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모든 동물 실험은 지케이 대학교 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 2023–034C1)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 파일럿 타당성 조사로 설계되었습니다. 대규모 검증 전에 이 매우 섬세하고 새로운 후방 케이지 삽입의 기술적 타당성을 평가하기 위해, 윤리 지침에 따라 초기 기술 평가 중 동물 사용을 최소화하기 위해 단일 동물(n = 1)을 사용했습니다. 척추 융합 연구의 표준 균주로 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐가 선정되었습니다. 포함 기준은 8주에서 10주 사이의 건강한 남성, 체중 200–250g 사이였으며, 추간판 높이(1.8–2.2 mm)가 2mm 케이지와 호환되도록 했습니다. 적응 기간 동안 10% 체중 감소, 활동 감소, 또는 꼬리 기형이 눈에 띄는 동물은 제외되었습니다.> 이 연구를 위해 수컷 스프래그-도울리 쥐(8주, 몸무게 221.8g; 일본 SLC, 시즈오카, 일본)이 사용되었습니다. 동물은 25°C, 상대습도 50%(허용 범위 30–70%)의 통제된 환경에서 12시간의 빛과 어둠 주기를 가졌으며, 자유롭게 물을 마시고 표준 설치류 식단을 제공받았습니다. 쥐들은 환경 풍요를 위해 둥지 재료와 씹는 막대기가 제공되는 견고한 바닥 우리에 보관되었습니다. 수술 전 3일간의 적응 기간이 시행되었습니다. 케이지 동료가 꼬리 이식물을 갉아먹는 것을 방지하기 위해, 이 실험 설계에서 쥐는 단일 하우징 환경에서 유지되었습니다.
나사 및 판 준비
수술 전에 내부 고정 재료가 준비되었습니다. 상업적으로 구할 수 있는 스테인리스 스틸 나사(원래 직경: 1.2mm, 길이: 14mm)는 와이어 커터를 사용해 정확한 길이인 6mm로 절단되었습니다(그림 1A). 이 나사들은 표준 증기 오토클레이빙으로 121°C에서 20분간 멸균되었습니다. 폴리옥시메틸렌(POM) 내부 고정판(길이 18mm, 너비 3mm, 두께 1mm)에서는 직경 1.2mm의 나사 구멍을 수동 드릴로 12mm 간격으로 12mm씩 뚫었습니다(그림 1B–D). 이후 POM 판의 모서리를 와이어 커터로 둥글게 다듬어 주변 연조직에 대한 자극을 최소화했습니다(그림 1E). 판은 고분자의 열 민감성을 고려해 에틸렌 옥사이드(EtO) 가스 또는 과산화수소 가스 플라즈마로 멸균되었습니다. 티타늄 케이지는 직경 300–500 μm 크기의 세로 채널이 연결된 상호 연결된 격자 구조를 특징으로 합니다. 표면은 라멜라 3D 티타늄 기술을 사용해 3–5 μm의 미세면 거칠기를 달성하여 직접적인 뼈 성장을 촉진합니다.
마취 및 외과 절차
불필요한 대사 스트레스를 피하기 위해 수술 전 단식은 시행되지 않았습니다. 마취는 메데토미딘(0.15 mg/kg), 미다졸람(2 mg/kg), 부토르파놀(2.5 mg/kg)으로 구성된 삼중 마취 혼합제를 통해 유도되었으며, 25게이지 바늘23을 이용해 피하 주사로 배 뒤에 투여하였다. 충분한 외과적 마취 평면을 15분마다 평가하여 발가락 철수 반사(발가락 압박) 상실을 확인하고, 분홍색 점막을 유지하며, 호흡 속도(분당 70–110회)를 모니터링하였다. 이후 꼬리척추 체간 융합술이 시행되었습니다. 동물은 엎드린 자세(그림 2A)로 놓았고, 꼬리 전체는 멸균 필드를 보장하기 위해 3차례 번갈아 사용하는 스크럽 프로토콜(에탄올 70%, 포비돈-요오딘 스크럽, 70% 에탄올)을 통해 소독했습니다. 