컴퓨터 지원 활성 성분 선별 및 발열 및 기침 탐구를 위한 동(DONG) 약물 검증

요약

여기서 우리는 네트워크 약리학 스크리닝, 분자 도킹, LPS 유도 마우스 모델 검증을 통합하여 '성분-표적-경로-질병'의 다차원 네트워크를 구축하였습니다. 명확한 핵심 매개변수를 설정함으로써 통족 민족 의학인 렝위샤오탕의 활성 성분을 효율적으로 식별하고 반복 가능한 공정을 검증할 수 있게 합니다.

초록

동민족 약인 렝유샤오 탕(LYXT; 이 프로그램은 발열과 기침 치료를 위해 정액 파르비티디스, 베르베나 오피시날리스 L., 그리고 로 스코 진기베르 오피시나레를 포함하여, 네트워크 약리학 예측과 실험 검증을 통합한 방법론 과정을 확립하였습니다. 첫째, 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP)을 사용하여 경구 생체이용률(OB)≥ 30%, 약물 유사성(DL)≥ 0.18 기준으로 LYXT의 주요 활성 성분을 선별하고, 발열과 기침의 관련 표적을 여러 질병 데이터베이스에서 수집하였습니다. 이후 "성분-표적-질병" 상호작용 네트워크가 구축되었고, 위상 분석 및 유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부화를 통해 핵심 작용 표적(CYP3A4, POR)과 주요 신호 경로(MAPK 경로)가 확인되었습니다. 분자 도킹 기술을 사용해 핵심 부품과 코어 표적의 결합 능력을 검증했습니다. 마지막으로, 지지다당류(LPS)를 비강 주입하여 만성 기관지염 마우스 모델을 구축하였고, 예측된 주요 활성 성분의 생체 내 항염증 효능이 검증되었습니다. 결과는 네트워크 약리학에서 스크리닝된 β-카로틴과 사파레놀 같은 성분들이 동물 실험에서 다양한 수준의 항염증 효과를 보였으며, 그 기전이 MAPK/p38 신호전달 경로의 억제와 관련될 수 있음을 보여주었습니다. 이 체계는 전통 민족 의약품에서 활성 성분의 스크리닝 및 기전 연구를 위한 반복 가능한 사례를 제공합니다.

서론

동 의학은 전통 중의학(TCM) 체계 내에서 구이저우, 후난, 광시의 동족이 시행하는 민족 의학 체계입니다. 이는 세대를 거쳐 쌓아온 누적된 경험적 지식을 나타냅니다. 이 시스템은 한약, 침술, 뼈 고정, 마사지, 식이 요법, 영적 수행을 통합합니다. 이 그룹의 독특한 특징은 역사적 지리적 고립과 구전 전통에서 비롯되며, 이는 지역 환경과 문화적 신념에 맞게 적응된 독특하고 실천 기반의 약전을 형성했다.

지속성 열은 체온을 조절하지 못할 때 발생하는 상태로, 신체가 기능 장애를 가졌음을 나타내며 인간 세포에서 자기 보호의 중요한 기능입니다^. 동 민족의 온열 치료에는 다양한 방법이 존재합니다. 그중 열은 내부 열과 외부 열로 분류됩니다. 내부 열은 내부 질환으로 인한 열을 의미하며, 외부 열은 추위나 외상으로 인해 발생하는 열을 의미합니다^. 외인성 열은 보통 위장 기능에 영향을 미칩니다^. 동 국민 의사들은 열을 치료하기 위해 냉열제를 사용합니다. 동의 여러 처방약 중에서, Lengyuxiao Tang(LYXT)은 발열과 통증 완화에 사용되는 표준 구제로, Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L., Zingiber officinale Roscoe를 포함하며, 이들을 지속적으로 두드^{리고 물과} 섞어 사용합니다. 주로 감기로 인한 열과 두통에 사용됩니다.

그러나 LYXT의 활성 성분과 그 기저 분자 기전은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 이 격차를 해소하기 위해 본 연구는 네트워크 약리학 접근법을 사용하여 잠재적 활성 성분과 표적을 예측하였습니다. 이러한 예측을 검증하기 위해, 발열과 기침과 관련된 주요 염증 반응(백혈구 침윤 및 염증성 사이토카인 생성 포함)을 모방하는 잘 확립된 지질다당류(LPS) 유도 생쥐 모델을 선택했습니다.

