이 프로토콜은 건강한 모델과 COPD 모델, 즉 건강한 모델과 COPD 모델에 대해 인간 일차 기도 상피세포와 폐 미세혈관 내피세포를 결합한 동적 폐 온 칩 공동 배양 시스템을 구축합니다. 이 시스템은 공기-액체 경계 및 흐름 하에서 기도-혈관 상호작용을 재현하며, 장벽 평가, 세포 표현형 분석 및 RNA 분석을 제공합니다.
이 논문에서
요약
초록
1차 기도 상피 및 폐 미세혈관 내피세포를 통합하여 기도-혈관 인터페이스를 재현하기 위해 두 가지 동적 폐-혈관 공동 배양 모델이 개발되었습니다. 한 모델은 건강한 기증자의 시민 세포를 사용하고, 다른 모델은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 환자에서 유래한 세포를 사용하여 동일한 배양 조건에서 건강한 상태와 병든 상태를 직접 비교할 수 있습니다. 두 모델 모두 연속 관류 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 조건 하에서 상피 분화를 지원하여, 기저 내피층이 지지하는 생리학적으로 중요한 상피 장벽을 형성합니다. 워크플로우에는 세포외 기질 코팅, 세포 시딩, ALI 형성, 장벽 기능 평가, 세포 표현형 분석, 세포 유형 특이적 RNA 추출이 포함됩니다. 투과성 분석은 두 시스템 모두에서 견고한 장벽 무결성을 입증했으며, 면역형광 검사는 세포 접합부에서 Zonula Occludens-1(ZO-1)과 혈관 내피 카데린(VE-cadherin)의 지속적인 위치 확인을 확인했습니다. 상피 분화는 β-튜불린 IV 염색과 섬모 박동의 시각화로 확인되었습니다. 각 구획에서 고품질의 RNA가 별도로 얻어져 세포 유형별 분자 분석을 지원하였습니다. COPD 모델은 점액 생성 증가 등 질병의 주요 특징을 재현하면서도 장벽 기능이나 세포 생존력을 저해하지 않았습니다. 환자 유래 상피 및 내피 세포의 사용은 개별 병리학적 특성을 보존하여 COPD의 세포간 기전 연구를 가능하게 합니다. 이 접근법은 정적인 시험관 및 동물 모델에 대한 생리학적으로 적합한 대안을 제공하며, 흡입 약물, 병원체 노출, 상피-내피 상호작용에 대한 전임상 연구를 지원합니다. 중요한 점은, 건강한 폐 및 COPD 폐 모델 모두 직접 비교 연구를 위해 병행하거나, 기전 조사, 치료 시험, 신약 개발에 독립적으로 활용될 수 있다는 것입니다. 이 시스템은 상피 또는 내피 구획의 변형과 관련된 다른 호흡기 질환에도 적용할 수 있어, 호흡기 연구를 위한 다재다능하고 중개 플랫폼이 됩니다.
서론
기도 상피세포와 폐 미세혈관 내피세포 간의 상호작용은 폐의 항상성 유지와 손상, 감염, 염증에 대한 반응 조정에 필수적입니다. 이 세포 유형들은 함께 가스 교환, 면역 감시, 혈관 투과성을 조절하는 기능적 장벽을 형성합니다. 이들의 동적 교차 대화는 파라크린 신호 전달, 직접 세포 간 상호작용, 기계적 자극에 대한 반응을 포함하며, 이 모든 것은 폐 기능과 구조적 완전성에 매우 중요합니다.
만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 만성 염증, 기도 재형성, 폐포-모세혈관 경계 파괴를 특징으로 하는 진행성 폐 질환으로, 기도 상피와 폐혈관 내피 모두의 장벽 기능이 손상되고 이상 사이토카인 방출과 조직 수리 기전 조절 이상을 동반합니다 2,3. 그러나 기도 상피세포와 폐 미세혈관 내피세포 간의 상호작용은 아직 잘 이해되지 않았습니다. 이 한계는 부분적으로 기존의 시험관 내 및 생체 내 모델의 한계 때문입니다. 동물 모델이 호흡 생리학과 병리학에 중요한 통찰을 제공했지만, 면역 기능, 폐 구조, 세포 신호 전달, 약물 대사의 종간 차이로 인해 인간 생물학으로의 번역이 방해받을 수 있어 그 관련성이 제한됩니다.
