방법 논문

조기 배아에서 단일 세포를 분리하고 크기별로 분류하기

DOI:

10.3791/70630

⸱

2026년 3월 20일

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

이 논문에서

요약

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우리는 Xenopus laevis 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 세포 크기별로 분류하는 방법을 설명합니다.

초록

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초기 배아 발생은 세포 크기가 기하급수적으로 감소하는 것을 요구하지만, 배아는 발달 초기 단계에서 크기가 일정하게 유지됩니다. 기능적 중요성과 세포 크기가 배아 발달에 미치는 메커니즘은 아직 대부분 연구가 부족합니다. Xenopus 초기 배아는 이러한 주요 공백을 메우는 독특한 시스템을 제공합니다. 다른 모델 생물과 비교할 때, Xenopus 초기 배아는 매우 크며, 동물 극의 작은 세포부터 식물 극의 큰 세포까지, 배아 전체에 걸쳐 중간 배반 전이 단계에 걸쳐 세포 크기 구배를 포함합니다. 여기서는 Xenopus 초기 배아에서 단일 세포를 해리하고 다양한 망 크기의 세포 여체를 사용해 크기별로 분류하는 프로토콜을 설명합니다. 영상 및 크기 측정을 통해 분류된 세포는 예상 크기 범위 내에 있으며 생세포 분석이나 시퀀싱에 사용되거나 영상 촬영에 고정될 수 있습니다. 이 시스템은 초기 발달 단계에서 크기에 따른 조절 메커니즘을 밝히는 데 새로운 시각을 제공할 것입니다.

서론

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세포 크기 변화는 초기 배아발생에서 흔히 나타나는 특징으로, 수정란이 여러 차례 분열을 거쳐 점점 더 많은 세포를 생성합니다. 세포크기를 세포 기능을 조절하는 주요 매개변수로서 역할에 대해서는 많이 알려져 있지만, 세포 크기가 초기 발달에 미치는 영향은 아직 알려져 있지 않습니다. 최근 다양한 모델 배아 시스템에서 세포 크기가 접합 게놈 활성화(ZGA)와 세포 운명명칭 5를 조절하며, 발생 결정에서 세포 크기가 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 6,7.

Xenopus 초기 배아는 세포 크기에 의해 조절되는 발달 의사결정을 연구하는 중요한 모델입니다. Xenopus의 초기 배아는 크기가 크고(~1.2 mm) 크기를 물리적으로 조작하기 쉬워 세포 크기 변화의 직접적인 결과를 평가하는 데 유용합니다....

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프로토콜

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여기서 설명된 동물 작업은 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 용액 준비

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결책을 준비하세요.

  1. 20× MMR 준비: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl2, 40 mM CaCl2를 혼합합니다. NaOH로 pH를 7.8로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
  2. Ca2+, Mg2+-프리 배지(CMFM) 준비: 50.3 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 9.2 mM Na2HPO4, 0.9 mM KH2PO4, 2.4 mM NaHCO3, 1.0 mM EDTA를 혼합합니다. 필요하다면 pH를 7.4로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
  3. 60mm 페트리 접시에 1.5% 아가로스 젤을 준비하세요: 5....

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결과

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9단계 Xenopus laevis 배아(n = 50)는 CMFM 배양지에서 이 프로토콜에 따라 단일 배반체로 해리되도록 배양되었습니다(그림 1 예시 참조). 해리된 단일 배반체는 위에서 설명한 40 μm, 70 μm, 100 μm 세포 체균을 사용해 순차적으로 분류되었습니다. 분류되지 않은 대조군과 단일 블라스토미어는 4% 파라포름알데히드에 고정되어 밝야 현미경으로 촬영되었습니다(그림 4A). 그림 4B,C에서 보듯, 다양한 크기를 가진 대조군 미분류 배아체와 비교했을 때, 배열된 배아체는 예상 크기 범위에 속하는 좁은 범위 내를 보였다: < 40 μm, 33 ± 5.3 μm; 40-70 μm, 55 ± 11 μm; 70 μm> 91 ± 17 μm(

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토론

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세포크기는 세포 기능에 근본적으로 중요하며, 초기 발달에 미치는 영향은 모델 배아 시스템에서 더 면밀한 검토가 필요합니다. 여기서는 Xenopus laevis 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 세포 체를 이용해 세포 크기별로 분류하는 방법에 대해 자세히 설명했으며, 이는 세포 크기 연구에 잠재적으로 활용할 수 있습니다. 이 방법은 초기 배아형성에서 크기에 조절되는 접합자 유전자 활성화의 직접적인 증거를 제공할 수 있게해주었습니다.

프로토콜의 성공을 위해서는 몇 가지 핵심 단계가 있습니다. 제노푸스 초기 배아에는 세포 크기에 따른 구배 축이 존재하기 때문에, 동물 극에서 식물 극까지 작은 세포부터 큰 세포까지 4 4, 크기가 다양한 세포의 비율이 매우 다르다; .......

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공개 사항

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저자는 상반되는 이해관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

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펜실베이니아 대학교의 매튜 굿 연구실에 교육을 제공해 주셔서 감사드립니다. 이 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소(R03HD105802)의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16% 파라포름알데히드 (PFA)응급의료 서비스15710-S고정액을 만들기 위해
60mm 일회용 페트리 접시VWR25384-092배아 부양을 위해
ACCU-SCOPE 3075 줌 입체 현미경VWR470351-130배아 시각화를 위해
아가로스시그마-올드리치A-9414페트리 접시 코팅을 위해
셀 스트레이너, 100 및 마이크로; mVWR76327-102셀 크기별 정렬을 위해
셀 스트레이너, 40 및 마이크로; mVWR76327-098셀 크기별 정렬을 위해
셀 스트레이너, 70 및 마이크로; mVWR76327-100셀 크기별 정렬을 위해
일회용 이송 피펫VWR414004-035배아 이식을 위해
듀몽 핀셋, 스타일 5전자현미경 과학72701-D비텔린 막 제거를 위해
유리 페트리 접시, 60 & times; 15mmVWR75845-542배아 부양을 위해

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38<....

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