영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

요약

우리는 밀리유체 연속 배양 장치(MCCD)에 대한 프로토콜을 제시하는데, 이는 수백 나노몰 농도까지 지속된 저영양 조건이나 시간적 영양분 변동 조건에서 세균 집단을 미세한 시간 척도로 배양할 수 있게 합니다.

초록

자연의 미생물 서식지는 혼합 영양소의 농도가 낮고, 공간적 이질성, 시간적 변동이 특징인 경우가 많습니다. 그러나 전통적인 실험실 배양 방법은 이러한 조건을 재현하지 못합니다. 배치 배양은 저염 환경에서 성장을 지속할 수 없지만, 케모스탯은 단일 제한 영양소로 정상 성장을 유지하지만, 영양소 혼합물의 저농도를 유지하거나 급격한 변동을 도입하려는 목표에서는 구현이 어렵습니다. 마이크로플루이딕 시스템은 동적 환경을 생성하지만 개체군 수준의 옴 분석에 충분한 생체량을 제공하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 안정적이고 변동하는 영양 조건에 대한 미생물 반응을 연구할 수 있는 다목적 플랫폼인 밀리플루이딕 연속 배양 장치(MCCD)를 도입합니다. MCCD는 스테리벡스 필터(0.45 μm 폴리비닐리덴 플루오라이드 [PVDF] 다공성 여과막) 내에 박테리아 집단을 수용하며, 매체의 지속적인 흐름이 안정적인 배양 조건을 유지하면서 영양분 고갈을 방지합니다. 맞춤형 Matlab 소프트웨어를 통해 제어되는 3방향 솔레노이드 밸브 시스템은 정밀하고 미세한 수준의 영양소 변동을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 MCCD를 두 가지 모드에서 작동시키는 단계별 가이드를 제공합니다: (1) 지속적인 영양소 저하 조건과 (2) 변동하는 영양소 조건. 이 시스템을 사용하면, 대장균은 수십에서 수백 나노몰 농도의 아미노산과 핵염기의 혼합물 내에서 기하급수적으로 성장하여 세포 농도는 약 10.9 세포/mL에 도달했습니다. 자연 미생물 서식지의 핵심 특징을 재현함으로써, MCCD는 대장균 및 기타 미생물 종에서 통제되면서도 생태적으로 중요한 조건 하에서 박테리아의 성장과 생리학을 연구할 수 있게 합니다.

서론

자연 서식지의 박테리아는 조성과 농도가 자주 변하는 영양분 지형을 만나며^, 1,2,3,4 등 다양한 시간 척도에 걸쳐 변동할 수 있습니다. 바다⁵, 토양³,^{장과 같은} 환경에서는 미생물 성장이 하나 이상의 필수 영양소에 의해 자주 제약되며, 물리적, 화학적, 생물학적 과정에 의해 영양소 가용성이 변할 수 있습니다^. 이러한 영양분 혼합물과 그 변동은 미생물의 생존과 성장 전략을 촉진하며, 생물^{학적 조직의} 다양한 수준에 걸쳐 반응을 형성합니다.

영양 역학에 대한 미생물의 적응은 군집, 개체군, 단세포 수준에서 일어납니다. 군집 수준에서는 변동이 종 공존을^{촉진하고,} 군집 구성과 대사 활동을 시간적 변이와 조율^{하며, 새로운} 종이 정착할 기회를 창출할 수^{있습니다.} 개체군 수준에서는 영양 조건 변화가 유전^{적 변화를} 선택하거나 표현형 변이(베팅 헤지 전략 포함)를 유도하여 예측 불가능한 조건에서 생존을 개선함으로써 진화를 가속화할 수 있습니다. 단일 세포 수준에서 박테리아는 영양 환경에 반응하여 생리학을 조정합니다^12,13. 최근 보고된 예 중 하나는 변동하는 조건에서 박테리아가 성장 이점을 갖게 하는 특정 생리학적 현상입니다¹⁴. 박테리아는 자주 영양 제한에 직면하기 때문에, 개별 세포로서뿐만 아니라 개체군 또는 군집 내에서 영양 조건이 낮고 변동성이 높은 상태에 어떻게 반응하는지를 연구하는 것이 자연 환경에서 이들의 행동을 이해하는 데 필수적입니다.

케모스탯은 단일 영양소에 의해 제한되는 성장 연구에는 적합하지만, 저농도 혼합물에서 여러 영양소의 농도를 조절하는 것이 목표일 때는 사용하기 어렵습니다. 케모스탯은 잘 조절되고 안정적인 환경을 제공함으로써 박테리아가 영양 제한에 적응하는 과정을 연구하는 데 귀중한 도구였습니다. 하지만 이들의 작용은 본질적으로 성장이 단일 필수 영양소 요소에 의해 제한되는 조건에 제한됩니다. 케모스탯에서는 희석 속도를 조절하여 세포 성장이 제한 영양소 공급에 균형을 맞추도록 하여 개별 영양소 농도가 아니라 성장 속도를 고정합니다¹⁵. 이 틀은 대체 영양소 혼합물—예: 여러 탄소원—이 포함된 환경에는 쉽게 일반화되지 않는데, 희석 속도는 배질 내 각 성분의 농도가 아니라 전체 성장 속도만 조절하기 때문이다^16,17. 그 결과, 개별 영양소의 농도와 그 공동 이용 패턴은 외부에서 처방되는 것이 아니라 미생물의 이용에서 도출됩니다^16,17.