신약 개발 과정에서 여러 연구를 통해 화합물이 여러 단백질 표적과 상호작용할 수 있음이 밝혀졌습니다. 따라서 '한 약물, 하나의 생물학적 표적' 패러다임은 시스템 약리학 패러다임으로 전환되고 있습니다. 바이러스나 박테리아의 여러 생물학적 표적 단백질과 상호작용하는 화합물은 유용한 약^{리학적 효과를} 제공할 수 있습니다. 5. 네트워크 약리학 분석은 비용이 많이 들고 긴 신약 개발 과정을 완화하는 실현 가능하고 강력한 방법입니다. 이는 약물 간 상호작용을 더 잘 이해하고, 질병을 일으키는 기전을 예측하며, 부작용 없이 의도한 약리학적 효과를 위한 대체 약물 구성원을 제안하고, 전통 의학의 생리활성을 예측하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 화학정보학 접근법, 분자 도킹, 데이터 기반 모델링이 생물활성 예측과 메커니즘 분석에 성공적으로 적용되어 왔습니다. 이러한 방법들은 임상적 잠재력을 가진 항바이러스 및 항균 화합물의 신속한 발견을 촉진하며, 약물의 효능과 부작용을 설명하는 데에도 사용^된다. 예를 들어, 이마티닙 메실레이트는 소분자로, 만성 골수성 백혈병의 원인인 융합 단백질인 Bcr-Abl을 억제하지만, Abl, Kit, PDGFR⁷과 같은 여러 티로신 키나제의 활성도 차단합니다. 따라서 약물과 그 표적을 규명하는 연구는 질병 치료에 여전히 매우 중요하며, 이는 약물 화합물이 분자 수준에서 질병 치료에 어떻게 작용하는지 이해하는 데 도움을 줍니다. 계산 모델링과 네트워크 분석 접근법은 잠재적 약물과 표적을 정확히 스크리닝할 수 있으며, 곱셈적 상호작용 분석은 실험적 검증을 위한 이론적 기반과 실질적 지침을 제공할 수 있습니다. 본 논문에서는 상호작용 유전자/단백질 검색 도구(STRING), 주석, 시각화 및 통합 발견 데이터베이스(DAVID) 및 기타 데이터베이스를 활용하고, 동적 유전자 온톨로지(GO) 분석 및 경로 분석을 결합하여 발열 및 기침에 대한 동 의학 LYXT의 활성 성분 및 관련 작용 단백질 데이터를 수집하고, 활성 성분의 병용 처리 메커니즘을 탐구하였습니다. 이는 동 의학 LYXT에 대한 추가 연구를 위한 구체적인 이론적 참고 자료를 제공하며, 민족 의약제의 약리학적 메커니즘을 탐구하는 재현 가능한 전략을 제공하며, 새로운 항염증제 개발에 대한 통찰을 제공합니다.

프로토콜

동물 실험 프로그램은 란저우 대학교 실험동물윤리위원회(D2024-292)에서 검토되었습니다. 동물 보호, 동물 복지, 윤리 원칙과 국가 실험동물 복지 윤리의 관련 조항을 준수합니다.

