인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

요약

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 노화는 세포 형태 확대, 분비 신호 전달 변화, 뚜렷한 리소좀 재형성 등 특징적인 표현형과 관련된 안정적인 세포 주기 정지 상태입니다. 노화 세포는 산성 내성 리소좀 구획의 확장과 함께 루미날 산도 및 분해 능력의 변화를 보이며, 노화 연관 소기관 재형성의 간단한 생세포 판독 기회를 제공합니다. 이 연구는 산성 소기관 구획의 간접적이고 pH 의존적인 대리 지표로서 산성 소기관 구획의 노화 부담 상관관계를 제공하는 LysoTracker Deep Red를 사용하는 생세포 영상 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 IMR-90 인간 폐섬유아세포가 연쇄 배출을 통해 복제적 노화를 겪는 경우에 입증되었습니다. 프로토콜은 세포 배양 및 통과 추적, LysoTracker 염색, 형광 영상, 그리고 세포당 리소좀 신호 강도와 신호 양성 면적의 이미지 기반 정량화를 상세히 다룹니다. 평행 배양에서 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-Gal) 염색은 참조 표준이 아닌 선택적 확인 마커로 포함된다. 대표적 결과는 후기 통과 배양에서 초기 통과 대조군보다 더 높은 산성 형광 염료 신호와 더 큰 용해 양성 영역을 보이며, 이는 노화 중 산성 소기관 구획의 확장과 일치합니다. 이 판값은 구획 부피, 양성자 구배, 염료 가용성에 따라 달라지기 때문에, 리소좀 수나 생합성의 직접적인 측정보다는 리소좀 재형성의 간접적 상관관계로 해석하는 것이 가장 좋습니다. 이 프로토콜은 채택이 간단하며 다른 세포 유형이나 노화 유발 스트레스에 맞게 조정할 수 있어 기존의 종말 분석에 실용적이고 정량적인 보완 역할을 합니다.

서론

세포 노화는 다양한 스트레스와 노화 관련 유발 요인(^1,2,3,4)에 의해 활성화되는 지속적인 세포 주기 정지 프로그램입니다. 노선 세포는 고전적으로 여러 마커의 별자리로 식별되는데, 이는 단일 마커가 완전히 특이하지 않기 때문입니다. 특징으로는 확대되고 평평한 세포 형태, 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-Gal) 활성, DNA 손상 초점의 형성, 염증성 분비 프로필(SASP)^2,4,5가 있습니다. 이 중 하나로, 소소좀 재형성이 노화의 두드러지고 기능적으로 중요한 특징으로 부각되었습니다 ^6,7. 노화 세포는 리소좀 크기와 수의 극적인 증가와 기능 변화(종종 리소좀 pH의 부분 중화와 분해되지 않은 물질의 축적 ^포함)를 포함한 깊은 변화를 보인^다. 이 리소좀 확장은 SA-β-Gal 활성 증가에 기여하며, 이는 노화 세포 10,11,12에서 리소좀 β-갈락토시다아제 활성 상승을 반영하는 확립된 노화 지표입니다. 실제로 SA-β-Gal 염색은 pH가 최적이지 않은 6.0 배양 상태를 이용해 효소를 축적하고 젊은 세포보다 pH가 높은 노화 세포 리소좀에서 염료를 선택적으로 침전시켜 이 현상을 이용한다 10,12,13.

리소좀은 단백질 교체와 신호 전달에서 중심적인 역할을 하며, 이들의 조절 장애는 현재 노화와 노화의 특징으로 간주됩니다 1,2,4,6. 노화 세포는 종종 리소좀 기능 장애를 보이며, 이는 하강 pH 상승, 효소 활성 변화, 그리고 산화된 고분자의 자가형광 색소인 리포푸신의 축적으로 나타납니다^6,14. 리소좀 생합성은 전사인자 EB(TFEB)와 관련 인자 ^6,7,15의 조절 하에 조정된 리소좀 발현 및 조절(CLEAR) 네트워크를 통해 자주 상향 조절되거나 변형됩니다. 이 과정은 분해 구획 ^6,7,10을 확장하여 스트레스에 적응하면서 노화 세포의 리소좀 질량을 증가시킬 수 있습니다. 반대로, 노화 세포는 리소좀 기능 저하(예: 산도 감소)를 경험할 수 있으며, 이는 자가포식과 같은 과정에 영향을 미치고 철세포 사멸을 포함한 특정 스트레스에 대한 저항성을 부여할 수 있습니다 ^6,8. 따라서 리소좀 함량과 기능 측정은 노화를 이해하고 식별하는 데 핵심적이다 ^6,16.