또한, 케모스타터에서는 영양분 변동을 유도할 수 있지만, 일반적으로 큰 배양 부피 때문에 분단위의 급격한 변동이나 단일 이동은 달성하기 어렵습니다. 마이크로플루이딕 장치는 정밀하고 저농도 및 변동하는 영양소 환경을 만드는 강력한 도구로 등장했습니다¹⁴. 비디오 현미경과 결합하면 단일 세포 성장 측정이 가능합니다. 마이크로유체 시스템은 형광 리포터를 이용해 선택된 단백질의 발현을 정량화할 수 있지만, 케모스탯과 달리 일반적인 마이크로플루이딕 장치는 박테리아 집단의 프로테옴 연구를 위한 옴 분석에 필요한 바이오매스를 생산하기에는 너무 작습니다. 이 간극을 메우기 위해 우리는 밀리플루이딕 연속 배양 장치(MCCD)를 개발했습니다.

MCCD는 연속 유동 배양 시스템을 사용하여 충분한 바이오매스를 생성하여 하위 분석을 위한 충분한 생체량을 생성할 수 있는 연속 유동 배양 시스템을 사용하여 통제된 영양소 조건, 즉 최소한의 또는 전혀 고갈이 없는 지속적인 저영양 조건과 변동하는 영양 조건 하에서 박테리아의 성장을 가능하게 합니다. MCCD는 0.45 μm PVDF 필터를 배양 용기로 사용하며, 이 필터에서 배지를 연동 펌프로 지속적으로 보충하여 저장소에서 신선한 배지를 공급합니다(그림 1A). 필터의 다공성 막은 박테리아를 유지하면서도 영양분의 정해진 흐름을 허용하여, 영양소 농도가 낮은 수백 나노몰에서 마이크로몰 범위에서도 영양분 고갈을 방지합니다. 생체량은 유지되는 동안 신선한 배양물이 장치를 통해 지속적으로 흐르기 때문에, MCCD는 세포를 보유하는 동안 배지를 갱신하는 레텐토스탯¹⁸과 유사점을 공유합니다. 그러나 MCCD는 구조와 영양분 전달 방식에서 고전적 리텐토스타트와 다릅니다. 레텐토스타트는 일반적으로 교반된 벌크 반응기로 작동하며, 세포는 잘 혼합된 배양 부피에 매달려 있습니다. 이러한 조건에서 영양소 가용성은 혼합, 확산, 세포 흡수의 균형에 좌우되며, 특히 영양소 농도가 낮고 세포 밀도가 높을 때 국소적 고갈이나 구배가 발생할 수 있습니다. 반면, MCCD에서는 세포가 소용량 스테리벡스 카트리지 내부의 막 위에 직접 조립되어, 몇 개의 세포 두께만 되는 층을 형성하여 지속적으로 유동 배지에 노출됩니다. 카트리지 내부에서는 능동 혼합이 이루어지지 않습니다; 대신 매체는 상류에서 균질화되어 연속 흐름으로 공급됩니다. 영양분은 얇은 세포층을 통한 대류 수송을 통해 공급되며, 확산 거리가 짧고 유량이 높아 국소 영양염 구배가 최소화됩니다. 그 결과, 개체군이 경험하는 영양 조건은 주로 유입 배지의 조성에 의해 결정되어, 교반 유지 시스템보다 더 일관되고 명확한 저영양 조건을 가능하게 합니다.

그림 1: 저농도 또는 변동하는 영양 조건에서 박테리아 배양을 위한 밀리유이딕 연속 배양 장치(MCCD). (A) 일정한 영양 조건을 위한 MCCD 도식. 연동 펌프는 박테리아 세포가 포함된 0.45 μm PVDF 필터를 통해 저장소에서 신선한 배지를 흐르도록 유도합니다. 필터 내 다공성 막은 박테리아를 유지하면서 배지가 통과할 수 있도록 합니다. 연속 매체 흐름은 매우 낮은 영양 농도에서도 필터 내부의 일정한 영양 조건을 유지합니다. (B) 변동하는 영양염 조건에 대한 MCCD 도식. 연동 펌프 상류에 위치한 소프트웨어 제어 3방향 솔레노이드 밸브는 두 저수지(예: 고영양소 농도인 C_High와 저영양소 농도인 C_Low) 간에 매질 유입을 번갈아 가며 조절합니다. 소프트웨어는 밸브의 플런저 위치를 제어하여 활성 유입원을 결정합니다. (C) 일정한 영양 조건을 위한 유체 조립. 세 개의 실리콘 튜브가 관통하는 뚜껑이 신선한 배지를 담은 병을 밀봉합니다. 한 튜브는 통풍 필터에 연결되어 통기하고, 나머지 두 튜브는 필터로 매질을 전달합니다. 바브-메일 루어 피팅은 이 튜브들을 연동 튜빙에 연결하고, 각 연동 튜브를 필터로 들어가는 일방향 체크 밸브에 연결합니다. 필터 출구에는 일방향 체크 밸브도 장착되어 있습니다. 이미지는 각각 하나의 필터에 포함된 두 개의 샘플을 보여줍니다. (D) 변동하는 영양 조건을 위한 유체 조립. 금속 플랫폼에는 마이크로컨트롤러와 전자 부품이 들어 있으며, 맞춤형 MATLAB 소프트웨어를 통해 두 개의 솔레노이드 밸브를 제어합니다. 나사식 바브 피팅은 솔레노이드 밸브의 입구와 출구를 모두 튜빙에 연결한다. 각 밸브에는 두 가지 대체 배지를 위한 두 개의 입구가 있는데, 여기서는 고영양 농도 배지인 C_High(빨간색 라벨 튜브)와 저영양 농도 배지인 C_Low(파란색 라벨 튜브)입니다. 매체는 (C)와 같이 통풍 필터가 있는 뚜껑이 있는 병 안에 담겨 있습니다. 솔레노이드 밸브의 출구는 정상 상태 조립체(C)와 같이 연동 튜브를 통해 필터와 연결됩니다. 이미지는 각각 하나의 필터에 포함된 두 개의 샘플을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

