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방법 논문

톡소플라즈마 곤디의 변종 유형 분류를 위한 다중 좌위 시퀀싱

266 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70645

⸱

2026년 5월 26일

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

이 논문에서

요약

여기서는 선택된 유전 마커의 휴대용 나노포어 시퀀싱을 사용하여 Toxoplasma gondii 균주를 신속히 식별하고 유전자형 분류하는 프로토콜을 제시하여, 실험실에서 유지 관리하는 분리주에서 확장 가능하고 표적 균주를 식별할 수 있게 하며, 향후 감시 환경에 적용될 가능성이 있습니다.

초록

톡소플라즈마 곤디이는 전 세계적으로 분포하는 종복합체 기생충으로, 상당한 유전적 다양성을 특징으로 하여 균주 구별을 위해 정확한 분자 접근법이 필요합니다. 이 프로토콜의 목표는 배양된 T. gondii 분리주에 대한 표적 다중 유전자형 분석에 대한 재현 가능한 워크플로우를 확립하는 것입니다. 이 절차는 대표적인 유형 I(RH) 및 유형 II(ME49) 균주의 시험관 내 전파, 유전체 DNA 추출, SAG2 및 SAG3 유전자의 유위 특이적 증폭, 그리고 단일 염기염기 다형성(SNP) 및 삽입/결실(INDEL) 사건을 검출하기 위한 시퀀싱 기반 분석을 포함합니다. 시퀀싱 데이터는 고신뢰 합의 서열을 생성하고 균주 특이적 다형성 식별을 위한 비교 정렬을 수행하기 위해 처리됩니다. 이 워크플로우를 원형 균주에 적용한 결과, 높은 매핑 효율성, 표적 좌위 전반에 걸쳐 일관된 읽기 깊이, 예상 증폭자 크기의 정확한 복원이 입증되어 좌위 수준의 유전 변이를 신뢰성 있게 검출할 수 있음을 확인하였습니다. 포괄적인 유전자형 할당은 추가적인 표준화된 마커 포함을 요구하지만, 이 프로토콜은 실험실에서 유지 중인 T. gondii 분리주에 대한 표적 유전적 특성화를 위한 확장 가능하고 재현 가능한 틀을 제공하며, 일관된 다중 유전자 좌위 서열 분석을 지원합니다.

서론

톡소플라즈마 곤디이는 전 세계에 분포하는 종합체(apicomplexan) 기생충으로, 주요 식과 수중 인수공통전병 위협으로, 거의 모든 온혈동물을 감염시킬 수 있으며, 고양이가 최종 숙주로 작용한다1. 인간과 동물의 감염은 주로 조직 낭종이나 포자 난낭포의 섭취를 통해 발생하며, 기생충이 타키조이트와 서기 단계를 번갈아 가며 나타나는 능력은 신경 및 근육 조직에 장기적으로 지속될 수 있게 하여 육류 매개 및 환경 전파에 기여합니다 2,3.

유럽과 북미에서 세 개의 클론 계통(타입 I, II, III)이 우세하지만, 비정형 및 재조합 균주를 포함한 광범위한 유전적 다양성이 전 세계적으로 문서화되었으며, 특히 야생동물저장소가 풍부한 지역에서 그렇습니다. 따라서 정확한 균주 구별은 전파 역학 규명, 발병 조사, 지역 역학 이해에 필수적입니다. PCR-RFLP, 생거 기반 다중 유전자 서열 타이핑(MLST), 마이크로새틀라이트 분석과 같은 전통적인 유전자형 분석 방법은 T . gondii 개체군 구조에 대한 이해에 크게 기여했으나, 해상도, 처리량, 유전자형 내 변이 탐지 능력에는 한계가 있습니다. 이러한 접근법은 종종 여러 개의 별도 반응을 필요로 하며, 다형성 유전자1 내에서 삽입, 결실, 복합 하플로타입을 감지하지 못할 수 있습니다. 단독 차세대 시퀀싱(NGS)은 희귀 변이의 검출을 개선했으나, 복잡한구조 변화를 식별하는 데는 여전히 제약을 보입니다.