LysoTracker Deep Red는 프로톤화 유도 포획을 통해 산성 소기관에 선택적으로 축적되는 막 투과형 형광 프로브입니다^16,17. 결과적으로 생성된 신호는 리소좀 질량보다는 산성 구획 부피, 양성자 구배 강도, 국소 염료 가용성의 결합을 반영하며, 총 리소좀 수 ^6,16과 독립적으로 발생하는 리소좀 pH 또는 막 상태 변화에 따라 변화할 수 있습니다. 세포 노화 맥락에서 세포는 노화 이전 구획에 비해 확장되고 더 강하게 표지된 LysoTracker 양성 구획을 보^{이며, 이는} 산성 소기관 구획의 확장과 생화학 및 초구조 연구에서 보고된 리소좀 생합성 증가와 일치합니다 ^6,7,10. 이 라이브 셀 방식은 기존의 SA-β-Gal 염색에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다: 개별 세포의 정량적이고 공간적으로 분해된 분석이 가능하며, 다른 형광 리포터와 결합할 수 있고, 고정이 필요 없으며, 이분법적 엔드포인트 대신 연속적인 특징을 보고하여 이질성을 포착합니다 ^6,16. 이 프로토콜 전반에 걸쳐 라이소트래커 신호는 살아있는 세포 내 산성 소기관 구획을 읽는 신호로 사용되며, 상태에 따른 변화는 절대적인 리소^{좀 수치} 측정값으로 다루지 않고 이에 따라 해석됩니다^.

이 프로토콜은 복제 노화를 겪는 IMR-90 섬유아세포의 리소좀 변화를 프로파일링하기 위해 LysoTracker Deep Red를 사용한 내용을 상세히 설명합니다. IMR-90은 노화 연구에 널리 사용되는 정상적인 인간 이배체 섬유아세포주(여성, 태아 폐 기원)입니다; 다른 일차 유사 섬유아세포(예: WI-38)와 마찬가지로, IMR-90 세포는 텔로미어 단축과 DNA 손상 신호 전달으로 인해 ~50–60 인구 증가(헤이플릭 한계)에서 노화에 들어갑니다^18,19. 프로토콜은 IMR-90 세포를 연속 통과로 노화를 유도하는 방법, 형태학 및 SA-β-Gal 염색으로 노화 확인, 그리고 LysoTracker Deep Red로 생체 배양물을 염색하여 형광^{영상 5,10,12,13}을 수행하는 방법을 설명합니다. 이미지 획득 및 분석이 포함되며, 세포당 리소좀 수, 세포당 총 리소좀 면적, 평균 형광 강도와 같은 정량적 수치가 포함됩니다. 염료와 고정제의 신중한 취급, 영상 촬영 중 광독성 최소화, 노화 세포 자가형광 고려 등 실험적 통제 및 안전성 고려사항이 강조됩니다. 이 방법은 복제 노화를 사용하여 입증되었으나, 약물 유발 노화(예: 독소루비신 또는 에토포사이드 치료)나 산화제 2,3,4,19,20에 의한 스트레스 유발 조기 노화(SIPS) 등 다른 모델에도 적용할 수 있습니다. 각 경우마다 LysoTracker 기반 측정값을 적절한 대조군(증식 세포 또는 휴면 세포)과 비교하고, 가능하다면 최소 하나의 전통적인 노화 지표(예: SA-β-Gal 또는 p16INK4a 발현)와 교차 검증해야 합니다(3,5,12,13).

생세포 리소좀 프로파일링은 노화 분석의 실질적 공백을 메우며, 노화 세포 기능과 직접 연관된 주요 소기관 표현형인 리소좀체 확장의 재현 가능하고 단일 세포 해상도 측정을 제공합니다(예: 분해 능력 및 분비 활동 향상)2,3,4,6 . LysoTracker 염색은 고처리량 영상 및 유세포분석과 호환되기 때문에, 프로토콜은 약물 스크리닝(예: 세놀리틱스 또는 리소좀 기능 조절제 검사)과 같은 응용 분야에 맞게 확장할 수 있습니다^2,3,6. 향후 방향으로, 이 프로토콜로 생성된 세포별 리소좀 특징은 머신러닝 모델을 포함한 하위 분류 접근법에 적합할 수 있습니다; 이러한 분류기의 학습 및 검증은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 전반적으로 이 방법(그림 1)은 노화 생물학의 리소좀 차원을 시각화하고 정량화할 수 있게 하여, 노화 또는 스트레스 시 리소좀 생생성과 형태가 어떻게 변하는지에 대한 통찰을 제공하며, 노화 세포에서 리소좀을 표적으로 하는 중재를 테스트할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 핵 분할, 셀 관련 영역 도출, LysoTracker 특징 정량화, 여기서 제시된 퍼웰 및 셀별 분석을 재현하는 이미지 분석 워크플로우는 오픈 소스 동반 패키지(SenTrackLite v0.5.0)로 구현되었으며, 보충 파일 1로 제공되고 인용 및^{재사용을 위한} 영구 DOI와 함께 보관됩니다.