또한, 스테리벡스 필터 상류에 소프트웨어 제어 3방향 솔레노이드 밸브가 도입되면, 사용자는 서로 다른 저장소에 포함된 두 매체 간 매질 흐름을 전환할 수 있습니다(그림 1B). 그 결과, 이 장치는 일정한(저농도 포함) 영양소 상태의 안정적인 환경이나 몇 분 이상 변동 시간 척도의 영양염 변동에 대한 박테리아의 반응을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.

이 프로토콜은 영양소가 부족하거나 영양소가 변동하는 환경에서 박테리아를 연구하기 위한 MCCD의 조립 및 작동을 설명합니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 MCCD의 두 가지 운영 모드인 일정한 저영양 조건과 변동하는 영양 조건에서 대 장균 NCM3722을 이용한 성장 실험을 단계별 안내합니다. MCCD 구성은 다른 영양소 조건과 미생물 종에 쉽게 적응할 수 있어, 자연에서 흔히 볼 수 있는 영양 환경에서 박테리아 생리학을 연구하는 다목적 플랫폼입니다.

프로토콜

1. 지속적인 영양 조건에서의 박테리아 증식

참고: 이 프로토콜은 매우 희석된 리치 디디언 미디엄("저 RDM") 조건에서 대장균 NCM3722의 성장 곡선을 수행하는 절차를 설명합니다. 이 성장 곡선은 12시간 동안 진행되며, 2시간마다 한 번씩 샘플을 채취합니다(총 6개의 시점). 이 프로토콜의 핵심 원리는 각 시점이 단일 스테리벡스 필터(이하 0.45 μm PVDF 필터라고 함)에 해당한다는 점입니다. 샘플을 채취하기 위해 필터 내부의 배양물을 거꾸로 원심분리하여 회수하고, 셀 수를 정량화한 후 필터를 폐기합니다. 각 0.45 μm PVDF 필터는 단 하나의 샘플만 생성합니다. 실험 준비를 위해서는 세 가지 주요 실험 매개변수를 정의해야 합니다: 연동 펌프의 유량, 실험 기간, 그리고 원하는 샘플 수(즉, 0.45 μm PVDF 필터 수)입니다. 초기 유속을 분당 2mL로 설정하세요. 필요에 따라 이 매개변수를 조정하세요(예: 매우 희석된 영양소의 공급을 유지하기 위해 유량을 증가시키는 것).

1. 배지 및 재료의 준비
   참고: 각 필터는 단일 시점 샘플에 해당하므로, 각 0.45 μm PVDF 필터의 실험 실행 시간은 수집 시간에 따라 달라집니다(예: 첫 번째 시점은 2시간, 두 번째 시점은 4시간 등).
   1. 다음 공식을 사용하여 필요한 배양지 부피를 추정합니다
      ,
      여기서 n 은 샘플 수(0.45 μm PVDF 필터), Q 는 유량(mL/min), t_i 는 각 샘플의 실험 실행 시간(분 단위)입니다.
   2. 유량 변동을 반영하여 추가로 20%의 부피를 포함하기 위해 1.2를 곱합니다. 이 예시에서는 계산을 하겠습니다.
      