특히 Oxford Nanopore Technologies와 같은 롱리드 시퀀싱 플랫폼은 구조 변이와 고형성 좌위5 해독에 적합한 연속적이고 고정밀 리드를 생성할 수 있는 능력을 제공합니다. 휴대성, 실시간 분석 능력, 증폭기 기반 워크플로우와의 호환성 덕분에 현장 응용과 발병 조사에 유망한 도구로 만들어집니다6. 이러한 장점에도 불구하고, T . gondii 유전자형 분석을 위한 표준화된 다중 좌위 롱리드 워크플로우는 여전히 제한적입니다.

이 격차를 해소하기 위해 두 개의 다형성 좌위를 목표로 한 확장 가능한 장독 증폭자 시퀀싱 워크플로우를 구축했습니다(그림 1). 합의 다듬기 및 변이 호출 파이프라인과 결합하여 SNP와 INDEL을 정확히 탐지하여 균열 수준 분별을 지원합니다. 이 프로토콜은 PCR 증폭 및 장독기 시퀀싱이 가능한 실험실에 적합하며, 배양 분리주를 사용하여 검증되었습니다. 임상 또는 환경 샘플에 대한 적응이 가능할 수 있지만, 이러한 응용 분야는 추가적인 최적화와 검증이 필요합니다. 전반적으로 이 워크플로우는 표적 분자 특성화를 위한 구조화된 틀을 제공하며, 역학 조사를 지원할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 확립된 실험실 기생충 균주와 상업적으로 구한 인간 섬유아세포주 연구를 사용하였습니다. 인간이나 동물 대상은 직접 참여하지 않았습니다.

참고: 별도 명시가 없는 한, 이 프로토콜에 사용되는 완충제와 시약은 재료표에 나열된 상업용 키트 내에 공급됩니다.

1. 바이오마커 선택

  1. ToxoDB(https://toxodb.org/toxo/app) 게놈 데이터베이스에서 SAG2 와 SAG3 의 유전체 서열을 FASTA 형식으로 다운로드하세요.
  2. EMBOSS Water(https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water)를 사용하여 쌍별 정렬을 수행합니다.
  3. 증폭 영역≤1,600염기쌍(bp)을 선택하여 시퀀싱 시간을 최소화하고 효율적인 PCR 증폭을 보장합니다.
  4. 각 영역에 변형 분별을 위한 유익한 SNP 또는 INDEL 다형성이 포함되도록 하세요.

2. 톡소플라즈마 곤디이 타키조이트의 배양 및 채취

  1. 숙주 세포 배양 유지
    1. 인증된 상업용 출처에서 인간 포피 섬유아세포(HFF)를 구입하여 Dulbecco's Modified Eagle Medium에 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충한 완전한 성장 배지에서 배양하세요.
    2. 37°C에서 5% CO₂를 포함한 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
  2. 기생충 계통의 유지 및 확장.
    1. 타키조이트를 사용하여 80–90% 합류점에서 섬유아세포 단층층을 감염시키며, 숙주 세포당 1–3종의 기생충이 감염됩니다. 약 1× 106 개의 섬유아세포가 포함된 T25 플라스크의 경우, 1–3× 106 개의 타키조이트를 추가합니다.
    2. 매일 역현미경으로 20× 또는 40× 배율로 배양물을 관찰하세요. 광범위한 단색층 파괴를 관찰하여 숙주 세포 해열을 식별합니다.
      참고: 20번 구간 이후에는 섬유아세포 배양을 사용하지 말아 배양 관련 인공물을 피하십시오.
    3. 타키조이트 채취.
      1. 숙주 세포 용해가 ≥90%가 관찰될 때 배양물을 수집하세요.
      2. 원심분리기로 1,300 × g, 4 °C에서 10분간 가열.
      3. 펠릿을 10 mL의 멸균 인산염 완충 식염수에 부드러운 피펫으로 재현탁한 후, 다시 1,300 × g 용량에서 4 °C에서 10분간 원심분리합니다. 한 번 더 반복하세요.