그림 1: 생세포 리소좀 노화 분석 개요. (A) 실험적 작업 흐름. 세포는 라이소트래커 딥 레드와 핵 염료로 생생 염색을 하고, 표준 형광 현미경으로 영상화하며, 선택적으로 SA-β-Gal 염색을 병행하여 검증을 위해 처리합니다. (B) 이미지 기반 셀별 측정값. 핵 채널은 개별 세포를 식별하는 데 사용되며, 핵 고정 확장은 LysoTracker 채널에서 리소좀 관련 측정값을 추출하기 위한 세포별 영역을 정의합니다. 세포별 대표적인 측정치로는 리소좀 면적, 평균 LysoTracker 강도, 리소좀 수가 포함됩니다. SA-β-Gal 염색은 참조 데이터셋을 생성하거나 확인할 때 선택적 검증 라벨로 사용할 수 있습니다. (C) 정량화 및 산출물. 세포별 리소좀 측정값은 단순 점수 체계를 사용하여 단일 세포당 노화 점수 또는 확률로 결합합니다. 결과물에는 세포별 값과 노화 부담의 웰 수준 또는 상태 수준 요약이 포함되어 있으며, 이는 노화 유도 또는 노감 치료 조건 간에 비교할 수 있습니다. BioRender.com 로 창조됨
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프로토콜

IMR-90 세포는 확립된 인간 섬유아세포 세포주이며 인간 대상 연구에 포함되지 않습니다. 윤리적 승인이나 사전 동의는 필요하지 않았습니다. 모든 절차는 뉴욕주립대학교 올버니 캠퍼스의 생물안전 지침에 따라 인간 유래 세포주를 대상으로 한 생물안전 2단계(BSL-2) 조건 하에 수행되었습니다.