2차원(2D) 유산 기도 상피 세포주 배양과 같은 기존 시험관 내 시스템은 기도 상피의 주요 특징인 적절한 분화와 생체역학적 반응성을 재현하지 못합니다. 3차원(3D) 공기-액체 인터페이스(ALI) 단일 배양 기관 기도 상피세포가 생리학적 관련성을 높여주지만, 정체적이며 다른 세포 유형 및 기계적 자극과의 상호작용이 부족합니다. 폐는 공기 흐름, 전단 스트레스, 세포외 기질 강성, 호흡에 의해 발생하는 주기적 신장에 지속적으로 노출되는 역동적인 기관입니다. 이러한 요인들은 세포 행동과 조직 재형성에 강한 영향을 미칩니다. 따라서 정적인 모델만으로는 백혈구 부착, 면역 세포 수송, 약물 노출에 대한 실시간 반응과 같은 과정을 재현하기에 부족합니다.
이러한 한계를 해결하기 위해 복잡한 세포 상호작용을 모델링하는 첨단 시스템으로 오르간 칩 플랫폼이 등장했습니다. 폐 온 칩 모델은 마이크로플루이딕 기술과 인간 유래 세포를 통합하여 폐 미세환경의 주요 구조적·기계적 특징을 재현합니다. 이 플랫폼들은 생 체 내 조건6을 보다 유사하게 모방하는 역동적이고 3차원적인 환경 내에서 기도 상피 및 폐혈관 내피세포의 공동 배양을 가능하게 합니다. 생리적 호흡 동작, 체액 흐름, 실시간 모니터링의 도입은 정상 및 질병 상태 모두에서 상피-내피 간 소통 연구를 향상시킵니다7–9.
이러한 발전에도 불구하고, 대부분의 기존 폐 온 칩 시스템은 건강한 기증자로부터 유래한 세포에 의존하고 있어 질병 특이적 상호작용을 모델링하는 데 한계가 있습니다. 또한 많은 플랫폼이 환자 유래 세포를 통합하거나 복잡한 COPD 미세환경을 재현하는 유연성이 부족합니다. 더불어, 상업적 출처든 COPD 환자든 세포 유형별 세포외기질(ECM) 코팅을 이용한 일차 기도 상피 및 폐 미세혈관 내피세포의 공동 배양에 관한 상세한 프로토콜은 여전히 제한적입니다.
본 연구에서는 상업적으로 이용 가능한 2채널 마이크로유체 폐 온 칩 플랫폼을 사용하여 1차 기도 상피세포와 폐 미세혈관 내피세포를 포함하는 두 개의 공동 배양 모델을 구축하였습니다. 건강한 모델은 다양한 기증자에서 유래한 상업용 세포를 사용하여 작성되었으며, COPD 모델은 동일한 환자에게서 얻은 기도 상피세포와 내피세포를 사용해 구축되었습니다. 두 모델 모두 생 체 내 폐 미세환경을 더 잘 모방하기 위해 세포 유형별 ECM 코팅을 사용합니다. 이 시스템들은 생리적·병리학적 조건 하에서 상피-내피 상호작용을 조사할 수 있게 합니다. 건강한 모델과 COPD 모델은 직접 비교 연구를 위해 결합되어 사용되거나 기전적 조사 및 치료 검사에 독립적으로 사용할 수 있습니다.
이 공동 배양 시스템은 기도 상피와 폐혈관의 해부학적 조직을 반영하며, 이들은 통합된 상피-내피 단위로 기능합니다. 기도 상피는 기저 세포, 분비 세포, 섬모 세포로 구성된 의사층으로, 혈관 결합 조직층(고유 층)에 위치하며 내피와 기저막에 의해 분리되어 있습니다. 이 모델에서 ECM 코팅(콜라겐 타입 I, 피브로넥틴, 라미닌)은 상피 및 내피 기저막의 조성을 근사적으로 나타냅니다. 두 채널을 나누는 다공성 막은 상피하 결합 조직을 모방하지만, 혈관 복잡성은 부족합니다. 상피-내피 통신에는 파라크린 신호, 투과성 조절, 면역 세포 모집, 호흡 유발 신장 같은 기계적 자극에 대한 반응 등 다양한 메커니즘이 기여하며, 이는 혈관 저항과 기계적 전달 경로에 영향을 미칩니다.
이 방법론적 연구는 기저 폐 미세혈관 내피를 가진 공기-액체 경계면(ALI) 조건 하에서 완전히 분화된 기도 상피를 확립하는 데 필요한 단계를 개괄합니다. 이 시스템은 장벽 무결성의 질적 및 기능적 평가를 가능하게 하며, 1 × 10⁻6 cm/s ≤ 재현 가능한 겉보기 투과성(Papp) 값을 달성합니다. 또한, 세포 표현형 분석과 각 구획에서 RNA의 추출 및 정량을 위한 프로토콜이 제공되어 일관되게 고품질 RNA(RNA 무결성 번호 > 7)를 제공합니다. 이 방법은 mRNA 정량 분석이나 점액 생성의 상세 평가를 목적으로 하지 않으며, 기계적 신장 효과를 조사하지도 않지만, 이 시스템에서는 이러한 응용이 가능합니다.