3. 유전체 DNA 추출 및 증폭자 생성

  1. 실리카 컬럼 기반 유전체 DNA 정제 키트를 사용하여 유전체 DNA 추출7. 50 μL 용출 버퍼에서 DNA를 용출합니다.
  2. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용해 DNA 농도를 측정합니다.
  3. 단기 저장은 4°C, 장기 저장은 −20°C에 저장합니다.
  4. 고충실도 DNA 중합효소 마스터 믹스, 유좌위 특이적 프라이머(보충표 1), 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 PCR 반응을 준비합니다.
  5. 다음 사이클 조건에서 보정된 열 사이클러를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다: (a) 98 °C에서 초기 변성 30초, (b) 98 °C 35회 사이클 10초; 유좌 특이적 어닐링: SAG2는 60 °C, SAG3는 68 °C, 30초; 20초 동안 72 °C, (c) 최종 연장: 2분 동안 72 °C.
  6. 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동을 통해 PCR 산물을 검증합니다.
  7. 제조사 지침에 따라 컬럼 기반 PCR 및 겔 추출 정제 시스템을 사용하여 PCR 제품을 정제합니다. 15–20 μL 용출 완액에서 DNA를 용출합니다.
    참고: DNA 주형 품질, 농도, 또는 최적 반응 조건이 낮아 PCR 효율과 수율이 저하될 수 있습니다. 증폭자 수율이 낮을 경우, 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 주형 무결성을 검증하고, 분광광도계를 사용해 농도 및 순도를 검증합니다. PCR 어닐링 온도와 프라이머 농도는 사용되는 프라이머 쌍에 맞게 최적화되어야 하며, 필요에 따라 PCR 사이클 수를 늘려야 합니다.