1. 데이터베이스 및 소프트웨어 준비

1. 활성 성분 스크리닝 및 표적 유전자 수집
   1. TCM 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)에 접속하여 LYXT 제형의 각 허브의 라틴어 이름인 Semen Pharbitidis, Verbena officinalis L., Zingiber officinale Roscoe를 키워드로 사용하여 각 허브와 관련된 모든 화학 화합물을 검색하세요.
   2. 각 허브별로 추출된 화합물을 필터링하는 선별 기준을 적용하세요: Verbena officinalis L.의 경우 경구 생체이용률(OB)≥ 30.1%, 약물 유사성(DL)≥ 0.12; 진기버 오피니칼 로스코는 외≥ 60%, DL ≥ 0.13; 세멘 파르비티디스는 산부인≥ 16.93%, DL ≥ 0.50으로 설정했습니다. 그 후 세 허브의 필터링된 화합물 목록을 합치고, 고유 TCMSP 식별자를 기반으로 중복 항목을 제거하여 LYXT에서 최종 활성 화합물 목록을 생성합니다.
   3. TCMSP 데이터베이스에서 이 활성 화합물과 관련된 모든 타깃 단백질을 복합물 식별자와 타겟 단백질 이름을 포함하는 테이블로 내보내고, 이 타깃 단백질 목록을 UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)로 가져오세요.
   4. UniProtKB ID 매핑 도구를 사용하여 모든 목표 단백질 이름을 공식 인간 유전자 기호로 변환하고, 매핑 방향을 단백질 이름에서 유전자 이름으로 설정하고, 유효한 유전자 기호가 없는 항목은 제거하여 LYXT 활성 성분과 연관된 최종 목표 유전자 목록을 생성합니다.
2. 질병 표적 유전자 수집 및 중복 분석
   1. GeneCards 데이터베이스(www.genecards.org)에서 열병 및 기침 관련 유전자를 "fever"와 "cough" 키워드로 별도로 검색하여 다운로드하고, 관련성 점수 5≥ 유전자를 유지하며, 두 검색 결과를 데이터베이스 내에서 병합할 수 있습니다.
   2. 치료 표적 데이터베이스(TTD)db.idrblab.net/ttd 에서 발열 및 기침 관련 유전자를 "fever"와 "cough"라는 키워드로 별도로 검색하여 다운로드하고, 관련 표적 유전자를 모두 다운로드한 후 두 검색 결과를 데이터베이스 내에서 병합하세요.
   3. PharmGkb 데이터베이스(www.pharmgkb.org)에서 열과 기침 관련 유전자를 "fever"와 "cough"라는 키워드로 별도로 검색하여 다운로드하고, 관련 유전자를 모두 다운로드한 후 데이터베이스 내에서 두 검색 결과를 병합하세요.
   4. 온라인 멘델리안 유전(OMIM) 데이터베이스(www.omim.org)에서 열병 및 기침 관련 유전자를 "fever"와 "cough"로 각각 별도로 검색하여 다운로드하고, 모든 관련 유전자를 다운로드한 후 데이터베이스 내에서 두 검색 결과를 병합하세요.
   5. DrugBank 데이터베이스^{(go.drugbank.com)} 8에서 "fever"와 "cough" 키워드로 별도로 검색하여 발열 및 기침 관련 유전자를 다운로드하고, 관련 유전자를 모두 다운로드한 후 데이터베이스 내에서 두 검색 결과를 병합하세요.
   6. 다섯 개 데이터베이스에서 얻은 유전자 목록을 하나의 포괄적인 목록으로 통합하고, 중복된 유전자 기호를 제거하여 발열 및 기침 관련 질병 표적 유전자 최종 목록을 생성합니다.
   7. 1.2.6단계의 질병 표적 목록과 1.1.4단계의 LYXT 활성 성분 표적 유전자 목록을 비교하여 두 목록에 공통된 중복 유전자를 선택한 후 CSV 파일로 내보내십시오.
3. ID 변환 및 단면 분석
   1. 1.2.7 단계에서 겹치는 유전자 목록을 R 환경에 불러와 DAVID 웹사이트(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)에 접속하세요.
   2. 겹치는 유전자 목록을 DAVID에 업로드하고, 종은 Homo sapiens 로, 목록 유형은 유전자 기호로 설정한 후, 기능 주석 도구를 실행하여 단면 분석을 수행합니다.
   3. DAVID 내의 유전자 ID 변환 함수를 사용하여 교차하는 단백질의 심볼 ID를 앙상블 ID로 변환하고, 유전자 기호에서 앙상블 ID로의 변환 방향을 설정합니다.
   4. 변환된 앙상블 ID 목록과 원본 유전자 기호를 CSV 파일로 내보내 후속 농도 분석을 수행합니다.

2. 필수 활성 성분과 표적 단백질 선별

1. 복합물 표적 네트워크 구축
   1. 1.2.7단계의 교차 유전자 목록과 1.1.4단계의 LYXT 활성 성분 표적 유전자 목록을 R 환경에 불러온 후, 표적 유전자와 교차하는 유전자와 관련된 화합물을 비교 분석하여 식별합니다.
   2. 화합물-표적 관계 데이터를 Cytoscape 버전 3.8.1에 가져오고, "LYXT-Fever and cough-target" 네트워크 다이어그램을 생성하여 활성 성분과 관련 표적 간의 상호작용을 시각화합니다.
2. 단백질-단백질 상호작용 데이터 획득
   1. LYXT 활성 성분 표적과 발열 및 기침 표적 교차 구간의 유전자 ID 파일을 https://stringdb.org/ STRING 데이터베이스에 가져오고, 종으로 Homo sapiens 를, 데이터 처리 방법으로 여러 단백질을 선택합니다.
   2. 신뢰 임계치를 ≥ 0.90으로 설정하고 상관관계가 매우 낮은 단백질을 분리하여 단백질-단백질 간 상호작용을 필터링한 후, 필터링된 상호작용 데이터를 담은 TSV 파일을 생성하여 후속 분석을 수행합니다.
3. 교차 해석 확인
   1. R 언어를 사용하여 활성 성분의 표적 단백질과 발열 및 기침의 표적 단백질 간의 교차점을 분석하며, 1.2.7단계에서 확인된 중복 유전자 집합을 확인합니다.
   2. 이 확인된 중복 유전자 집합을 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 분석을 위해 준비합니다.