프로토콜
모든 일차 인간 세포 사용은 지역 윤리 위원회 UZ 루벤 연구소(S51577/S57114/S70453)의 승인을 받았습니다. 상업적으로 이용 가능한 일차 인간 기관지 상피세포(HBEC)와 폐 미세혈관 내피세포(HPMEC)는 비흡연 기증자 두 명으로부터 얻었습니다(보충표 1, 2). COPD 모델용 1차 세포는 흡연 이력이 있는 3명의 COPD 환자의 이식된 폐 조직에서 분리되었으며(보충표 3), 잘 확립된 프로토콜(윤리 승인 S51577)에 따라 BREATHE 바이오뱅크에 보관되었습니다. HBEC와 HPMEC는 동일한 COPD 환자로부터 채취하였습니다.
건강한 폐 온 칩 모델을 확립하기 위해 상업용 HBEC와 HPMEC가 사용되었습니다. COPD 모델에서는 폐 이식 후 같은 환자로부터 제거된 폐 조직에서 1차 기관지 상피 및 폐 미세혈관 내피세포를 분리하였습니다. 본 연구에서 사용된 폐 온 칩 시스템은 다공성 기질 매트릭스 막으로 분리된 평행한 기도(상단)와 혈관 (하단) 마이크로채널로 이루어진 마이크로유체 2채널 플랫폼입니다(그림 1). 동일한 프로토콜을 사용해 건강한 모델과 COPD 모델 모두를 구축했습니다. 프로토콜에 사용되는 화학물질, 시약 및 키트는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 층류 하에서 폐 온 칩 공동 배양 모델 구축
- 칩 준비
- 칩 크래들을 모서리가 위를 향한 120mm 정사각형 세포 배양 접시에 넣어 올바른 방향을 확인한 후, 칩을 크래들에 넣습니다. 활성화 단계 전에 모든 칩이 올바르게 배치되었는지 확인하세요(그림 2).
- 활성화 용액을 제조사에서 제공하는 해당 버퍼에 활성화 시약 분말을 용해시켜 최종 농도인 0.5 mg/mL를 만듭니다.
- 칩 채널의 내부 표면을 활성화하여 약 35 μL의 활성화 용액을 하단 채널 입구를 통해 세포외 매트릭스(ECM) 부착을 촉진합니다. 피펫을 사용해 용액이 하단 채널 출구에서 빠져나오기 시작할 때까지 사용하세요. 약 50 μL의 용액을 상단 채널 입구에 주입하여 과정을 반복합니다.
참고: 활성화 시약 가루는 빛에 민감합니다. 활성화 용액은 사용 직전에 준비하고, 재구성 후 1시간 후에 남은 용액은 버리세요. - 부드러운 흡입으로 칩 표면의 과도한 활성화 용액을 모두 제거합니다. 활성화 용액은 반드시 칩 표면에서 제거해야 하며, 채널에서 흡입하지 마세요.
참고: 자외선(UV) 활성화 전에 현미경으로 채널을 검사하여 기포를 감지하세요. 기포가 있다면 활성화 용액으로 부드럽게 세척하여 모든 기포를 제거하세요. - 칩을 UV 램프에 10분간 노출한 후, 각 채널을 해당 버퍼 200 μL로 두 번 세척합니다.
- 위에서 설명한 대로 신선한 활성화 용액을 두 채널에 피펫으로 주입하고, 칩을 추가로 5분간 UV에 노출시킵니다.
- 두 채널에서 용액을 완전히 흡인하고, 각 채널에 해당하는 200 μL 버퍼로 두 번 세척한 후, Ca2⁺ 및 Mg2⁺ (DPBS -/-) 없는 멸균 차가운 인산염 완충 식염수 200 μL 로 각 채널을 한 번 세척합니다.
- DPBS(-/-)에 인간 콜라겐 타입 I(100 μg/mL), 인간 피브로넥틴(50 μg/mL), 인간 라미닌(50 μg/mL)을 포함한 ECM 코팅 용액을 준비합니다. 칩당 기준 용액 100 μL를 사용하세요.
- 상단 채널에 50 μL, 하단 채널에 35 μL를 추가한 후 동시에 출구 포트를 통해 유출물을 흡입합니다.
참고: 현미경으로 채널을 검사해 기포가 있는지 확인하세요. 만약 남아 있다면, ECM 용액으로 부드럽게 세척해 제거하세요. - 밤새 배화하는 동안 증발을 방지하기 위해 채널 입구와 출구 포트 양쪽에 작은 ECM 용액 방울을 남겨두세요.
- 칩을 37°C에서 5% CO₂와 함께 배양하세요. 다음 날, ECM 용액을 흡입한 후 200 μL 미리 예열된 DPBS(-/-)를 37 °C에서 세척합니다.