1. 일반 준비 및 워크플로우 개요

1. 실험 목표를 LysoTracker 딥 레드 염색과 생 핵염료를 이용한 생세포 리소좀 프로파일링 분석법으로 정의하여, IMR-90 세포 내 노화 부하를 연속적으로 측정하는 리소좀 재형성을 정량화합니다. 주요 생물학적 비교를 다음 설계 중 하나로 정의합니다:
   1. 노인 유도와 비유도 대조군의 비교.
   2. 선량 또는 시계열 전반에 걸친 고노화 상태 대 저노화 조건.
   3. 노화 고(高) 상태는 노감 완화제로 치료하는 것과 차량 처리 시 노화 조절.
   4. 노화-저 기저 그룹과 고노화군을 포함한 노년성 제거 치료 시리즈.
2. 모든 실험에 대한 최소 통제 구조를 확립하세요.
   1. 도금 밀도, 염색 시기, 영상 설정에 맞는 노화 저조 대조군을 포함하세요.
   2. 정의된 노화 유발 요인이나 후기 통과 복제 노화에 의해 생성된 노화 고그룹 포함.
   3. 각 조건별로 생물학적 복제를 포함하고, 모든 조건에서 동일한 타이밍으로 염색 및 영상 검사를 수행합니다.
3. 분석액 판독을 리소좀 재형성의 직접적인 이미지 기반 측정으로 정의합니다:
   1. 일관된 강도 임계값을 1차 검사 결과로 사용하여 리스 양성 마스크 내 세포별 평균 LysoTracker 강도를 측정합니다. 단일 세포 수준에서 이 지표는 가장 큰 효과 크기를 가진 저노화 상태와 고노화상태 조건을 구분하며, 현장 수준의 핵밀도에는 둔감하다(보충 그림 1).
   2. 다음 항목을 2차 판독으로 기록하는데, 이는 구획 확장을 문서화하지만 분할 선택이나 현장 수준의 핵 밀도에 더 민감합니다: 세포당 리소솜 농축 면적과 필드 수준에서 핵당 통합 LysoTracker 강도. 핵당 통합 강도는 인구가 많은 장에서는 유익하지만, 핵 수가 적은 장에서는 개별 세포가 정규화를 지배하여 불안정해집니다.
   3. 영상 해상도가 점액 구별을 지원할 경우 선택적으로 리소좀 지점 수와 크기 지표를 기록하세요.
4. 실험적 제약 조건에 따라 병렬 웰 또는 매칭된 샘플에서 노화 관련 β-갈락토시다제(SA-β-Gal) 염색을 선택적 검증 단계로 사용하세요. 이 검증을 바탕으로 후기 배양이 초기 배양 배양에 비해 SA-β-Gal 양성률이 더 높다는 것을 확인하라.
5. 데이터 수집 전에 다음 변수를 고정하여 조건별 검사를 표준화하세요:
   1. LysoTracker 작업 농도(75 nM)와 염색 지속 시간(30분).
   2. 핵염료 동일성 및 작동 농도 범위(예: Hoechst 33342, 1 μg/mL에서 2 μg/mL).
   3. 대물렌즈 배율, 노출 시간, 조명 강도, 빈잉, 초점 전략 등 영상 파라미터.
   4. 플레이트 형식 및 영상 구성(투명 바닥 영상판 또는 유리바닥 접시), 재현 웰 레이아웃 포함.
   5. 임계값 선택과 강도 정규화.
      1. 실험 내 모든 웰에서 LysoTracker 채널에 단일 고정 강도 임계값을 적용하여 라이소 양성 마스크를 정의합니다.
      2. 추정 강도 범위에 걸친 보정 필드 세트(예: 노화 저필드 두 개와 고노화 필드 두 개)를 사용하여 분석 설정 시 임계값을 한 번 선택하고, 세션 내 모든 웰에서 일정하게 유지합니다; 각 우물마다 임계값이 달라지도록 허용하면 측정과 결과 사이에 순환적 의존성이 생깁니다.
      3. 실험 간 비교를 위해, 동일한 레이저 출력, 노출, 이득 설정으로 단일 세션에서 모든 조건을 획득하고, 이 설정을 그림 판례에 보고하세요.
      4. 세션 간 절대 강도 비교가 필요하다면, 형광 기준 표준(예: 참조 비드 플레이트 또는 고정 기준 웰)을 포함하고 측정된 강도를 적절히 정규화합니다.
         참고: 동일한 획득 설정이나 참고 기반 정규화 없이 세션 간 원시 강도 값을 비교하지 마십시오.
   6. 핵밀도 정상화.
      참고: 노화 배양은 일반적으로 유사한 파종 시간에서 증식이 감소하고 핵밀도가 낮아지기 때문에, 절대 픽셀 수(예: 총 용소 양성 면적)를 기반으로 한 현장 단위 지표는 밭별 세포 수에 의해 영향을 받을 수 있습니다.
      1. 원시 값과 핵별 정규값(원시 값을 호에스트 분절 핵 수로 나눈 값)을 모두 보고합니다.
         참고: 핵 주각정규화는 밀도 관련 교란 변수를 제어하며, 세포별 해석에 적합한 비교입니다. 면적 기반 판독의 경우, 정규화된 값이 주요 지표로 사용되며, 완전성을 위해 정규화되지 않은 총합이 유지됩니다.
6. 라이브 셀 신호 품질을 보존하고 기술적 변동성을 최소화하는 조건에서 이미지를 획득합니다. 염색 및 운반 시 초기 및 후기 통과 판은 빛으로부터 보호하고, 영상 시 통제된 배양 조건 밖에 머무는 시간을 최소화하세요.
7. 형광 이미지를 단일 평면, 단일 채널, 무손실 TIFF 형식으로 저장하세요. 핵 이미지와 라이소트래커 이미지 간의 페어링을 유지하고 도금, 웰, 컨디셔닝, 복제에 대한 추적성을 유지하는 일관된 명명 체계를 사용하세요. 채널 접미사(예: _Hoechst.tif와 _Lyso.tif)가 붙은 공유 베이스 이름을 사용하세요. 실험별로 정리된 전용 폴더에 이미지를 저장하고, 필요에 따라 하위 폴더를 만듭니다.
   참고: 실질적인 잠시 멈춘 시점은 초기 통과와 후기 통과 코호트를 확립하고 후기 통과 배양이 성장 둔화와 노화 형태를 보인다는 것을 확인한 후입니다.
8. (선택 사항) 산소를 실험 변수로 포함시키기 위해 상위와 저산소 조건에서 일치하는 IMR-90 코호트를 유지합니다. 모든 그룹을 동일하게 처리하세요.