   3. 계산된 부피를 반올림하여 (예: 이 예에서 6,200 mL를 준비).
   4. 멸균 재료를 준비하세요( 표 1 참조).
      참고: 실험 전날에 재료를 준비하고 멸균하여 준비 상태를 유지하고 지연을 최소화하세요. 이 재료들은 단방향 루어 밸브를 제외한 오토클레이브; 밸브를 70% 에탄올로 멸균하세요.
      1. 여섯 개의 실리콘 연동 운동 튜브 양 끝을 "Male Luer to Barb" 플라스틱 피팅에 연결하는데, 피팅의 바브 쪽 끝을 튜브에 삽입합니다. 수컷 루어 끝부분은 알루미늄 호일로 덮어 오염을 방지하세요.
         참고: 실험에서 6개의 0.45 μm PVDF 필터를 사용하기 때문에 6개의 연동 튜브가 준비되었습니다. 모든 튜브는 이후 동일한 연동 펌프 헤드에 장착되어 모든 필터가 동일한 흐름을 받게 됩니다.
      2. 튜브를 닫힌 멸균 용기에 넣으세요.
      3. 통풍구 필터를 밀폐된 멸균 용기 안에 넣으세요.
      4. 실리콘 튜브가 뚜껑을 통과하는 튜브 병뚜껑을 닫고 멸균 가능한 용기에 넣으세요.
         참고: 이 프로토콜에 사용되는 튜브형 병뚜껑에는 캡을 가로지르는 세 개의 튜브가 장착되어 있습니다: 0.45 μm PVDF 필터에 매질을 전달하기 위한 동일한 직경의 튜브 두 개와 직경이 더 넓은 세 번째 튜브입니다. 이 튜브들은 캡에 단단히 고정되어 있어 분리할 수 없습니다.
      5. 12개의 일방향 루어 체크 밸브를 70% 에탄올 용액에 담근 후 하룻밤 동안 소독하세요.
         참고: (멈춤 지점) 멸균된 재료는 실험 전 최대 24시간 동안 실온에 담근 채 밀봉하여 보관할 수 있습니다. 사용 전에 에탄올에서 밸브를 제거하고 멸균된 초순수수로 잔류 에탄올을 제거하세요. 또는 체크 밸브는 오토클레이버 소재를 사용해 3D 프린팅하여 에탄올 처리 대신 오토클레이빙으로 멸균할 수 있습니다.
   5. 표준 실험실 기구 설정으로 연동 물질 튜브, 환기 필터, 병뚜껑, 눈금식 실린더, 병을 오토클레이브합니다.
   6. 표 2에 나열된 시약을 혼합하여 6,200mL의 저농도 정의 배지(RDM; 재료표 참조)를 준비합니다.
      참고: 실험 당일, 사전 배양 시작 후 약 5시간 대기 기간 동안 배지를 준비하세요(1.2.1 단계 참조). 이렇게 하면 중간 정도의 신선도를 유지하고 오염 위험을 최소화합니다.
2. 박테리아 전배양 준비
   참고: 실험을 시작할 때 지수 단계의 프리컬처를 사용하세요. 이 단계에서 박테리아는 일정한 속도로 성장하며, 세포 구성 요소를 균형 있게 합성하고 정의된 세포 덩어리에서 분열합니다. 변동성을 최소화하고 시작 생리학적 상태를 표준화하기 위해 지수적 위상 세포를 사용하세요.
   1. 실험 전날, 다음과 같이 하룻밤(ON) 배양을 준비합니다: 멸균된 15mL 배양관에 대 장균 NCM3722 냉동 글리세롤 스톡과 함께 3mL 전액 RDM을 접종합니다. 배양물을 37°C에서 하룻밤(~16시간) 배양하고, 진동 인큐베이터에서 200rpm으로 흔듭니다.
      참고: (멈춤 지점) ON 배양이 인큐베이터에 들어가면 이날에는 추가 절차가 진행되지 않습니다. 다음 날 프로토콜을 재개하여 1.2.2 단계로 진행하세요.
   2. 실험 당일에는 다음과 같이 전배양물을 준비합니다: 6 μL ON 배양물을 6 mL의 완전한 RDM에 첨가합니다. 15mL 배양관 두 개로 균등하게 나누어 A와 B로 표기합니다. 두 튜브를 37°C에서 200rpm에서 흔들어 배양합니다.
      참고: 사전 배양은 일반적으로 지수 단계(OD₆₀₀ ≈ 0.5)에 도달하는 데 약 5시간이 소요됩니다. 이 기간을 이용해 신선한 배지를 준비하세요(1.1.6 단계 참조). OD₆₀₀ 이 약 0.5에 도달할 때까지 1.2.3 단계로 진행하지 마세요.
   3. 튜브 B를 사용해 600 nm에서 광학 밀도(OD)를 모니터링합니다. OD₆₀₀ 이 약 0.5에 도달하면 실험을 진행하며, 이는 대 장균 NCM3722의 완전한 RDM 기하급수적 성장을 나타냅니다(1.4절 참조).
      참고: 재현성을 높이고 시작 조건을 표준화하기 위해 실험을 지수 위상 세포로 시작하세요.
3. 영양 조건이 일정한 MCCD에서 실험 준비
   참고: 전배양이 성장하기 시작한 직후 멸균된 생물안전 캐비닛 내에서 1.3.1부터 1.3.5까지 단계를 수행하십시오.
   1. 각 병에 총 중간 용량을 할당하세요.
      참고: 병은 중간 용량의 저장소로 사용하세요. 병뚜껑에 두 개의 중간 공급 튜브가 장착되어, 각 튜브가 0.45 μm PVDF 필터 하나에 매질을 공급합니다. 실험 기간 동안 각 시간점 샘플(즉, 각 0.45 μm PVDF 필터)에 필요한 양에 따라 총 매체 부피(1.1.6단계에서 준비됨)를 병들에 할당합니다.
      1. 1.1.1 단계에서 제공된 공식을 사용하여 각 0.45 μm PVDF 필터에 필요한 배질 부피를 결정합니다. 예를 들어, 다음 용어들을 사용하면:
         
