조기 배아에서 단일 세포를 분리하고 크기별로 분류하기

요약

우리는 Xenopus laevis 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 세포 크기별로 분류하는 방법을 설명합니다.

초록

초기 배아 발생은 세포 크기가 기하급수적으로 감소하는 것을 요구하지만, 배아는 발달 초기 단계에서 크기가 일정하게 유지됩니다. 기능적 중요성과 세포 크기가 배아 발달에 미치는 메커니즘은 아직 대부분 연구가 부족합니다. Xenopus 초기 배아는 이러한 주요 공백을 메우는 독특한 시스템을 제공합니다. 다른 모델 생물과 비교할 때, Xenopus 초기 배아는 매우 크며, 동물 극의 작은 세포부터 식물 극의 큰 세포까지, 배아 전체에 걸쳐 중간 배반 전이 단계에 걸쳐 세포 크기 구배를 포함합니다. 여기서는 Xenopus 초기 배아에서 단일 세포를 해리하고 다양한 망 크기의 세포 여체를 사용해 크기별로 분류하는 프로토콜을 설명합니다. 영상 및 크기 측정을 통해 분류된 세포는 예상 크기 범위 내에 있으며 생세포 분석이나 시퀀싱에 사용되거나 영상 촬영에 고정될 수 있습니다. 이 시스템은 초기 발달 단계에서 크기에 따른 조절 메커니즘을 밝히는 데 새로운 시각을 제공할 것입니다.

서론

세포 크기 변화는 초기 배아발생에서 흔히 나타나는 특징으로, 수정란이 여러 차례 분열을 거쳐 점점 더 많은 세포를 생성합니다. 세포^{크기를 세포} 기능을 조절하는 주요 매개변수로서 역할에 대해서는 많이 ^{알려져 있지만,} 세포 크기가 초기 발달에 미치는 영향은 아직 알려져 있지 않습니다. 최근 다양한 모델 배아 시스템에서 세포 크기가 접합 게놈 활성화(ZGA^)와 세포 운명^{명칭 5}를 조절하며, 발생 결정에서 세포 크기가 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다 ^6,7.

Xenopus 초기 배아는 세포 크기에 의해 조절되는 발달 의사결정을 연구하는 중요한 모델입니다. Xenopus의 초기 배아는 크기가 크고(~1.2 mm) 크기를 물리적으로 조작하기 쉬워 세포 크기 변화의 직접적인 결과를 평가하는 데 유용합니다. 예를 들어, 헤어 루프 ^4,8을 이용해 1세포 배아를 수축시켜 다양한 크기의 미니 배아를 생성할 수 있으며, 이는 용량 의존적 ZGA⁴를 입증합니다. 더불어, Xenopus의 초기 배아는 동물-식물 중심의 세포 크기 구배를 포함하며, 가장 작은 세포는 동물 극에 있고 가장 큰 세포는 식물 극에 위치해 4^{부피 차이}가 100배 이상 나타납니다. 중요하게도, 전체 마운트 배아의 단일 세포에서 신생 전사체를 직접 시각화하고 정량화함으로써, ZGA⁴를 조절하는 세포 크기 임계값을 확인했습니다. 또한, 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 크기별로 분류한 결과, 세포 크기-임계값 ZGA⁴의 중요성이 확인되었습니다.

여기서는 Xenopus laevis 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 크기별로 분류하는 상세 절차를 설명합니다. Xenopus 초기 배아는 Ca²⁺, Mg²⁺-자유배지(CMFM⁾에서 배양하여 개별 세포로 분리할 수 있으며, 이 단일 세포들은 다양한 망 크기의 세포 체를 사용해 추가로 분류할 수 있습니다. 선별된 세포는 정제되어 생세포 분석, 시퀀싱, 영상 분석 등 다양한 응용 분야에 활용될 수 있습니다.