3. 주요 표적 단백질의 스크리닝

1. PPI 네트워크 시각화
   1. 2.2.2단계에서 필터링된 상호작용 데이터를 Cytoscape 버전 3.8.1로 가져오고, 네트워크 시각화 도구를 사용해 PPI 네트워크 다이어그램을 그립니다.
   2. Cytoscape 내에서 CytoNCA 플러그인을 설치하고 실행한 후, 이 플러그인을 사용해 네트워크 내 각 노드에 대해 다음 매개변수를 계산하여 위상 분석을 수행합니다: 차수 중심성(DC), 간도 중심성(BC), 근접성 중심성(CC), 고유벡터 중심성(EC), 네트워크 중심성(NC), 그리고 지역 평균 연결성(LAC).
2. 중앙 기반 스크리닝을 이용한 핵심 표적 단백질 식별
   1. CytoNCA에서 계산된 토폴로지 매개변수 테이블을 모든 노드 식별자와 해당 DC, BC, CC, EC, NC, LAC 값을 포함하는 CSV 파일 형식으로 내보내세요.
   2. 네트워크 내 모든 노드에서 정도 중심성(DC)의 중앙값을 계산하고, DC가 중앙값의 두 배를 초과하는 모든 노드를 식별합니다.
   3. 네트워크 내 모든 노드에서 근접성 중심성(CC)과 간간성 중심성(BC)의 중앙값을 계산한 후, 3.2.2단계에서 식별된 노드 중에서 Kibble 등9에서 설명한 스크리닝 방식을 따르며 중앙값보다 CC가 더 크고 BC가 중앙값보다 큰 노드만 유지^합니다.
3. 최종 주요 목표 편집
   1. 3.2.3단계에서 유지된 노드의 식별자를 주요 타깃 단백질 목록으로 합성하여 CSV 파일로 내보내세요.
   2. 이 중앙값 기반 스크리닝 규칙(중앙값의 두 배 이상, CC이 중앙값보다 크다, BC가 중앙값보다 큰)을 원고 전반에 걸친 주요 표적 식별의 유일한 기준으로 적용하여 프로토콜에서 확립한 통합 스크리닝 접근법과의 일관성을 보장한다.

4. GO 농축 분석 및 KEGG 경로 분석

1. DAVID 데이터베이스를 이용한 기능 풍부 분석
   1. Tanabe 등에서 설명한 방법에 따라 1.3.4단계에서 교차하는 유전자 목록을 https://david.ncifcrf.gov/ 유전자 기호 형식으로 DAVID 데이터베이스에 업로드하고, 종을 Homo sapiens로, 목록 유형을 유전자 기호로 설정합니다.
   2. 생물학적 과정에 GOTERM_BP_DIRECT , 세포 구성 요소에 GOTERM_CC_DIRECT , 분자 기능을 위한 GOTERM_MF_DIRECT 를 선택하여 GO 농축 분석을 수행하고, KEGG_PATHWAY를 선택하여 KEGG 경로 농축 분석을 수행합니다.
   3. 유의성 임계값을 p < 0.05로 설정하고, 여러 차례 검사에 대해 벤자미니-호흐버그 거짓 발견률(FDR) 보정을 적용한 후, 용어명, 유전자 개수, p-값, FDR 조정 p-값 및 관련 유전자가 포함된 CSV 파일 형태로 풍부화 결과를 다운로드합니다.
2. OmicShare 클라우드 플랫폼을 이용한 버블 차트 생성
   1. 4.1.3 단계의 GO 농축 결과를 OmicShare 클라우드 플랫폼에 가져오고, https://www.omicshare.com/tools GO 농축 버블 차트 도구를 선택하세요.
   2. 용어 이름, 유전자 수, p값이 포함된 결과 파일을 업로드한 후, 도구가 p값이 가장 낮은 상위 20개 용어를 표시하도록 설정하세요.
   3. x축은 농축 비율을, y축은 GO 용어를, 버블 크기는 유전자 수, 버블 컬러는 p-값을 나타냅니다.
   4. 버블 차트를 생성하여 고해상도 이미지 파일로 다운로드하세요.
3. KEGG 매퍼를 이용한 KEGG 경로 시각화
   1. KEGG 경로 풍부화 결과를 p-값으로 오름차순으로 정렬하고, p-값이 가장 작은 상위 20개 경로를 선택합니다.
   2. 선택된 각 경로에 대해 https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html KEGG 데이터베이스에 접속하여 경로 다이어그램을 얻을 수 있습니다.
   3. 각 경로에 존재하는 교차 유전자 목록에서 표적 단백질을 확인하여, 풍부화 결과의 경로 유전자 집합과 교차 참조합니다.
   4. https://www.kegg.jp/kegg/mapper/ 에서 KEGG 매퍼 도구에 접근하여 색상 경로 기능을 선택한 후 교차하는 유전자 기호 목록과 KEGG 경로 식별자를 입력한 후, 식별된 표적 단백질을 빨간색으로 강조한 색상 구분 경로 다이어그램을 생성하세요.
   5. 세 가지 범주의 GO 농축 CSV 파일, KEGG 경로 농축 CSV 파일, 버블 차트 이미지, 상위 20개 경로의 색상 구분 경로 다이어그램을 포함한 모든 농축 분석 출력물을 모은 후, 이 파일들을 내보내 후속 분석을 위해 내보냅니다.