         각 시점별로 필요한 총 배지 부피는 시간 순서로 288, 576, 864, 1152, 1440, 1728 mL입니다.
      2. 계산된 매체 부피를 병에 분산시키고, 두 시점에 필요한 부피를 하나의 병에 모으세요. 예를 들어: 1L 병 1개에 ~900 mL(시점 1, 2), 2.5L 병 2,100 mL(시점 3, 4), 4 L 병 중 ~3200 mL(시점 5, 6).
   2. 각 병을 튜브 병뚜껑으로 밀봉하세요(그림 1C). 누수를 막기 위해 캡을 단단히 조이세요.
   3. 튜브 병뚜껑에서 뻗어나가는 가장 넓은 실리콘 튜브에 0.2 μm 벤트 필터를 연결합니다(그림 1C). 이로 인해 실험 중 무균 공기 교환이 가능합니다.
   4. 각 연동 튜브의 한쪽 끝(이미 피팅이 부착된 상태; 재료 준비에 관한 1.1.4절 참조)을 튜브 병뚜껑에서 뻗어나오는 소구경 실리콘 튜브에 부착합니다(그림 1C). 무균을 유지하기 위해 안전한 연결을 유지하세요. 실험이 시작될 때까지 자유로운 남성 루어 잠금 피팅의 알루미늄 호일 커버는 그대로 두어 오염을 방지하세요.
   5. 병과 조립된 튜브, 연동 펌프를 37°C로 설정한 인큐베이터에 넣으세요. 튜빙을 연동 펌프 헤드의 채널에 고정하세요.
      참고: 모든 연동 튜브는 단일 연동 펌프의 동일한 펌프 헤드에 장착되어 있어, 모든 0.45 μm PVDF 필터가 동일한 펌프에서 매질을 받습니다. 단일 펌프를 사용하면 필터 간 유량이 동일해지고, 펌프 간 차이로 인한 변동을 방지할 수 있습니다.
4. MCCD에서 일정한 영양 조건이 유지되는 실험 프로토콜
   1. 600 μL 전배양물을 5.4 mL의 신선한 저 RDM에 첨가하여 전배양(OD = 0.5)을 1:10으로 희석합니다.
   2. 1 mL 피펫을 사용해 희석된 전배양 후 1mL를 6개의 0.45 μm PVDF 필터 각각에 주입합니다.
   3. 일방향 체크 밸브는 오토클레이브된 초순수수로 헹구고, 각 0.45 μm PVDF 필터 양 끝에 하나씩 부착하세요.
   4. 연동 튜브 피팅에서 알루미늄 호일 커버를 제거하세요.
   5. 6개의 0.45 μm PVDF 필터 각각을 연동 튜빙에 장착된 Male Luer 피팅에 연결하세요(그림 1C).
   6. 연동 펌프의 유량을 분당 2mL로 설정하고 흐름을 시작하세요. 이 순간을 시간 0으로 정의하세요.
   7. 0.45 μm PVDF 필터 아래에 폐기물 수용소를 설치하여 유출물을 수집합니다.
      참고: 그림 2A 는 인큐베이터 박스 안에서 실험의 전체 조립 모습을 보여줍니다.
5. 샘플 채취
   1. 2시간 후, 1L 병에 연결된 두 개의 0.45 μm PVDF 필터 중 하나를 뽑으세요.
   2. 일방향 체크 밸브를 풀고 0.45 μm PVDF 필터를 50mL 원심분리관에 넣으세요. 입구는 아래를 향하게 합니다.
   3. 0.45 μm PVDF 필터가 포함된 원심분리관을 2,000 × g 에서 2분간 원심분리합니다.
   4. 파이프 커터를 사용해 출구에 가장 가까운 플라스틱 케이스 끝에 부드럽게 압력을 가해 0.45 μm PVDF 필터를 열게 합니다.
      참고: 0.45 μm PVDF 필터를 열 때 오염을 방지하기 위해 사용 전에 파이프 커터를 70% 에탄올로 닦아내어 소독하세요.
   5. 다공성 막을 담고 있는 내부 실린더를 해제하고, 막을 고정하는 필터 부분을 폐기합니다.
   6. 0.45 μm PVDF 필터 인케이스(흐름 방향에 수직인 벽)의 내부 벽을 원심분리관에 수집한 배양 배지로 헹군습니다.
      참고: 이 단계는 원심분리 중 벽에 갇힌 세포를 수집하도록 보장합니다.
   7. 5mL 혈청학적 피펫으로 채취된 총 부피를 측정합니다.
   8. 이후 시점(4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간)에는 해당 0.45 μm PVDF 필터를 분리하고 1.5.2–1.5.6 단계를 반복합니다. 다음 순서를 따라주세요:
      1. 4시간에 1L 병에 연결된 두 번째 0.45 μm PVDF 필터를 분리합니다.
      2. 6시간과 8시간에는 2.5L 병에 연결된 0.45 μm PVDF 필터를 분리하세요.
      3. 10시간과 12시간에는 4L 병에 연결된 0.45 μm PVDF 필터를 분리하세요.
         참고: 샘플링 시간 시점을 1.3.1단계에서 분배된 중간 부피와 일치시키기 위해 다음 순서를 따르십시오.
6. 하류 분석
   1. 각 샘플에서 100 μL 알리코트 세 개를 추출해 글루타알데히드로 최종 농도가 1.5%로 고정됩니다.
      주의: 글루타알데히드는 독성이 있으며 강한 자극제이며 잠재적 감작제가 될 수 있습니다. 화학 연기 후드 안에서 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 니트릴 장갑, 안전안경)를 착용하세요. 피부 접촉과 흡입은 피하세요. 글루타알데히드 함유 폐기물은 기관의 유해 화학 폐기물 규정에 따라 처리해야 합니다.
   2. 형광 DNA 염료로 표지한 후 플로우 사이토메트리로 마이크로리터당 세포 수를 세는 고정된 샘플을 사용하세요.
      주의: 형광 DNA 염료는 돌연변이를 유발할 수 있습니다. 장갑을 착용하고 염료 함유 폐기물은 기관 생물안전 규정에 따라 처리하세요.
      참고: DNA 염색과 유세포 분석의 대안으로, 소량의 샘플을 농도-중량 한천 플레이트(예: LB 한천)에 플레이트하고 콜로니 형성 단위(CFU)를 계수하여 세포 밀도를 추정할 수 있습니다.
   3. 마이크로리터당 셀 수에 1.5.7단계에서 측정한 총 부피를 곱하여 0.45 μm PVDF 필터 내에 포함된 셀 수를 계산합니다.
   4. 남은 부피를 1.5mL 마이크로 원심분리관에 10,000 × g 에서 4분간 원심분리합니다.
   5. 상정액을 제거하세요.
   6. 세포 펠릿은 향후 분석(예: 전사체학)을 위해 -80 °C에 저장하세요.