4. 롱리드 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비

  1. 엔드 리페어와 dA 테일링
    1. 모든 시약을 녹이고 소용돌이로 완전히 섞으세요. 첫 사용 시에는 10.5 μL 용출 버퍼로 DNA 대조 샘플을 희석하고 얼음 보관합니다.
      참고: 사용 전에 항상 보텍스 자기 비즈를 꼼꼼히 닦아야 합니다.
      주의: End-Prep 효소 혼합물을 소용돌이로 삼지 마세요; 피펫으로 부드럽게 섞으세요.
    2. 각 DNA 샘플 200 fmol(1 kb 조각의 경우 ~130 ng)을 0.2 mL PCR 튜브에 피펫 흡입하고, 뉴클레아제 무첨가물로 부피를 11.5 μL로 조절합니다.
    3. 각 튜브당 희석된 DNA 대조 샘플 1μL을 추가하고 피펫팅하여 10–20회 섞습니다.
    4. 샘플당 1.75 μL 반응 버퍼와 0.75 μL 효소 혼합물(5% 초과 포함)을 포함한 최종 준비 마스터 믹스를 준비합니다.
    5. 각 샘플에 마스터 믹스 2.5 μL을 추가하고, 부드럽게 섞은 후 잠시 돌려 줄입니다.
    6. 열 사이클러에서 20°C에서 5분간 배양한 후 65°C에서 5분간 배양합니다.
  2. 최종 준비 DNA의 정제
    1. 15 μL 반응을 1.5 mL 저DNA 결합 미세원심분리관에 옮깁니다.
    2. 15 μL 재현탁 자기 비드를 추가하고 부드럽게 섞은 후 잠시 돌립니다.
    3. 샘플을 로테이터 믹서에 실온에서 5분간 배양합니다.
    4. 세척할 때 신선한 80% 에탄올을 준비하세요.
    5. 튜브를 자석 거치대에 올려 구슬이 덩어리가 될 때까지 넣고 상청액을 조심스럽게 제거하세요.
    6. 80% 에탄올 200 μL로 구슬을 두 번 세척하세요.
      참고: 비즈가 완전히 알릿이 될 때까지 기다린 후 에탄올을 조심스럽게 제거하세요.
    7. 비즈는 ~30초 동안 자연 건조; 균열을 방지하기 위해 과도한 건조를 피하세요.
    8. 구슬을 10 μL 무핵효소 물에 재현탁한 후 실온에서 2분간 배양합니다.
    9. 튜브를 자기 랙에 올려놓고 10 μL 용액을 깨끗한 저DNA 결합 마이크로 원심분리관에 옮깁니다.
    10. 분광광도계에서 1 μL의 DNA 농도를 측정합니다.
  3. 네이티브 바코드
    1. 해빙 블런트/TA 리가세 마스터 믹스, EDTA, 숏 프래그먼트 버퍼(SFB), 네이티브 바코드 (NB01–NB24).
    2. 샘플 1–24에 개별 바코드를 할당합니다.
    3. 7.5 μL 말단 준비 DNA, 2.5 μL 네이티브 바코드, 10 μL 블런트/TA 리가세 마스터 믹스로 바코딩 반응을 조립합니다
    4. 피펫팅으로 10–20번 충분히 섞으세요.
    5. 상온에서 20분간 배양한 후 4 μL EDTA로 반응을 종료하고, 피펫팅으로 충분히 혼합한 후 잠시 스핀다운합니다.
    6. 1.5mL 저DNA 결합 마이크로 원심분리기 튜브에 바코드 샘플을 풀링합니다. 전체 집단 샘플 부피의 0.4×에 자기 비즈를 추가하세요(예: 230 μL 비즈를 575 μL 풀링 DNA에 추가). 피펫팅으로 충분히 혼합한 후, 상온에서 회전기 믹서에서 10분간 배양하세요.
    7. 비즈를 700 μL 단편 과열기(SFB)로 세척합니다. 비즈를 튕겨 재현수시키고, 회전시키고, 샘플을 자기 선반에 다시 넣어 비즈가 알릿으로 떨어지도록 합니다. 피펫으로 버퍼를 제거한 후 버리세요.
    8. 이전 단계를 반복하세요.
    9. 회전시킨 후 튜브를 다시 자기 랙에 올려놓으세요. 잔류 버퍼를 피펫으로 떼어내세요.
    10. 튜브를 자기 거치대에서 분리하고, 펠릿을 35 μL 무뉴클레아제 물에 부드럽게 튕겨 다시 부탁합니다.
    11. 37°C에서 10분간 간헐적으로 혼합한 후 용액을 깨끗한 저DNA 결합 미세원심분리관으로 옮깁니다.
  4. 어댑터 연결과 라이브러리 정리
    1. 30 μL 풀링 바코드 DNA, 5 μL 네이티브 어댑터, 10 μL 리게이션 버퍼(5×), 5 μL T4 DNA 리게이아제로 리게이션 반응을 조립합니다.
    2. 반응을 부드럽게 피펫팅하고 잠시 회전시켜 반응을 완전히 섞으세요. 반응을 상온에서 20분간 배양하세요.
    3. 반응에 20 μL의 재현탁된 자기 구슬을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 로테이터 믹서에서 실온에서 10분간 부양하세요.
    4. 샘플과 펠릿을 자기 랙 위에서 회전시키세요. 튜브를 자석에 고정하고 피펫을 상원액에서 떼어내세요.
    5. 비즈를 세척하려면 125 μL 단편 과충제(SFB)를 첨가합니다. 비즈를 튕겨 다시 매달고, 회전시키고, 튜브를 다시 자석 거치대에 넣어 비즈가 알릿을 일으키도록 하세요. 피펫으로 상원액을 제거한 후 버리세요.
    6. 이전 단계를 반복하세요.
    7. 아래로 돌려서 튜브를 다시 자석에 올려놓으세요. 잔여 상청액을 피펫으로 제거하세요. 튜브를 자기 랙에서 분리하고 펠릿을 15 μL 용출 버퍼(EB)에 재현탁합니다.
    8. 회전 후 37°C에서 10분간 부화하세요. 2분마다 DNA 용출을 유도하기 위해 샘플을 10초간 부드럽게 흔들어 주세요.
    9. 비즈를 자석에 뿌려 최소 1분 동안 세척액이 투명하고 무색이 될 때까지 발라줍니다.
    10. DNA 라이브러리를 포함한 15 μL 일루에이트를 제거하여 깨끗한 1.5 mL 저DNA 결합 마이크로 원심분리관에 보관합니다.
    11. 최종 라이브러리를 분광광도계로 정량화하세요.

