결과 피펫 팁이 의도치 않게 아가로스 껍질에 닿거나 전극 헤드를 놓칠 수 있습니다. 손목 보강, 오일 내 피펫 천천히 전진, 숨 참기 같은 안정성 향상 기법과 반복적인 연습이 로딩 숙련도를 향상시킬 수 있습니다. 더불어, 불완전한 처짐 또는 단일층 형성 지연은 소포 이질성, 온도 변화 또는 아가로스 지형학 등으로 인해 발생할 수 있으며,^{15, 20, 35} 방울 침착 후 대기 시간을 늘려 개선될 수 있습니다. 이중층 형성 중 응집은 과도한 접촉 면적이나 과도한 전기 자극(> ± 200 mV)과 관련이 있으며, 초기 액적 접촉 면적을 줄여 단층 안정화를 위한 추가 시간을 확보하고,^25,35,38 펄스하기 전에 저진폭 삼각파 정전 용량 응답을 검증함으로써 완화할 수 있습니다.

이러한 제약에도 불구하고, DIB 플랫폼은 14,15,20,21,25,35,38,40을 매우 조정 가능하고 확장 가능하며 재현 가능하며, 지질 역학이 전도 22,23,25에 기여하는 것을 분리하여 단백질 중심 전기생리학을 보완합니다. 앙상블 및 단일 채널 측정을 하나의 시스템에서 통합함으로써, 이 프로토콜은 전기적 작용과 막 점탄성이 결합하여 시냅스와 유사한 전도성 반응(STP 유사, LTP 유사, LTD 유사 반응)을 어떻게 생성하는지 제어가 가능한 상향식 모델 25,29,30,31,32,33,38에서 어떻게 분석하는 실용적인 방법을 제공합니다. 따라서 이 방법론은 막 내 조성 의존적 학습 규칙을 체계적으로 탐구하고, 기계적·전기적 힘이 시간적·공간적 규모에서 막 단백질과 숙주 이중층을 어떻게 결합시키는지 정량화하는 데 기반을 제공합니다 21,22,23,25. 이러한 능력들은 DIB를 복잡한 신경생물학적 행동을 다루기 쉽고 검증 가능한 생물물리학적 메커니즘으로 해체하는 강력한 틀로 자리매김합니다 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-디피타노이-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhPC)	아반티 극지 지질	850356P/850356C	동성 분말(P) 또는 클로로포름(C) 및 nbsp 형태로 구매;
아가로스	시그마-올드리치	A9539
아가로스 (0.5g 아가로스 정제)	벤치마크	A2501	분말 형태나 정제를 사용할 수 있습니다.
애질런트 테크놀로지컬스 33522A 파형 발생기	키사이트	–	BNC 케이블 출력이 있는 어떤 파형 생성기도 사용할 수 있습니다
아르곤(Ar) 가스	에어가스	AR UHP300; 72-402221259-1	아르곤 압축; 초고순도
분석적 균형	메틀러 톨레도	모델: MS304S/03	0.0001g 정밀도의 실험실용 분석 저울을 사용할 수 있습니다
액소패치 200B 앰프	분자 장치	–
BK 프리시전 4017B 10 MHz DD 스윕/기능 발생기	디지키	BK4017B-ND
붕규산 유리 모세관	월드 프리시전 인스트루먼트	1B100F-4
클램프스 pCLAMP 11 소프트웨어 제품군	분자 장치	–
DigiData 1550B 시스템	분자 장치	–	여기에는 미니 익스트루더, 2개의 주사기, 100개의 PC 멤브레인, 100개의 필터 지지대, 그리고 1개의 홀더/가열 블록이 포함됩니다
도데케인, 99%	시그마-올드리치	112-40-3
압출기 세트와 홀더/가열 블록 포함;	아반티 극지 지질	610000
피지 소프트웨어	이미지J	–
냉동고 (-80도 & 도; C)	피셔 사이언티브	등온; 모델: 8964; 번호: 828278-21
유리 제품	VWR 인터내셔널	–
그라미시딘-A	밀리포어 시그마	368020
헥사데케인, 99%	시그마-올드리치	544-76-3
험버그 노이즈 제거기 (60Hz)	A-M 시스템	726300
역현미경 시스템 (니콘 Ti2-A)	니콘	–	역현미경이나 직립 현미경 모두 사용할 수 있습니다
이소프로필 알코올	VWR 인터내셔널	BDH1133-4LP
마이크로전극 홀더	월드 프리시전 인스트루먼트	MEH1
마이크로매니퓰레이터	서터 악기	MP-285	수동 조작기를 사용할 수 있습니다
현미경 카메라	올림포스	DP74
마이크로소프트 엑셀	마이크로소프트	–
걸레	시그마-올드리치	M1254
NIS-Elements 현미경 카메라 소프트웨어	니콘	–	라이브 뷰 및/또는 비디오 기능이 있는 카메라 캡처 소프트웨어가 사용될 수 있습니다. 라이브 뷰와 동시 화면 녹화가 비디오 캡처를 대체하는 데 사용될 수 있습니다.
파라필름 M 다목적 실험실 필름	파라필름	PM999
페트리 접시	-	-	접시는 바닥과 이상적으로는 측면 벽이 투명해야 합니다
염화칼륨(KCl)	시그마-올드리치	P3911
파우더 프리 연질 니트릴 검사 장갑	VWR 인터내셔널	CA89-38-272
냉동기 (4 & deg; C)	피셔 사이언티브	화물 번호: 97-938-1; 모델 번호: 3556FS
은선	굿펠로우	147-346-94
저어주는 핫플레이트	열로 과학	SP131325