그림 2: MCCD의 실험적 조립. (A) 일정한 영양 조건을 위한 MCCD 설치 사진. 이 장치는 일정한 온도를 유지하기 위해 인큐베이터 박스 안에 보관되며, 폐기물 받침대가 흐름 매체를 모아줍니다. (B) 변동하는 영양 조건을 위한 MCCD 설치 사진. 빨간 테이프로 표시된 병에는 고영양 농도의 매체(C_High)가 들어 있고, 파란색 테이프로 표시된 병에는 저영양 농도의 매체(C_Low)가 들어 있습니다. 중앙의 금속 플랫폼은 영양분 변동을 조절하는 구성 요소들을 지지하며, 이는 그림 1D에 설명된 것과 일치합니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

2. 영양소 변동 조건에서의 박테리아 증식

1. 솔레노이드 밸브용 컨트롤러 조립
   참고: 3방향 솔레노이드 밸브는 MATLAB에서 개발된 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 실행하는 컴퓨터에 연결된 마이크로컨트롤러 기반 스위칭 회로를 사용하여 제어합니다.
   1. 솔레노이드 밸브 제어 회로를 조립하세요(그림 3A).
      1. 마이크로컨트롤러의 디지털 출력 핀을 1 kΩ 저항을 통해 NPN 트랜지스터의 베이스에 연결합니다.
      2. 트랜지스터의 컬렉터를 솔레노이드 밸브의 음극 단자에 연결합니다.
      3. 트랜지스터의 이미터를 접지에 연결하세요.
      4. 솔레노이드 밸브의 양극 단자를 밸브 전압과 호환되는 외부 DC 전원 공급 장치에 연결하세요.
      5. 솔레노이드 단자 위에 다이오드를 설치하세요. 다이오드의 줄무늬 쪽을 양극 공급선에 연결하세요.
         참고: 다이오드는 솔레노이드가 꺼졌을 때 발생하는 전압 스파이크를 억제합니다.
   2. 플라스틱 '나사산 호스 바브' 피팅을 솔레노이드 밸브에 부착하여 바브 끝이 바깥쪽으로 뻗도록 하세요.
   3. USB 연결이 가능한 컴퓨터에 MATLAB R2022b 또는 그 이후의 파일을 설치하세요.
   4. 마이크로컨트롤러 하드웨어와의 직렬 통신에 필요한 MATLAB 지원 패키지를 설치하세요.
   5. USB 케이블을 이용해 마이크로컨트롤러 보드를 컴퓨터에 연결하여 직렬 통신을 시작합니다.
   6. MCCD에서 변동하는 영양소 조건을 생성하는 데 사용되는 MATLAB 기반 GUI를 열어 보세요(링크 https://github.com/juanitaLara/MCCD 에서 확인할 수 있습니다).
   7. 솔레노이드 밸브와 MATLAB GUI 플랫폼 간 연결을 확인하세요:
      1. Matlab에서 GUI 플랫폼을 열고 Connect 버튼(그림 3B)을 클릭하세요. 명령 창에 ' 컨트롤러 성공적으로 연결됨' 이라는 메시지가 뜰 때까지 기다립니다.
      2. 자동 조작 패널 아래에서 시간 단계(예: High 및 Low 단계는 5초)를 입력합니다.
      3. 솔레노이드 밸브를 관찰하고 두 매체를 전환할 때 나는 클릭 소리를 들어보세요.
      4. 시계를 사용해 솔레노이드 밸브가 지정된 간격(예: 5초마다)에 정확히 전환되는지 확인하세요.
         참고: 각 실험 전에 이 검증을 수행하여 통신 여부와 올바른 밸브 스위칭을 확인하세요. (잠시 멈춤) 솔레노이드 밸브 작동을 확인한 후, 시스템은 인큐베이터 내에서 몇 시간 동안 조립된 상태로 남아 있다가 실험을 시작할 수 있습니다.
2. 미디어 및 재료 준비
   참고: 이 프로토콜은 영양소 조건을 낮고 높은 RDM을 번갈아 가며 1시간(높은 RDM 30분, 저 RDM 30분) 진행하는 것을 포함합니다. 실험은 3시간 동안 변동하며 두 가지 샘플을 수집합니다: (1) 3시간 1분 (높은 RDM 단계, 저음에서 높은 음으로 전환 직후), (2) 3시간 31분 (낮은 RDM 단계, 고음에서 낮은 음으로 전환 직후).
   1. 실험 단계별로 필요한 배양 배지 부피를 추정합니다.
      1. 먼저, 처음 3시간(세 번의 완전한 변동 기간) 동안 필요한 부피를 계산하세요:
         낮은 RDM 부피 = 1.2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[0.45 μm PVDF 필터] = 432[mL]
         높은 RDM 부피 = 1.2 × 2[mL/min] × 90[분] × 2[0.45 μm PVDF 필터] = 432[mL]
      2. 마지막 30분 단계에 필요한 부피를 계산하세요:
         높은 RDM 부피 = 1.2 × 2[mL/min] × 30[분] × 1[0.45 μm PVDF 필터] = 72[mL]
      3. 부피를 편리한 값으로 반올림하세요(예: 저 RDM 500 mL, 고 RDM 600 mL).