5. 분자 도킹 검증

1. https://www.rcsb.org/ RCSB PDB 데이터베이스에서 네트워크 분석에서 핵심 표적으로 식별된 CYP3A4 및 POR과 같은 필수 단백질의 3D 구조를 다운로드하고, 호 모 사피엔스 에서 해상도 2.5 Å≤ 공동 결정화된 리간드를 포함한 구조를 선택하여 활성 부위를 정의하고, 활성 화합물(베타-카로틴 포함, 스파툴레놀과 베타-시토스테롤)을 PubChem 데이터베이스에서 SDF 형식으로 사용합니다.
2. AutoDockTools를 사용해 수분 분자와 공동결화된 리간드를 제거하고, 극성 수소를 첨가하며, 가스테이거 전하를 할당하여 단백질 구조를 준비한 후, 준비된 단백질을 PDBQT 형식으로 저장하고, 화합물 SDF 파일을 Open Babel을 사용해 PDB 형식으로 변환하며, AutoDockTools에서 각 리간드에 대한 회전 가능한 결합을 감지하고, 리간드를 PDBQT 형식으로 저장합니다.
3. 60 × 60 × 60 Å 크기의 도킹 그리드 박스를 정의하고, 동결 리간드의 결합 부위 좌표를 중심으로 한 후, AutoDock Vina를 사용해 전부 8, num_modes 10으로 설정하여 각 리간드-단백질 쌍에 대해 10개의 결합 포즈를 생성합니다.
4. 결과 도킹 파일과 해당 타겟 파일을 PyMOL에 가져오고, 가장 낮은 결합 에너지(가장 음의 값)를 대표 포즈로 식별하여 저장합니다.
5. 그 후 이 모델을 https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/ PLIP 데이터베이스에 제출하여 수소 결합, 소수성 상호작용, π 적층, 염 다리 등 소분자와 단백질 간의 상호작용을 분석할 수 있습니다.
6. LYXT의 모든 활성 성분에 대한 결합 에너지를 발열과 기침과 관련된 표적 단백질에 대해 계산 및 컴파일한 후, 화합물명, 표적 단백질, 결합 에너지(kcal/mol), 주요 상호작용 유형을 포함한 요약표를 생성하여 결과 섹션에 제시합니다.
   참고: 네트워크 약리학 분석에 사용되는 R 스크립트는 보충 파일 1에서 확인할 수 있습니다.