프로토콜

여기서 설명된 동물 작업은 사우스캐롤라이나 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 용액 준비

참고: 프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결책을 준비하세요.

1. 20× MMR 준비: 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 40 mM CaCl₂를 혼합합니다. NaOH로 pH를 7.8로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
2. Ca²⁺, Mg²⁺-프리 배지(CMFM) 준비: 50.3 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 9.2 mM Na₂HPO₄, 0.9 mM KH₂PO₄, 2.4 mM NaHCO₃, 1.0 mM EDTA를 혼합합니다. 필요하다면 pH를 7.4로 조절하세요. 오토클레이브하고 실온에서 보관하세요.
3. 60mm 페트리 접시에 1.5% 아가로스 젤을 준비하세요: 50mL의 CMFM에 0.75g 아가로스를 첨가합니다. 전자레인지에 아가로스를 녹이기 위해 열을 가하세요. 60mm 페트리 접시에 얇은 층을 코팅하기 위해 5-10mL의 아가로스 젤을 추가하세요.
4. 15% 밀도 구배 배지(wt/vol)/CMFM을 준비하세요: 15g의 밀도 구배 배지를 천천히 100mL의 CMFM에 첨가합니다. 용해를 돕기 위해 밀도 구배 매체가 완전히 녹을 때까지 판 위에서 가열하고 저어줍니다. 사용 전까지 용액을 4 °C로 유지하세요.
5. 4% PFA/1× MEM 준비: 16% 파라포름알데히드 스톡 1바이알(10 mL)과 10× MEM 4 mL(1000 mM MOPS pH 7.4, 20 mM EGTA, 10 mM MgSO₄)를 혼합합니다. 초순수물을 40mL에 추가하세요.
   참고: Xenopus 배아를 얻으려면 시험 관 수정( IVF) 표준 프로토콜을 따르세요(예: Sive et al., 2007 참조)¹⁰. 배아는 0.1× MMR 상태여야 사용 준비가 되어 있어야 합니다.

2. 초기 배아를 단일 세포로 분리

1. 1.5% 아가로스 젤로 코팅된 새로운 60mm 페트리 접시에 ~15mL의 CMFM을 추가합니다. 플라스틱 이식 피펫을 사용해 10개에서 100개의 배아(실험 필요에 따라 다름)를 접시에 이식하세요. 접시를 입체현미경으로 살펴보세요.
2. 양손에 핀셋을 사용해 한 손으로 배아 표면에 붙인 비텔린 막을 조심스럽게 제거하고, 다른 손으로는 벗겨내세요. 과정 중에 배아를 손상시키지 않도록 주의하세요.
3. 데비텔리드 배아를 CMFM에서 실온에서 ~1시간 정도 배양합니다. 세포 분리를 촉진하기 위해 접시를 5분마다 아주 부드럽게 흔들어 주세요. 폭발 더미가 보이지 않을 때까지 정기적으로 점검하세요(그림 1).