   2. 오토클레이브 멸균 재료를 준비하려면 1.1.4 – 1.1.5 단계를 따라 합니다( 표 3 참조).
      참고: 실험 당일 지연을 최소화하고 준비 상태를 유지하기 위해 실험 전날 재료를 준비하고 멸균하세요(단계 2.2.3 및 2.2.4). 이 방식은 일정 영양 실험과 비교할 때, 매체 병을 솔레노이드 밸브에 직접 연결하기 위해 추가 튜빙이 필요합니다(그림 1B,D). 이 튜브들은 솔레노이드 밸브 피팅이 미리 조립되어 있어 'Barb to Male Luer' 피팅 하나만 필요합니다. 이 튜브 끝을 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이핑을 하세요.
   3. 준비된 연동 물질 튜브, 배기 필터, 캡, 눈금 실린더, 병을 오토클레이브에서 멸균하세요.
   4. 70% 에탄올 용액에 루어 일방향 체크 밸브 4개를 담그고 하룻밤 동안 소독하세요.
      참고: (멈춤 지점) 멸균된 체크 밸브는 에탄올에 하룻밤 동안 담근 상태로 보관할 수 있으며, 실온에서 최대 24시간 밀봉된 상태로 보관할 수 있습니다. 사용 전에 밸브를 멸균된 밀리-Q 물로 헹구세요.
   5. 솔레노이드 밸브를 70% 에탄올로 3–5회 세척한 후 초순수수 3–5회 세척하여 소독하세요.
   6. 실험 당일, 전배양 준비 후 약 5시간 대기 기간(2.3단계 참조) 표 4에 나열된 시약을 혼합하여 저 RDM 500 mL와 고RDM 600 mL를 준비합니다.
      참고: 실험 당일에 배지를 준비하면 신선도를 유지하고 오염 위험을 최소화할 수 있습니다.
3. 박테리아 전배양 준비
   1. 1.2단계에서 설명한 단계를 따르세요.
4. 영양소가 변동하는 MCCD 내 실험 준비
   참고: 사전 배양 재배가 시작된 직후 멸균 생물안전 캐비닛 내에서 2.4.1–2.4.4단계를 수행하십시오.
   1. 각 미디엄을 1리터 병에 넣으세요.
   2. 세 개의 포트가 장착된 조립된 캡과 미리 설치된 실리콘 튜브로 병을 밀봉하세요. 누수를 막기 위해 캡을 단단히 조이세요.
   3. 각 병뚜껑의 포트 중 하나에서 뻗어나온 넓은 실리콘 튜브에 0.2 μm 벤트 필터를 연결하세요.
   4. "입구 튜브"( 그림 1D에 표시됨)를 튜브가 있는 병뚜껑에서 뻗어나오는 실리콘 튜브에 연결한 후 솔레노이드 밸브에 연결하세요:
      1. 실리콘 튜브의 한쪽 끝(한 개의 피팅만 연결된 상태)을 낮은 RDM 병뚜껑에서 뻗은 튜빙에 연결하세요.
      2. 알루미늄 호일 커버는 병을 인큐베이터로 옮길 때까지 자유로운 Male Luer 잠금 피팅에 그대로 두어 오염을 방지하세요.
      3. 높은 RDM 병에 대해 2.4.4.1 단계를 반복합니다.
   5. 병과 조립된 '입구 튜브', 연동 펌프, 솔레노이드 밸브와 컨트롤러를 37°C로 설정한 인큐베이터 안에 넣습니다.
   6. "입구 튜브"(2.4.4 단계에 부착됨)를 솔레노이드 밸브의 입구에 다음과 같이 연결하세요:
      1. 저용량 RDM 병에서 나오는 두 개의 튜브를 각 솔레노이드 밸브의 두 개 인렛 중 하나( 그림 1D에 파란색 테이프로 표시된 튜브)에 연결하세요.
      2. 높은 RDM 병에서 나오는 두 개의 튜브를 각 솔레노이드 밸브의 두 개 입구 중 하나( 그림 1D에 붉은 테이프로 표시된 튜브)에 연결하세요.
   7. 각 솔레노이드 밸브의 출구에 연동 펌프 호환 실리콘 튜브(단일 피팅만 있음)를 연결하세요(그림 1D). 실험이 무균을 유지하기 시작할 때까지 알루미늄 호일 커버는 자유로운 남성 루어 잠금 피팅에 그대로 두세요.
5. 변동하는 영양소 조건을 가진 MCCD 실험 프로토콜
   1. 솔레노이드 밸브와 Matlab 소프트웨어 간의 연결을 2.1.7 단계를 수행하여 확인하세요.
   2. 변동에 대한 원하는 시간 단계 값을 Matlab GUI 플랫폼에 입력하세요: High RDM에서는 1800초(30분), Low RDM에서는 1800초(30분)의 시간 단계를 입력합니다.
   3. 시작 메뉴에서 Low를 선택하여 낮은 RDM 조건에서 시작하세요(그림 3).
   4. 1.4단계에서 설명한 두 개의 0.45 μm PVDF 필터에 씨를 뿌립니다.
   5. 실험을 시작하세요.
      참고: 그림 2B 는 이 실험의 완전한 유체 조립체를 보여줍니다.
6. 샘플 채취
   1. 1.5단계처럼 샘플을 채취하세요. 첫 번째 0.45 μm PVDF 필터는 3시간 1분에, 두 번째는 3시간 31분에 수확합니다.
      참고: 먼저 필터 중 하나를 뽑으세요; 두 필터 모두 동일한 매체를 공급받습니다.
7. 하류 분석
   1. 1.6단계에서 설명한 단계를 따라 유세포분석을 통해 세포 수를 세고, 후속 분석(예: 전사체학)을 위해 샘플을 처리 및 저장합니다.