2. 세포 배양과 복제 노화 유도

1. 표준 세포 배양 관행에 따라 IMR-90 인간 폐 섬유아세포를 해동하고, 10% 태아 소 혈청을 보충한 최소 필수 배지(MEM)에서 세포를 증식합니다. 실험실 관행과 실험 설계에 일치한다면 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 추가하세요. 세포 온도는 5% CO₂에 37°C로 유지하세요.
2. 배양물을 로그 성장 및 통과 상태로 유지하여 70%에서 80% 합류 지점까지 진행하세요. 일관된 매체 취급과 급여 주기를 사용하여 실험 간 변동성을 줄이세요. 전체 배양지는 2일에서 3일마다 교체하세요.
   참고: 영양분 고갈과 분비 인자 축적은 스트레스 유발 표현형을 촉진하여 복제 노화를 혼동시킬 수 있으므로 매지를 72시간 이상 변하지 않도록 해야 합니다.
3. 노화-저 기저 그룹을 정상 성장 행동을 유지하는 조건에서 활성화된 IMR-90 배양으로 정의합니다. 도금 밀도와 취급 방식을 모든 실험 그룹과 일치시켜라.
4. 실험적 목적에 따라 선택된 다음 접근법 중 하나를 사용하여 노화가 높은 그룹을 생성합니다.
   1. 개체군 복제 노화를 연속 통과로 유도하여 증식 속도와 노화 관련 형태가 느려질 때까지 추적합니다.
      참고: 인구 증가 증가 수준(PDL)과 통과 수(passage number)는 별개의 측정 지표이며 별도로 추적됩니다. PDL은 해빙 후 누적 두 배 증가를 의미하며, 각 통로마다 다음과 같이 계산됩니다:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂ (수확된 세포 / 시드 세포)¹⁸,
      반면 통과 번호는 해빙 이후 하위문화의 수를 세는 것입니다. 배양은 일반적으로 약 70%–80% 합류율로 1:4로 나뉘기 때문에, 각 통로는 약 두 번의 개체군 배가를 기여하므로 통과 번호와 누적 PDL은 서로 교환 불가능합니다.
      참고: 노화 고배양은 일반적으로 개체군 2배가 증가한 고도급에서 관찰되며, 이때 확산이 느려지고 노화 관련 형태가 명확해지기 시작합니다. 정확한 임계값은 각 IMR-90 로트별로 실증적으로 결정되어야 하며, PDL은 공급업체마다 다르기 때문입니다.
   2. 정의된 노화 유발 요인을 적용하고 적절한 표현형 발달 창을 허용하여 스트레스 유발 노화.
   3. 치료 유발 노화는 연구 대상 질환에 세포를 노출시키는 경우, 해당 상태가 노화를 유발하는지 여부를 시험하는 것입니다.
5. 선택한 접근법이 평행 우물에서 수행된 최소 하나의 직교 판독을 사용하여 노화 고표현형을 생성하는지 검증합니다. 선택적 검증 방법으로 SA-β-Gal 염색을 수행하고, 포함 시 조건별 양성 세포 비율을 문서화합니다.
   1. 배양은 pH 6.0에서 12시간에서 16시간 배양 후 세포의 50% 이상이 명확한 청색 핵 주위 SA-β-Gal 염색을 보이는 경우, 동일한 염색 조건¹³에서 10%를 넘지 않는 노화 고(高) 배양에 해당한다.
   2. 이 범위를 벗어난 값은 불완전한 노화 유도 또는 배경 상승을 나타내며, 영상 촬영 전에 재최적화가 필요합니다.
      참고: 노화-저 및 고노화 코호트를 확립하고 형태학과 선택적 검증 염색을 통해 명확한 표현형 차이를 확인한 후 잠시 정지.
6. 선택 사항: 세노리틱 치료 설계
   1. 복제 웰에서 노화가 낮고 고노화가 높은 조건을 플레이트하여 세포가 부착하고 회복할 수 있도록 하여 치료 전에 사용합니다.
   2. 노화 고우물은 세노분해 화합물로 처리하고, 차량 처리 노화 고조군을 포함시켜야 합니다.
   3. 비노화 민감도를 모니터링하기 위해 동일한 매체와 관련된 동일한 화합물 농도로 처리한 노화 저그룹을 포함시킴.
   4. 모든 조건에서 치료 후 일정한 시간에 라이소트래커와 핵 염색을 실시하세요.
7. 후기 배설/치료 진행 중 배양을 모니터링하고 형태와 성장 패턴을 기록합니다. 증식 속도 느려짐, 형태의 확대 및 평탄화, 세포질 입자화 증가를 통해 노화 배양을 식별합니다. 성장 정지가 명확해지면, 배양 배양을 노화가 높은 코호트로 유지하여 염색과 영상 검사를 진행하며, 더 이상 통과시키지 마십시오.
8. 일관된 배지 준비, 일정한 급여 주기, 인큐베이터 밖에서의 일정한 취급 시간을 사용하여 배양 유지 관리 중 혼란 스트레스 요인을 최소화합니다. 온도 변동, 통제된 CO₂ 밖의 장시간 시간, 그리고 일관되지 않는 매질 온난화를 피할 수 있는 기술적 변동성의 원인으로 간주합니다.
9. 선택: 상존 산소와 저산소 환경에서 매칭 배양을 유지합니다. 배양 농도는 21% O₂ 이하, 5% O₂ 미만을 별도의 코호트로 유지하고, 가능하면 각 코호트를 정기 배양 처리 시 할당된 산소 조건 내에서 유지합니다. 저산소 환자를 위한 이식 및 영상 준비 시 주변 산소 노출을 제한하세요.
   참고: 실질적인 중단 시점은 초기 통과와 후기 통과 집단을 정의하고 안정화하며, 후기 통과 배양이 일관된 성장 둔화 및 노화 관련 형태를 보인다는 것을 확인한 후입니다.