6. 동물 실험

1. 실험 연대표
   1. 동물을 1주간 적응시키고, 0일째에는 LPS 또는 생리식염수 투여를 시행하며, 7일째부터 20일째까지 2주간 매일 약물 치료를 투여하고, 21일째에는 샘플 채취와 함께 안락사를 시행합니다.
2. 동물 획득 및 그룹화
   1. 25±± 4g의 성체 수컷 C57BL 6마리를 구입해 1주일간 먹인 후 무작위로 정상 식염수 그룹(6마리)과 LPS 부상 그룹(54마리)으로 나눕니다.
   2. 치료 시작 7일째에 LPS 손상 그룹을 6마리씩 7개의 하위 그룹으로 무작위로 나누어 6마리의 쥐를 포함합니다: 모델군, 양성군(덱사메타손, 50 mg·kg·¹·^d-1), LYXT 치료군(200 mg·^kg-1·^d-1), 베타-카로틴 그룹(50 mg·kg-1·^d-1), 스파툴레놀 그룹(50 mg·^kg-1·^d-1), 그리고 베타-시토스테롤 그룹(50 mg·^kg-1·^d-1)을 포함합니다.
      참고: 치료 투여 및 결과 평가는 블라인드로 진행되었습니다.
3. LPS 유발 폐 염증 모델
   1. 마취 시 복막 내 주사로 펜토바르비탈 나트륨 2% 60 mg/kg 용량을 투여합니다. 꼬리 꼬집기 반응이 없어 중간 정도의 마취 깊이를 확인하세요. 마지막으로, 기록된 체중을 바탕으로 10 mg/mL 농도에서 필요한 LPS 주입량을 계산합니다.
   2. 비강 투여를 준비하려면 정확히 계산된 LPS 용액의 양을 피펫에 흡입하세요. 오른손으로 꼬리 밑동을 잡고 왼손 엄지와 검지로 귀 부분을 부드럽게 고정해 쥐를 단단히 잡으세요.
   3. 액체를 천천히 배출하여 피펫 끝에 약 2 μL 크기의 작은 방울이 형성될 때까지 유지합니다. 물방울을 쥐의 오른쪽 콧구멍 가까이에 조심스럽게 가져가 닿게 하세요. 즉시 그리고 빠르게 왼손을 30–40cm 위로 들어 올린 뒤, 부드럽게 왼손과 마우스를 시작 위치로 되돌려 놓으세요.
      참고: 위로 올라가는 상태를 유지하려면 쥐의 콧구멍에 주의를 기울여야 합니다.
   4. 같은 방법으로 쥐의 왼쪽 콧구멍에 작은 액체 방울을 주입한 뒤, 액체 주입이 완료될 때까지 좌우 콧구멍에 차례로 추가하세요.
   5. 그 다음 마우스를 놓고, 테이프로 마우스를 마우스 보드에 고정시키고, 배를 올리고 머리를 들어 올리는 자세를 4시간 이상 유지하세요. 쥐가 깨어난 후에는 Lorenz 등에서 설명한 방법을 따라 다시 우리에 넣어 관찰^합니다.
4. 기관지폐포 세척액 수집
   1. LPS 손상군 쥐를 무작위로 7그룹으로 나누었습니다: 음성 대조군, 모델 그룹, 양성군(덱사메타손 50 ^mg.kg-1.d-1), LYXT 치료군(200 ^mg.kg-1.d-1), 베타-카로틴군(50 ^mg.kg-1.d-1), 스파툴레놀군(50 ^mg.kg-1.d-1), 베타-시토스테롤 그룹(50 mg.kg-1.d-1), 각 그룹에 6마리씩.
      참고: LYXT는 다음과 같이 준비하세요: Pharbitis nil (L.) Choisy, Verbena officinalis L., Zingiber officinale Roscoe 분말을 5:3:2의 질량 비율로 혼합하세요.  가루를 물과 1:30(g/mL) 비율로 섞고 80°C에서 2시간 동안 역류시킵니다. 용액을 여과 및 농축(30 °C, 0.01–0.08 MPa)한 후 물에 녹여 2 g/mL 용액을 만듭니다. 베타-카로틴, 베타-시토스테롤, 스파스툴레놀이 실험적 검증을 위한 기준으로 사용되었습니다. LPS 치료 1주일부터 시작하여 각 그룹에 하루에 한 번씩 2주 동안 투여하세요. Jin 등에 따르면, 티오펜탈 과다복용(100 mg/kg)으로 동물을 안락사시키^세요.
   2. 23번 캐뉼라로 뇌실을 삽관하세요. 그 후 25cm H₂O 압력으로 폐 조직에 10mL의 PBS를 천천히 주입하고, 이 세척을 약 6회 반복하여 Pinheiro 등¹³이 설명한 방법을 따라 기관지폐포세척액(BALF)을 얻습니다.
5. BALF와 혈청에서의 백혈구 및 사이토카인 분석
   1. 수집한 BALF를 500 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리합니다. 세포 펠릿을 1 mL의 PBS에 재현탁하고, 트리판 블루로 1:10으로 희석한 후, 400× 배율의 광현미경 아래 헤모사이토미터로 총 백혈구를 세세요.
   2. 심장 천자에서 BALF 상청액과 혈청 샘플을 채취하세요.
   3. 제조사 지침에 따라 상용 ELISA 키트를 사용하여 TNF-α, IL-1β, IL-18 농도를 측정하고, 마이크로플레이트 리더기로 450 nm 흡광도를 측정하며, 표준 곡선에서 농도를 계산합니다. BCA 분석법을 사용하여 BALF 내 단백질 농도를 측정합니다.
6. HE 및 WB 분석을 통한 활성 성분 검증
   1. LYXT 효능에 기여하는 활성 성분을 규명하기 위해, 6.3절에 따라 LPS 유도 폐 염증 모델을 재확립합니다.
   2. 60마리의 마우스를 구입해 일주일간 적응시키고, 무작위로 다섯 그룹(각 그룹 n = 12명)으로 나누세요: 모델 그룹, LYXT 그룹(200 mg·^kg-1·^d-1), 베타-카로틴 그룹(50 mg·^kg-1·^d-1), 스파툴레놀 그룹(50 mg·^kg-1·^d-1), 그리고 조합 그룹(각각 25 mg·kg·¹·^d-1 ).
   3. 6.3단계에 설명된 대로 0일째에 LPS를 투여하고, 7일째부터 20일째까지는 치료를 시행합니다. 21일째에는 폐 조직¹⁴를 채취하세요.
7. 조직학적 분석
   1. 왼쪽 폐 상엽을 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정한 후 파라핀에 박고, 5 μm 절편을 절단한 후 헤마톡실린과 에오신(HE) 염색을 수행합니다.
   2. 200× 및 400× 배율로 절편을 검사하여 염증성 세포 침윤과 폐포벽 두께 증진을 평가합니다. 대표적인 이미지를 촬영하세요.
8. 서부 블롯 분석
   1. 방사면역침전 분석법(RIPA) 완충액에서 프로테아제 및 인산효소 억제제를 이용해 폐 조직을 균질화합니다. 12,000 × g 온도에서 4 °C에서 15분간 원심분리기로 가열한 후 비신코닉산(BCA) 분석법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
   2. 우물당 단백질 30 μg을 나트륨 도데실 황산염-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에 적재한 후, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로 옮긴 후 5% 무지방 우유로 차단합니다.
   3. p-p38, p38, TNF-α, IL-1β, IL-18, β-액틴에 대한 1차 항체를 4°C에서 하룻밤 인큐브한 후 HRP 결합 2차 항체와 함께 인큐베이팅합니다.
      참고: 항체의 희석 현상은 재료표에 제공되어 있습니다.
   4. ECL 기판을 사용해 밴드를 시각화하고, 이미지를 캡처하며, ImageJ를 사용해 강도를 정량화합니다. 표적 단백질 발현을 β-액틴 또는 총 p38로 정규화합니다.