3. 해리된 세포를 크기별로 정렬하기

1. 블래스토미어 해리 과정에는 세포 착색자(40 μm, 70 μm, 100 μm)를 CMFM으로 채운 개별 페트리 접시에 담가둡니다(그림 2). 요리를 왼쪽에서 오른쪽 순서대로 배치하세요. 또한 각 분류 시 세포 염색자를 잠시 세척할 수 있도록 그룹 간에 CMFM 접시 두 개를 추가로 두세요.
2. 분리된 단일 배반체가 들어있는 접시를 부드럽게 휘저어 중앙에서 풍부하게 만듭니다. 블라스토머를 조심스럽게 CMFM의 40 μm 스테인으로 옮깁니다.
3. 체를 몇 번 부드럽게 흔들어 40 μm < 블래스토머가 체를 통과하도록 하세요. 그 후 40 μm 체를 CMFM이 채워진 접시로 빠르게 옮겨 짧은 세척을 합니다. 40 μm 체에 > 40 μm 체에 있는 블래스토머를 70 μm 스트레이너로 조심스럽게 옮깁니다.
4. 이 과정을 반복하여 100 μm 체에서 배열된 배아체가 분리됩니다.
5. 각 접시에 배열된 블라스토머를 부드럽게 휘저어 중앙에서 풍성하게 만드세요. 용광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브(그림 3)에서 15% 밀도 구배 배지 0.5mL 위에 신중하게 배반체(~4 mL)를 옮깁니다. 섞지 마세요.
6. 튜브를 10분간 두세요. 온전한 블라스토머는 중력에 의해 바닥으로 가라앉아 분류 및 이송 과정에서 노른자 구슬과 터진 블라스토머에서 분리됩니다(그림 3).
7. 후속 실험의 목적에 따라 생세포 분석을 진행하거나, RNA 작업을 위해 용질소에 블라스토머를 냉동하거나, 면역염색을 위해 블라스토머를 고정하는 방법이 있습니다(그림 3).

결과

9단계 Xenopus laevis 배아(n = 50)는 CMFM 배양지에서 이 프로토콜에 따라 단일 배반체로 해리되도록 배양되었습니다(그림 1 예시 참조). 해리된 단일 배반체는 위에서 설명한 40 μm, 70 μm, 100 μm 세포 체균을 사용해 순차적으로 분류되었습니다. 분류되지 않은 대조군과 단일 블라스토미어는 4% 파라포름알데히드에 고정되어 밝야 현미경으로 촬영되었습니다(그림 4A). 그림 4B,C에서 보듯, 다양한 크기를 가진 대조군 미분류 배아체와 비교했을 때, 배열된 배아체는 예상 크기 범위에 속하는 좁은 범위 내를 보였다: < 40 μm, 33 ± 5.3 μm; 40-70 μm, 55 ± 11 μm; 70 μm> 91 ± 17 μm(

토론

세포^크기는 세포 기능에 근본적으로 중요하며, 초기 발달에 미치는 영향은 모델 배아 시스템에서 더 면밀한 검토가 필요합니다. 여기서는 Xenopus laevis 초기 배아에서 단일 세포를 분리하고 세포 체를 이용해 세포 크기별로 분류하는 방법에 대해 자세히 설명했으며, 이는 세포 크기 연구에 잠재적으로 활용할 수 있습니다. 이 방법은 초기 배아형성에서 크기에 조절되는 접합자 유전자 활성화의 직접적인 증거를 제공할 수 있게^{해주었습니다}.

프로토콜의 성공을 위해서는 몇 가지 핵심 단계가 있습니다. 제노푸스 초기 배아에는 세포 크기에 따른 구배 축이 존재하기 때문에, 동물 극에서 식물 극까지 작은 세포부터 큰 세포까지 4 4, 크기가 다양한 세포의 비율이 매우 다르다; ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16% 파라포름알데히드 (PFA)	응급의료 서비스	15710-S	고정액을 만들기 위해
60mm 일회용 페트리 접시	VWR	25384-092	배아 부양을 위해
ACCU-SCOPE 3075 줌 입체 현미경	VWR	470351-130	배아 시각화를 위해
아가로스	시그마-올드리치	A-9414	페트리 접시 코팅을 위해
셀 스트레이너, 100 및 마이크로; m	VWR	76327-102	셀 크기별 정렬을 위해
셀 스트레이너, 40 및 마이크로; m	VWR	76327-098	셀 크기별 정렬을 위해
셀 스트레이너, 70 및 마이크로; m	VWR	76327-100	셀 크기별 정렬을 위해
일회용 이송 피펫	VWR	414004-035	배아 이식을 위해
듀몽 핀셋, 스타일 5	전자현미경 과학	72701-D	비텔린 막 제거를 위해
유리 페트리 접시, 60 & times; 15mm	VWR	75845-542	배아 부양을 위해