5. 플로우셀 준비 및 나노포어 시퀀싱

  1. 플로우셀 준비
    1. 플로우셀을 점검하고 ≥80개의 활성 기공을 확인하세요.
    2. 프라이밍 혼합물을 117 μL의 플러시 용액과 3 μL 테더 용액을 마이크로 원심분리관에서 혼합하여 총 120 μL의 부피를 만듭니다. 공기 방울 발생을 피하기 위해 피펫팅으로 부드럽게 혼합하세요. 전체 120 μL 프라이밍 혼합물을 플로우셀 프라이밍 포트에 천천히 적재하여 로딩 중 기포가 유입되지 않도록 합니다.
  2. 라이브러리 로딩 및 시퀀싱
    1. 시퀀싱 믹스는 시퀀싱 버퍼(SB) 15 μL, 라이브러리 비즈(LIB) 10 μL, DNA 라이브러리 5 μL을 조합하여 준비합니다. 기포가 생기지 않도록 피펫을 3–5번 위아래로 부드럽게 섞으세요. 결과된 30 μL 시퀀싱 혼합물은 이미 로딩 준비가 되어 있거나 필요 시 45 μL로 조정할 수 있습니다.
    2. 서열 분석 혼합액 30–45 μL을 천천히 플로우셀 샘플 포트에 드롭 방향으로 분사하여 적재합니다.
      주의: 기포를 유입하지 말고 피펫 팁이 막에 닿지 않도록 주의하세요. 분배 후에는 적재 문을 단단히 닫으세요.
    3. 실시간 베이스 콜링을 활성화한 상태에서 시퀀싱을 시작하고 구멍 활동을 모니터링하세요.
    4. 증폭≥ 500× 커버리지가 ×≥달성될 때까지 시퀀싱을 계속하여 정확한 염기 호출, 신뢰할 수 있는 합의 서열 생성, 저주파 변이의 확신 탐지를 확보할 수 있도록 충분한 독 깊이를 확보하세요.
      참고: 시퀀싱 커버리지가 낮을 경우, 요구된 농도에서 고품질 증폭자 입력, 충분한 활성 유동 셀 기공, 그리고 권장 커버리지를 달성하기 위해 시퀀싱을 연장하세요.

6. 데이터 처리 및 변이 분석

  1. 기지 호출 및 탈다중화
    1. 플랫폼 연계 베이스 호출 소프트웨어를 사용하여 기본 고정확도 설정을 사용하여 샘플당 FASTQ 파일을 생성하는 고정밀 베이스 호출을 수행합니다. 디멀티플렉스는 바코드로 읽고 품질 관리 필터를 통과하는 독자만 유지합니다.
  2. 리드 매핑 및 BAM 처리
    1. 국립생명공학정보센터(NCBI) 게놈 데이터베이스에서 톡 소플라즈마 곤디이 참조 게놈 조립 GCF_000006565.2(TGA4)를 다운로드하세요. SAG2 분석을 위해 제8염색체(NC_031476.1)를, SAG3 분석을 위해 제12염색체(NC_031480.1)를 추출합니다. SAMtools를 사용해 참조 서열을 색인화하고, 장기 읽기 정렬 인덱스 빌더를 사용해 정렬 인덱스를 생성합니다.
    2. 맵은 나노포어 시퀀싱 데이터에 최적화된 롱리드 정렬 알고리즘(예: 롱리드 매핑용; -ax map-ont)을 사용하여 인덱스된 참조 게놈에 대해 읽습니다.
    3. 정렬 출력을 BAM 형식으로 변환하고, SAMtools를 사용해 BAM 파일을 정렬 및 인덱싱할 수 있습니다. Picard 도구를 사용해 각 BAM 파일에 읽기 그룹 정보를 추가하세요. 깊이 통계를 사용해 좌위별 평균 커버리지를 계산하고, 플래그통계 지표를 사용해 지도 통계를 생성합니다.
  3. 합의 서열 생성
    1. 기본 매개변수를 가진 신경망 기반 합의 다듬기 알고리즘을 사용하여 증폭자 단위 합의 시퀀스를 생성합니다. 하위 분석을 위해 FASTA 형식으로 합의 서열을 내보내세요.
    2. 공개된 유전체 데이터베이스를 사용하여 참고문헌 기반 정렬 및 비교 서열 분석을 수행합니다. 게놈 시각화 소프트웨어를 사용하여 리드 정렬과 다형성 위치를 시각화합니다.
  4. 변형 호출
    1. 합의 기반 변이 호출 알고리즘을 사용하여 변이 탐지를 수행합니다. 변이 선택 도구를 사용한 별도의 단일 염기염기 다형성(SNP)과 삽입/결실 사건(INDELs)을 연구했습니다(보충 문서 1).
    2. 품질 필터링 임계값을 적용하세요. SNP의 경우, 예를 들어 QD < 2.0, FS > 60.0, 또는 MQ < 40.0 같은 필터 변형을 사용합니다. INDEL의 경우, 예를 들어 QD < 2.0 또는 FS > 200.0 같은 필터 변형을 사용합니다.
    3. 표준 VCF 처리 도구를 사용하여 필터링된 VCF 파일을 압축하고 인덱스화합니다. VCF 요약 유틸리티를 사용하여 변형 통계를 생성하세요.
  5. 유전자형 분류
    1. SAG2 및 SAG3 영역에서 유위 특이적 변이체를 추출하고, 다형성 프로필을 참조 균주 서열과 비교하여 T. gondii 유전자형을 부여합니다.