결과

TCMSP 데이터베이스를 통해 409개의 활성 LYXT 성분을 수집했습니다. 이 중 58가지 성분은 Verbena officinalis L.에서, 86가지는 Semen Pharbitidis에서, 265가지는 Zingiber officinale Roscoe에서 추출되었습니다. 지수에 따라 26가지 주요 활성 성분이 선별되었으며, OB는 버 베나 오피시나리스 L.≥ 30.1%, ≥DL은 0.12, O≥B는 60%, DL ≥은 Zingiber officinale Roscoe의 0.13, OB는 16.93%, DL은 정액 파르비티디스≥ 0.50≥ 있습니다(표 1).

LYXT의 활성 성분 교차 분석을 통해 207개의 상호작용 단백질이 얻어졌습니다. 발열과 기침에 관련된 단백질은 스트링 데이터베이스에서 가져와 단백질 상호작용 다이어그램을...

토론

이 논문은 발열과 기침에 사용되는 전통 동 약 약제인 LYXT의 26가지 활성 성분과 207가지 잠재적 표적을 성공적으로 확인했습니다. 주요 발견으로는 네트워크 위상 분석을 통해 CYP3A4가 중요한 표적 단백질로 확인된 것과, LPS 유도 폐 염증 모델에서 LYXT, 베타-카로틴, 스파툴레놀이 유의미한 항염증 효과를 가진 활성 화합물임을 실험적으로 검증한 것이 포함됩니다. 이 발견들은 네트워크 약리학(데이터베이스 스크리닝, PPI 네트워크 분석, 분자 도킹)과 생 체 내 실험적 검증(BALF 백혈구 계수, 사이토카인 측정, 조직학, 웨스턴 블롯)을 결합한 통합 접근법을 통해 달성되었습니다.