3. 라이소트래커 딥 레드와 핵 염료를 이용한 라이소소좀 및 핵 염색

1. 모든 실험 조건에 대해 투명 바닥 영상판 또는 유리 바닥 접시에서 IMR-90 셀을 플레이트 부착합니다. 노화-저 대조군 조건과 선택된 유발 요인으로 생성된 최소 하나의 노화 고조 상태를 포함하고, 각 조건에 대한 생물학적 복제 사례를 포함하세요.
2. 염색 당일에 종자 세포를 통해 아준 융합 단층을 형성합니다. 각 실험마다 시딩 밀도와 도금과 염색 사이의 시간을 기록하여 런 간 비교 가능성을 지원하세요.
3. 완전 배양지를 37 °C까지 데워 보관합니다. 가열된 매질에 75 nM에서 LysoTracker Deep Red 작업 용액을 준비하고 빛으로부터 보호하세요. 작동 용액은 제조사에서 DMSO에서 공급한 1 mM LysoTracker Deep Red 스톡을 가열한 완전 배양 배지에 1:13,333 비율로 희석하여 제조합니다(예: 1 mM 육즙 0.75 μL, 가열된 배지 10 mL 분량).
   참고: 후기 통과 및 스트레스 유발 노화 세포는 리포푸신 및 기타 비특이적 자가형광 물질을 축적하여 넓은 파장 범위에서 방출하며, 염색되지 않은 대조군에서 겉보기 LysoTracker 신호에 기여할 수 있습니다¹⁴. 특정 실험에서 자가형광의 기여도를 추정하려면, 각 조건마다 최소 한 개의 염색되지 않은 우물을 포함하고 동일한 영상 환경에서 획득해야 합니다. 염색되지 않은 웰 평균 신호를 염색 웰 측정값에서 빼거나, 원시 값과 배경 감량 값을 모두 보고할 수 있습니다.
   참고: 실제로 IMR-90 배양에서 염색되지 않은 LysoTracker 채널 신호는 염색된 노화 신호에 비해 작으며(본 데이터셋에서 염색된 노화 평균의 약 5%에서 10%) 있지만, 통과 수에 따라 기여도가 증가하며, 심부 노화 또는 종양유전자 유도 노화 배양에서는 20% 이상으로 상당히 증가할 수 있습니다 ^6,14. 새로운 세포 유형 또는 노화 유도 모델에 이 프로토콜을 적용할 때는 항상 자가형광 크기를 검증하세요.
4. 모든 유정에 대해 충분한 LysoTracker 작업 용액을 준비하세요. 작업 용액을 부드럽게 뒤집어 섞고, 사용 전까지 빛으로부터 보호하세요.
5. 각 웰에서 사용한 매체를 흡입하세요. 단일층을 방해하지 않고 웰 전체에 일정한 염색 부피를 유지하기 위해 LysoTracker 작업 용액을 부드럽게 뿌려 유물에 맞게 덧입으세요.
6. 세포를 37°C, 5% CO₂에서 30분간 배양합니다. 모든 실험 그룹은 동일한 배양 기간과 온도를 유지하세요.
7. 라이소트래커 인큐베이션 마지막 10분 동안 생 핵 염료를 추가하세요. Hoechst 33342를 제조사가 권장하는 작업 농도(예: 1 μg/mL에서 2 μg/mL)로 LysoTracker 함유 배지에 직접 첨가한 후, 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합합니다.
8. 배양 종료 시 염색 매체를 제거하세요. 한 번 미리 가열된 인산염 완충 식염수로 세포를 헹구어 배경 형광을 줄이세요.
9. 헹군 직후 미리 가열한 페놀 적색 프리 배양지나 영상 완충액을 추가하세요. 바로 라이브 이미징으로 진행하여 실험 내 모든 웰에서 버퍼 교환과 이미지 획득 사이에 일정한 시간을 유지하세요.
10. 이식 및 영상 설정 시 플레이트를 빛으로부터 보호하세요. 취급 및 이미지 획득 시 온도 및 CO₂ 조건 밖에서 머무는 시간을 최소화하세요.
    주의: 형광 염료는 장갑과 안구 보호구를 착용하여 다루세요. 염료 함유 액체와 오염된 소비품은 기관의 화학 안전 절차에 따라 폐기해야 합니다.
    참고: 영상 촬영이 여러 판을 스테이징해야 한다면 Step 3.9 이후에 일시정지 지점을 사용하세요. 플레이트는 37°C에서 빛으로부터 보호하고, 착색 드리프트를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 영상 촬영을 재개하세요.
    참고: 실험 설계에 산소를 변수로 포함할 경우, 염색 및 배양 기간 동안 각 코호트를 할당된 산소 조건 내에서 유지하고, 할당된 조건 외의 취급 시간을 기록하세요.