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결과

톡소플라즈마 곤디의 유전체 DNA는 두 가지 유전 마커인 SAG2와 SAG3를 표적으로 하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 성공적으로 증폭되었습니다(그림 2). 정제 후 PCR 산물들은 아가로스 겔 전기영동에서 예상 크기의 뚜렷한 밴드를 생성하였으며, 이는 639 bp(SAG2)와 1158 bp(SAG3)에 해당합니다. 이 밴드들의 명료함과 일관성은 이후 서열 분석을 위한 표적 유전자 조각의 성공적인 증폭과 무결성을 확인시켜 주었습니다.

고처리량 나노포어 시퀀싱은 Toxoplasma gondii의 RH 및 ME49 계통 모두에서 조사된 유전자 좌위에 걸쳐 고품질 데이터셋을 생성했습니다(표 1). SAG2 유전자좌의 경우, M...

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토론

본 연구는 옥스퍼드 나노포어 롱리드 시퀀싱과 표적 다중 좌위 접근법을 결합하여 톡소플라즈마 곤디의 신속하고 신뢰할 수 있는 유전체형 분석을 위한 유용성을 입증합니다. 잘 특성화된 두 표면 항원 유전자 좌위인 SAG2 와 SAG3에 집중함으로써, RH(Type I)와 ME49(Type II) 균주를 비교 분석하여 Oxford Nanopore 기반 다중 유전자 시퀀싱의 개념 증명을 입증하여, 이 플랫폼이 균주 특이적 유전 변이를 해독할 수 있음을 입증했습니다.

두 유전자 좌위의 PCR 증폭은 예상 크기의 명확하고 명확한 밴드를 생성하여, 하위 유전체 분석에 적합한 고품질 템플릿 DNA의 성공적인 생성을 확인했습니다. 이후 나노포어 시퀀싱은 높은 읽기 깊이, 강한 매핑 효율, 그리고 예상되는 앰플리콘 길이와 거의 일치하는 합의 서열을 생성했다6<...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 이집트 고등교육 및 과학연구부(런던 문화교육국)와 UKRI MRC(MR/X502947/1)의 지원을 받았습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 제작되었습니다

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Gel 전기영동용
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065세포 배양 배지
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/A나노포어 앰플리콘 시퀀싱 데이터 처리 및 분석을 위한 Nextflow 워크플로우; 버전 1.2.1은 MinION 데이터의 재현 가능한 분석에 사용되었습니다.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/A나노포어 시퀀싱 리드를 참조 서열에 정렬하고 IGV를 사용한 통합 시각화를 위한 Nextflow 워크플로우; 버전 1.2.3은 MinION 데이터의 재현 가능한 분석에 사용되었습니다.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-F비드 클린업용
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239세포 배양 보충제
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004플로우 셀 세척
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331크기 확인
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041신생아 포경에서 분리한 인간 진피 섬유아세포; 기생충 번식에 사용
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114시퀀싱용 플로우 셀
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101B나노포어 시퀀서; 시퀀싱은 MinKNOW 소프트웨어(v25.09.16)를 사용하여 장치 제어 및 실시간 베이스 호출로 수행됨.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/AMinION Mk1B 장치 제어, 실시간 시퀀싱 및 베이스 호출에 사용되는 소프트웨어; 버전 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24다중 샘플 바코딩
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367DNA 결합
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056어댑터 결합
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058DNA 결합에 사용
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546라이브러리 준비
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581분자 생물학 등급
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5PCR 제품 정제
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122항생제 혼합물
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023세척 버퍼
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492S고정밀도 폴리머라제
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504DNA 추출
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200어댑터 결합 효소
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102DNA 염색 염료
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161젤에 샘플 로드
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056HFF 전환용
1× TAE 또는 1× TBE 버퍼——실행 버퍼
2× PCR 프리믹스——PCR 준비 믹스
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참고문헌

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