그림 3: 영양분 변동을 가하는 솔레노이드 밸브 제어기. (A) 솔레노이드 밸브를 제어하는 전자 회로의 배선도. 회로는 마이크로컨트롤러 보드, 스위칭 소자로 사용되는 트랜지스터, 트랜지스터 베이스에 연결된 저항기, 그리고 밸브 스위칭 시 발생하는 전압 스파이크로부터 회로를 보호하기 위해 솔레노이드 밸브 위에 배치된 플라이백 다이오드로 구성되어 있습니다. 마이크로컨트롤러는 트랜지스터를 제어하며, 트랜지스터는 다시 솔레노이드 밸브에 공급되는 전력을 전환합니다. 참고문헌 ²⁰ 에서 허가를 받아 각색함.(B)마이크로컨트롤러 보드를 GUI를 실행하는 컴퓨터와 솔레노이드 밸브가 요구하는 전압의 전원 공급원에 연결 한 후, Connect 버튼을 클릭하여 통신이 이루어집니다. 밸브는 수동 조작 패널을 통해 수동으로 조작할 수 있으며, 사용자가 비행할 매체(예: "높음" 또는 "낮음")를 선택할 수 있습니다. 또는 자동 운영 패널을 통해 각 단계별 초기 매체와 시간 단계(초 단위)를 지정하고(고, 저), 시작 버튼을 클릭하여 작업을 시작할 수 있습니다. 실시간 모니터는 시간에 따라 스텝 함수(0 = Low, 1 = High)를 표시하여, 이전 몇 초 동안 어떤 매질이 솔레노이드 밸브를 통해 필터로 흐르고 있었는지 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

본 연구에서는 MCCD를 사용하여 세 가지 RDM 농도에서 일정한 저영양 조건에서 대장균 NCM3722의 성장 속도를 정량화하였습니다. 이 농도들은 Neidhardt¹⁹가 설명한 풍부한 정의 배지(RDM) 공식에서 유래했으며, 아미노산과 뉴클레오베이스 보충제는 각각 원래 제형의 0.5%, 0.25%, 0.01%로 희석되었습니다.

각 배지에서 성장률을 정량화하기 위해 복제 성장 실험이 수행되었습니다. 0.5% RDM과 0.25% RDM 조건에 대해, 각각 4개의 Sterivex 필터를 사용하여 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 동안 세 번의 반복 실험을 수행했습니다. 0.01% RDM 조건에서 세포가 더 느리게 성장했기 때문에, 실험 기간은 12시간으로 연장되었고, 6개의 0.45 μm PVDF 필터를 2시간마다 샘플링했습니다. 우리는 0.1% RDM 조건에서 두...

토론

자연 환경의 영양 복잡성을 포착하는 박테리아 배양 방법은 단순한 실험실 환경을 넘어 미생물 생리학 연구를 발전시키는 데 필수적입니다. 자연 생태계는 넓은 농도 범위를 아우르는 영양소 혼합물을 포함하며, 이는 최대 성장률인 1,3,4,21,22,23 을 지원하지 못하는 경우가 많습니다. 더불어, 영양소 가용성은 시간에 따라 변동할 수 있으며, 때로는 박테리아 생성²⁴배와 비슷하거나 그 이하의 시간 척도에서 변동할 수 있습니다. 그 결과, 박테리아는 영양소 조성과 시간적 역학 모...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1K Ohm Resistor	BC Robotics	ELC-021	Power Rating: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A
3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubing	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatible with peristaltic pump used
3-way Solenoid valves	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminum foil			Suitable for autoclaving
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottles	Nalgene	2162-0531	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cap closure with three ports – for 4 L bottle	Nalgene	2162-0830	Or different company (make sure they fit the selected bottles)
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge that fits 50 mL Falcon tubes
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Centrifuge that fits 1.5 and 2 mL eppendorf tubes
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Falcon tube
Culture tubes (14 mL, sterile)	Greiner bio-one		Culture tubes
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Dilute to 70%
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Graduated cylinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	Or different company
Incubator box			Custom-built incubator box – contact corresponding authors for construction details
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Available at Darwin Microfluidics
Male Luer-to-barb fitting	Aldrich	Z277142	Male Luer-to-barb adapter compatible with 0.8 mm ID tubing (see Figure 1C)
Male Luer-to-threaded fitting	Aldrich	Z277142	Used to connect the solenoid valve to the "inlet tubing" (see Figure 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b or later	Software to run the custom-made software for the solenoid valves
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS medium for Enterobacteria
One-way Luer check valve	Masterflex	30505-92	Prevents backflow into medium reservoirs
Pipe cutter - 0-37 mm	KS Tools	2222051	Or different company
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 in	Nalgene	8060-0020	Inner diameter 1/16 in (1.6 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 in	Nalgene	8060-0030	Inner diameter 1/8 in (3.2 mm); used for fluctuating-nutrient experiments
Polypropylene copolymer bottle - 1 L	Nalgene	2126-1000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 2 L	Nalgene	2126-2000	Or different company
Polypropylene copolymer bottle - 4 L	Nalgene	2126-4000	Or different company
Serological pipette - 5 mL	Corning	CLS4487	Or different company
Solderless Breadboard	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563	Nucleic acid stain for cell counting in flow cytometer
TIP120 Darlington Transistor	BC Robotics	TRN-005
Tubes - 1.5 mL	Eppendorf	3810X	Tubes for centrifuging cell cultures and storing pellets
Vent filter	Millex	SLFG05000	0.2 µm hydrophobic vent filter
Waste receptacle			Volume capacity should be at least the total media volume to be used in the experiment