목표 척추를 확인하기 위해 천골 원위부에서 시작해 수동 촉진을 수행하였다. 첫 번째 이동 접합부는 천골-CO1 접합부로 확인되었고, 바로 앞쪽 구간은 Co2로 지정되어 Co2–Co3 표적 부위를 정의했습니다. 등쪽 측면에 약 2cm 길이의 세로 절개가 이루어졌으며, 두 번째 꼬리척추에서 세 번째 후쪽 척추(Co2–Co3)(그림 2B)까지 이어져 각 척추의 뒤쪽 표면을 노출시켰다. 노출 중에는 등쪽 꼬리정맥의 손상을 식별하고 방지하는 데 주의가 기울었으며; 둔기 박리와 양극성 전기소작술이 경미한 출혈 관리에 사용되었습니다. 융합 부위를 준비하기 위해 Co2와 Co3 척추 사이의 섬유 고리를 메스로 절개했습니다(그림 2C). 섬유 고리와 치수핵은 큐렛과 작은 겸자를 이용해 큐레타지(curettage)를 통해 정성스럽게 제거했습니다(그림 2D). 이 단계는 고배율 수술용 확대율(≥3.5배)에서 수행되었습니다. 제거의 완전성은 점상 출혈('혈이 묻은 종판' 징후)의 시각적 확인과 잔여 연조직의 완전한 부재로 객관적으로 정의되었습니다. 용납할 수 없는 말판 손상은 전체 면적의 25%> 깊은 침식이나 0.5mm > 관통된 말판 손상으로 정의되었습니다. 티타늄 케이지(단면도 2× 높이, 높이 2mm)(그림 2E)가 이후 추간간공간 깊숙이 삽입되어 물리적 정지에 도달하고 두 종단판과 전면이 시각적으로 접촉하는 것을 확인하여 견고한 간섭 적합을 만들었습니다(그림 2F, 2G).
고정 및 상처 봉합
판 고정을 용이하게 하기 위해, Co2 및 Co3 척추의 지정된 구멍 부위 주변 뼈 표면은 2.0mm 구형 파일 버가 장착된 7,800 RPM의 전기 휴대용 라우터를 사용해 평평하게 만들었습니다(그림 2H). 뼈 구멍은 플라스틱 내부 고정판의 나사 구멍에 대응하는 간격으로 1.2mm 직경의 드릴 비트가 장착된 손 드릴을 사용해 개별적으로 뚫었습니다(그림 2I). 그 후 두 개의 6mm 스테인리스 스틸 나사를 구멍에 미리 장착했습니다. 플라스틱 플레이트의 모습(그림 2J). 나사는 90° 각도로 삽입되어 표준 깊이 5mm, 중심 간 간격은 12mm로 설정되었습니다(그림 2K). 마지막으로 피부 절개 부위를 4-0 나일론 봉합사로 봉합하고, 꼬리를 70% 에탄올로 다시 소독하여 시술을 마쳤습니다.
수술 후 관리 및 안락사
즉각적인 회복 단계(0일차) 동안 동물은 15분마다 모니터링되었고, 완전한 흉골 누워 있고 목적 있는 보행 가능해질 때까지 직장 온도를 유지했습니다. 장기 평가(1주차부터 12주차까지)에는 체상태 점수(BCS), 미용 상태, 일반 활동을 기반으로 한 일일 점수 체계가 도입되었으며, 감염 또는 열림 여부를 매일 수술 부위 모니터링하였습니다. 처음 48시간 동안 우리 바닥에는 습한 먹이가 제공되었습니다. 체중은 매주 측정했습니다. 조기 안락사의 인도적 평가 지표는 엄격히 다음과 같다: 체중 감소≥20%), BCS ≤2.0, 12시간 > 지속적 음식/물 섭취 불가, 심한 통증/호흡곤향 징후, 또는 괴사와 같은 심각한 수술 부위 합병증. 이 기준을 충족하는 동물들은 24시간 이내에 인도적으로 안락사되었습니다. 수술 후 치료에는 수술 직후 근육주사로 세팔렉신(15 mg/kg)을 투여하고, 수술 후 24시간에 감염 방지를 위해 투여하는 것이 포함되었습니다. 진통을 위해 카프로펜(2 mg/kg)은 수술 직후 피하 투여와 수술 후 12시간, 24시간, 48시간마다 총 4회 투여되었습니다. 착상 후 12주에 이소플루란 과다복용으로 안락사되었습니다. 두 번째에서 세 번째 꼬리척추 구간은 일 괄 수확하여 70% 에탄올에 고정했다.