4. 검증을 위한 SA-β-Gal 염색(선택 사항)

1. SA-β-Gal 염색을 선택적 검증 단계로 사용하여 노화 고조군에 비해 SA-β-Gal 활성이 증가함을 확인한다. 동일한 판 형식과 동일한 처리 일정 하에 처리된 병렬 웰에 대해 검증을 수행합니다.
2. 고정 전에 검증 웰을 위한 완전한 라이브 이미징. 동일 필드의 사전 및 후 고정 비교가 필요할 때(그림 2), 획득 시 단계 좌표를 기록하고, 고정 및 염색 후 각 필드를 수동으로 재배치하며, 핵 위치와 세포 형태를 육안으로 점검하여 일치하는 필드가 일치하는지 확인한 후 후속 분석에 포함시킨다.
3. SA-β-Gal 염색 키트에 포함된 고정액을 사용하며, 권장 1배 작업 농도로 2% 포름알데히드와 0.2% 글루타알데히드를 포함합니다. 상온에서 10분에서 15분간 배양하세요. 참고로, 고정액에는 인산 완충 식염수에 2%(w/v) 포름알데히드와 0.2% (w/v) 글루타알데히드가 포함되어 있습니다. pH 6.0의 SA-β-Gal 염색액에는 사용 직전 디메틸포름아마이드에 용해된 1 mg/mL X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노사이드), pH 6.0의 40 mM 구연산/인산나트륨 완충제, 5 mM 페로시안화물 칼륨, 5 mM 페리시안화물 칼륨, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂^12,13이 포함되어 있습니다. 이 사양에 맞는 상업용 키트는 염색 완충 pH가 6.0으로 검증된다면 서로 교환하여 사용할 수 있습니다.
4. 고정제를 제거하고 인산염 완충 식염수로 웰을 두 번 헹구세요. 각 웰에 x-gal 기질을 포함한 pH 6.0의 SA-β-Gal 염색액을 첨가합니다.
5. 배양 중 증발을 제한하기 위해 플레이트를 밀봉하세요. 플레이트를 37°C, CO₂ 프리 인큐베이터에 12-16시간 동안 넣으세요.
6. 밝시야 현미경으로 웰을 검사하고 염색 패턴을 기록하세요. 각 상태에 대한 대표성 이미지를 획득하고, 결과 검증 시 웰당 SA-β-Gal 양성 세포의 비율을 보고합니다.
   주의: 포름알데히드와 글루타알데히드는 독성이 있고 휘발성이 있습니다. 화학 훈풍 후드에서 고정 용액을 준비하고 사용하며, 장갑, 안구 보호구, 실험복 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   참고: SA-β-Gal 염색에서 노화 저조군에서 높은 배경 또는 노화 고조군에서 약한 염색이 나타나면, 도금 밀도, 고정 시간, 배양 기간, 온도 일관성을 조정한 후 완충 pH 6.0을 유지한 후 재검증합니다.

결과

이 프로토콜을 노화 저증 및 고노화 조건에서 IMR-90 섬유아세포에 적용하면, 단일 세포 수준 및 필요 시 전체 필드 수준에서 요약할 수 있는 정량적 리소좀 수치를 얻을 수 있습니다.

그림과 표에 표시된 대표 데이터셋은 13번 통로(P13; 노화 저, ~PDL 26)와 23번 통로(P23; 고풍, ~PDL 46)의 IMR-90 배양을 비교한 단일 생물학적 실험에서 유래했습니다. 조건당 2개의 우물을 촬영했으며, 각 우물당 44개의 유전(총 176개 유전; 조건당 88개)이 획득되었습니다. 그림 2D의 각 우물 상관관계수는 이 44개의 우물당 필드의 평균에서 계산되었으며, n = 총 4점(조건당 2점)입니다. 표 1 과 보충 표 1 은 각 조건별로 대표적인 20× 필드를 ...