첫째, 독특한 한방 약리학 시스템 플랫폼인 TCMSP는 질병, 약물, 표적 간의 관계를 포착합니다. 본 연구는 TCMSP 플랫폼을 사용해 LYXT에서 발열과 기침에 필요한 핵심 성분을 탐색하고, 분자 도킹을 수행하여...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
안티-IL-18	프로틴테크, 우한, 중국	27095-1-AP	토끼 다클론, 1:500
항-IL-1&베타;	프로틴테크, 우한, 중국	66737-1-Ig	마우스 단클론, 1:500
안티-p38	프로틴테크, 우한, 중국	14064-1-AP	토끼 다중복제, 1:1000
안티-p-p38	프로틴테크, 우한, 중국	28796-1-AP	토끼 다중복제, 1:1000
항TNF-및 알파;	프로틴테크, 우한, 중국	80258-6-RR	토끼 단클론, 1:500
항-&베타-액틴	프로틴테크, 우한, 중국	66009-1-Ig	마우스 단클론, 1:2000
오토독 비나	https://vina.scripps.edu/	버전 1.5.6	분자 도킹 소프트웨어
오토독툴	https://autodock.scripps.edu/	버전 1.5.6	분자 도킹 준비 도구
BCA 단백질 분석 키트	서모피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠, 미국	23225	단백질 농도 측정을 위해
베타-카로틴	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	83-46-5	고순도 기준, >95%
베타-시토스테롤	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	83-46-5	고순도 기준, >95%
C57BL/6 마우스	란저우 대학교 의료동물센터 및 NBSP;	-	성인 남성, 25세 이상; 4 g
사이토스케이프	https://cytoscape.org/	버전 3.8.1	네트워크 시각화 및 분석 소프트웨어
덱사메타손	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	D4902	긍정적 통제
ECL 기질	밀리포어시그마, 매사추세츠주 벌링턴, 미국	WBKLS0500	서부 블롯 검출을 위해
엘리사 키트
그래프패드 프리즘	https://www.graphpad.com/	버전 8.0 이상	통계 분석 및 그래프 작성 소프트웨어
헤마톡실린과 이오신(H& E) 염색 키트	베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사, 중국 베이징	G1120	폐 조직 염색을 위해
조직학
HRP 결합 안티마우스	프로틴테크, 우한, 중국	SA00001-7G	2차 항체, 1:5000
HRP 결합 안티래빗	프로틴테크, 우한, 중국	SA00001-7H	2차 항체, 1:5000
IL-18 ELISA 키트	베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사, 중국 베이징	SEKH-0016	BALF와 혈청에서 IL-18 측정을 위해
IL-1&베타; 엘리사 키트	베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사, 중국 베이징	SEKM-0004	IL-1과 베타를 측정하기 위해; BALF와 세럼에서
이미지J	https://imagej.nih.gov/ij/	버전 1.53	이미지 분석 소프트웨어
지지방다당류(LPS)	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	L2630	출처: 대장균(Escherichia coli)과 nbsp; O111:B4
LYXT 원재료	화화대학교	-	분말 혼합물; 파르비티스 nil  (왼쪽.) 초이지   베르베나 오피시나리스 L., and  Zingiber officinale  로스코 (5:3:2, w/w/w)
기타 재료
펜토바르비탈 나트륨	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	P3761	마취용 2% 용액
플립	https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/	-	단백질-리간드 상호작용 프로파일러
PVDF 막	밀리포어시그마, 매사추세츠주 벌링턴, 미국	IPVH00010	웨스턴 블롯 전이(Western blot transfer)를 위해
파이몰	https://pymol.org/	버전 2.5	분자 시각화 소프트웨어
R	https://www.r-project.org/	버전 4.0 이상	통계 컴퓨팅 및 그래픽 소프트웨어
스파툴레놀	메드켐익스프레스, 뉴저지주 몬머스 정션, 미국	HY-N1205	고순도 기준, >95%
스트링	https://stringdb.org/	-	상호작용하는 유전자/단백질 검색 도구
TCMSP	https://tcmsp-e.com/	-	전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스
티오펜탈	시그마-올드리치, 세인트루이스, 미주리, 미국	T102	안락사를 위해
TNF-&α; 엘리사 키트	베이징 솔라비오 과학 및 테크놀로지 유한회사, 중국 베이징	SEKM-0034	TNF-및 알파 측정을 위해; BALF와 세럼에서
유니프로트	https://www.uniprot.org/	-	단백질 서열 및 주석 데이터베이스