교육 권장사항, 문제 해결, 그리고 샘플 크기. 이 까다로운 프로토콜의 성공적인 도입을 돕기 위해, 신규 운영자는 쥐 시체에 대해 3–5회의 연습 절차를 수행해야 하며, 3회 연속 삽입 시 방사선 위치 이상이 없을 때 숙련도를 달성해야 합니다. 일반적인 문제 해결에는 케이지 크기 선택을 최적화하기 위해 X선을 통한 디스크 높이 사전 측정과 케이지 이동을 방지하기 위한 등쪽 뼈 평평도를 재확인하는 것이 포함됩니다. 나사 구매가 부족할 경우, 낮은 드릴 속도를 사용하는 것이 권장됩니다. 향후 검증 연구에서는 충분한 통계적 검정력을 얻기 위해 그룹당 최소 표본 크기가 n = 6에서 10명(소멸률을 위해 추가로 10–20%)을 권장합니다. 더 나아가, 향후 연구에서는 생체 재료의 성능을 검증하기 위해 대조군(예: 빈 케이지 또는 자가이식)을 포함해야 합니다.
방사선 및 조직학적 분석
마이크로 컴퓨터 단층촬영(CT) 스캔과 디지털 방사선 촬영은 80 kV의 튜브 전압과 0.1 mA 전류의 마이크로 CT 스캔 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 획득 시 두께 1.0mm의 알루미늄 필터가 사용되어 티타늄 이식으로 인한 빔 경화 현상을 최소화했습니다. 종단 평가를 위해 수술 후 1주와 4주에 120 μm 복셀 크기로 생체 내 영상 촬영을 수행하였습니다. 수술 후 12주에 24 mm 표본 홀더와 24 μm 복셀 크기를 사용하여 체 외 영상 촬영을 수행하였습니다. CT 데이터와 방사선 영상은 표준 필터링 후방 투사 알고리즘을 사용해 재구성되었고, DICOM 뷰어로 분석되었습니다. 골 결합을 평가하기 위해 정량적 기준이 정의되었습니다. 방사선학적으로, 마이크로 CT에서 최소 세 번의 연속 절편에서 두개와 꼬리 척추 말판을 연결하는 연속적인 소모 구조가 관찰되어 성공적인 융합이 확인되었다. 이미지 분할 시 전 세계 기준 700 하운스필드 유닛(HU)이 적용되었습니다. 조직형태계측학적으로 케이지 내 BV/TV 비율이 70% 이상이어야 물리적 공간적 충족과 융합의 임계값으로 간주되었습니다. 조직학적으로 뼈 결합은 섬유 조직이 없이도 두개골과 후리에서 골 쪽으로 완전히 연결되는 뼈 연결 방식으로 정의되었습니다. 조직학적 분석을 위해 안락사 2일 전 칼세인(8 mg/kg)을 피하 주사하여 12주 말기 시점의 활성 광물화 공간 분포를 확인하기 위해 순차적 형광색 표지가 시행되었습니다. 절제된 꼬리척추뼈는 70% 에탄올에 7일간 고정한 후 빌라누에바 골 염색으로 일 괄 적으로 염색했습니다. 표본은 에탄올의 상승 등급을 통해 탈수되었고, 메틸 메타크릴레이트 수지에 박힌 후, 다이아몬드 쏘 미세토임을 이용해 마이크로 CT 유도 사전 단면을 통해 케이지의 정확한 기하학적 중심에서 중간 시상을 절단했습니다. 석회화되지 않은 지면 표본(두께 5μm)은 일본 니가타의 이토 골 조직형태측정 연구소에서 준비되었습니다. 형광 융합을 위해 밝야 현미경과 공초점 레이저 주사 현미경을 사용해 이미지를 획득했습니다. 추가 검사는 편광 광학 현미경 하에서 수행되었고, 조직형태측정 분석은 컴퓨터 이미지 분석기를 사용해 수행되었습니다. 관심 영역(ROI)은 금속 스트럿을 제외한 케이지의 총 내부 부피로 정의되었으며, 두개골 및 꼬리 내 케이지 내 ROI로 세분화되었습니다. 뼈 조직은 빌라누에바 염색 아래에서 보라색/마젠타색으로 확인되었습니다. 층골(Lm.V)은 편광 아래에서 매우 조직화된 평행 층상 구조로 정의된 반면, 직조 뼈(Wo.V)는 불규칙한 섬유 무늬를 보였습니다.