토론

이 프로토콜은 리소좀 재모델링을 통해 노화를 측정하고, 세포별 및 웰당 노화 부담의 정량적 판독을 제공하는 생세포 영상 워크플로우를 설명합니다. 신뢰할 수 있는 검사를 얻기 위해서는 여러 단계가 특히 중요합니다. 첫째, 생물학적 모델 자체가 잘 통제되어야 합니다. IMR-90 섬유아세포에서 복제 노화를 유도하려면 개체군 증가 증세를 신중히 추적하고 초기 통과 배양의 병행 유지 관리가 필요하며, 비노화 기준 ^2,3,18. 통과 이력이나 합류의 작은 편차가 노화 세포의 비율을 이동시켜 분석의 동적 범위를 변화시킬 수 있습니다. 둘째, 리소좀 및 핵 염색 조건은 엄격히 표준화되어야 합니다. 라이소트래커 농도, 배큐 시간 및 온도, 핵 염색 노출 모두 신호 강도와 분절 품질에 영향을 미칩니다. 마지막으로, 영상...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
24웰 조직 배양 플레이트(평면 바닥, TC 처리)	CellTreat Scientific Products	229124	라이브 셀 형광 이미징과 호환되는 모든 투명 바닥 다중 웰 배양 플레이트(예: 6-, 12-, 또는 24웰 TC 처리 폴리스티렌 플레이트; 고해상도 이미징을 위해서는 유리 바닥 이미징 플레이트가 선호될 수 있음).
베타-갈락토시다제 염색 키트(노화 분석)	Cell Signaling Technology	9860	pH 6.0의 검증된 염색 버퍼가 있는 모든 상업용 SA-β-갈락토시다제 키트. 참고로, 고정 용액은 PBS에 포름알데히드 2%와 글루타르알데히드 0.2%를 포함하고, 염색 용액은 DMF에 X-gal 1 mg/mL, 시트르산/인산 칼륨 40 mM pH 6.0, 칼륨 페로시아나이드 5 mM, 칼륨 페리시아나이드 5 mM, NaCl 150 mM, MgCl2 2 mM을 포함합니다.
BioRender(과학 일러스트레이션 소프트웨어)	BioRender	N/A — 웹 애플리케이션	도식적 그림(그림 1–3) 제작에 사용됨. https://www.biorender.com
이산화탄소 가스(CO2), 압축 실린더	Airgas(또는 유사 공급업체)	N/A	세포 배양 인큐베이터 및 온스테이지 이미징 챔버에서 5%의 대기를 유지하는 데 사용되는 의료 등급 CO2.
열활성화 소화된 우태 태아 혈청(FBS)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	완전 배양 배지에서 10% v/v로 사용되는 56 °C에서 열활성화된 모든 세포 배양 등급 FBS.
라이브 셀 기능이 있는 형광 현미경	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	라이브 셀 온도 및 CO2 제어, 원적외선(발광 ~647 nm / 발광 ~670 nm) 및 DAPI/Hoechst(발광 ~405 nm / 발광 ~460 nm) 채널에 대한 필터 세트, 리소좀 특징을 분해하기에 충분한 NA를 갖춘 20×-40× 목적으로 구성된 모든 와이드필드 또는 공초점 형광 현미경. 이 연구에서는 EVOS M7000 이미징 시스템이 사용되었습니다.
Hoechst 33342 핵 염색	Thermo Fisher Scientific	H3570	라이브 셀 핵 염색(파란색 형광, 발광 ~405 nm)을 위한 세포 투과성 DNA 염료. DAPI와는 상호 교환할 수 없으며, DAPI는 생리학적 조건 하에서 세포 투과성이 없습니다.
이미지 분석 소프트웨어	Python Software Foundation	N/A	핵 분할, 핵-세포 영역 확장, 강도 임계값 설정 및 기본 이미지 통계(예: scikit-image를 사용한 Python, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler)를 지원하는 모든 과학적 컴퓨팅 환경. 이 연구를 위해 SenTrack 파이프라인(보충 파일 S1 참조)이 개발되었습니다.
IMR-90 인간 폐 섬유아세포(세포주)	ATCC	CCL-186	복제 노화를 모델링하는 데 사용되는 정상 인간 태아 폐 이배체 섬유아세포 주; 유사하게 특성화된 인간 섬유아세포 주를 대체할 수 있음.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	라이브 셀 산성 소기관 염색을 위한 산성 형광 염료; DMSO에 1 mM 스톡으로 제공됨. 준비된 세포 배양 배지에서의 작동 농도는 75nM입니다.  원적외선 발광(발광 647 nm / 발광 668 nm)은 지질 형광 자체 형광과의 겹침을 최소화하지만 제거하지는 않습니다.
최소 필수 배지(MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	IMR-90 섬유아세포의 기본 배양 배지; 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충됨. 글루타민을 포함하는 Earle's 최소 필수 배지의 표준 공식을 대체할 수 있습니다.
페니실린-스트렙토마이신 용액(100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	완전 배양 배지용 항생제 보충제; 1% v/v(최종 ��