- 세포 시딩 및 잠수 배양
기도 상피 세포 확장 배지를 사용해 인체 콜라겐 IV(DPBS 내 150 μg/mL, -/-))로 코팅된 T25cm 2 플라스크에서 HBEC를 60%–70% 일치율에 도달할 때까지 확장합니다.
동시에 내피세포(EC) 배양지를 사용해 젤라틴(2 mg/mL in DPBS(-/-))으로 코팅된T75 cm 2 플라스크에서 HPMEC를 90%–100% 융합 지점까지 확장합니다.
주요 시약과 배양 배지의 조성에 대해서는 보충 표 4 를 참조하십시오. - HPMEC 시딩
- 매체를 흡입하세요. 세포를 10 mL DPBS(-/-)로 세척합니다.
- 0.25% 트립신-EDTA 3mL(1X)를 추가하세요. 상온(RT)에서 30초간 배양하세요.
- 트립신을 비활성화하기 위해 12mL EC 성장 배지(사용된 트립신 양의 4×)를 추가합니다. 5mL EC 배양지를 추가하여 잔류 세포를 수집합니다(최종 부피 = 20 mL).
- 현미경으로 완전히 세포 박리를 확인해.
- 트리판 블루를 사용해 살아있는 세포를 세기 위해 ~20 μL을 섭취하세요.
- 잔류 세포 현탁액을 ×50 mL 원뿔관 내에서 5분간 RT 5분간 원심분리합니다.
- 펠릿을 EC 성장 배지에 다시 현탁하세요. 7× 10개의6 세포/mL로 조절하세요.
- HPMEC(통로 5)를 하단 채널에 씨앗 삽입합니다(~20 μL; 채널당 1.4 ×10 5 셀).
- 즉시 칩을 뒤집어 37°C에서 2시간 동안 5% CO₂와 함께 배양하세요(그림 3).
- 칩을 원래 방향으로 돌려주세요.
- 200 μL 따뜻한 37°C의 EC 성장 배지로 세척하세요.
- 현미경으로 부착 상태를 확인하세요. 필요하면 잠복 기간을 연장하세요.
- HBEC의 시딩
- 매체를 흡입하세요. 5mL 따뜻한 DPBS(-/-)로 세척하세요.
- 트립신 1mL를 추가하세요. 5% CO₂를 사용하여 37°C에서 5분간 배양하세요.
- 현미경으로 분리대를 감시하세요.
- 1:1 비율로 1mL 정의 트립신 억제제(DTI)를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.
- 8mL 기도 상피 세포 확장 배양액(최종 부피 = 10 mL)을 추가합니다.
- 50mL 튜브로 옮깁니다.
- 트리판 블루를 사용해 세포 세기를 위해 ~20 μL을 복용하세요.
- 남은 셀 현탁액을 200 × g에서 5분간 RT로 원심분리합니다.
- 상원액은 버리세요.
- 탄환을 기도 상피 세포 확장 배지에 재현탁합니다. 3.5×10 6 세포/mL로 조절하세요.
- 기도 상피 세포 확장 배지에 50 nM 합성 광안정 레티노산과 10 ng/mL 재조합 인간 표피 성장인자(rhEGF)를 보충합니다.
- HBEC(2번 통로)를 상단 채널(~35 μL; 채널당 1.2 × 105 셀)에 씨앗을 주입합니다.
- 37°C에서 5% CO₂와 함께 4시간 배양합니다(그림 4).
- 두 채널 모두 매체를 교체하세요.
- 5% CO₂를 사용하여 37°C의 정적인 조건에서 하룻밤(ON)을 배양합니다.
참고: 이 단계부터는 모든 단계에 탈기 매체만 사용하세요. 탈기는 칩 내 기포 형성 위험을 최소화하기 위해 진공 시스템에 연결된 스테리플립 유닛으로 수행해야 합니다.
- 흐름과의 연결
- 상부 유입구 저장소에 합성 광안정성 레티노산과 rhEGF를 보충한 따뜻한 37°C 기도 상피 확장 매체를 추가하세요.
- 하단 유입구 저장소에 따뜻한 37°C의 EC 성장 배지를 추가하세요.
- 각 유입 저장소에는 3mL 매개체를, 각 출구 저장소에는 300 μL를 채웁니다.
- 휴대용 모듈을 배양 모듈에 넣으세요(그림 5).
- 다이얼을 눌러 회전식 다이얼을 사용해 "프라임" 사이클을 선택하세요.
- 다이얼을 눌러 사이클을 시작 하세요.
- 사이클을 계속 진행하세요 (~1분).
- 각 모듈 하단의 네 개 유체 포트 모두에 물방울이 있는지 점검하세요.
- 물방울이 보이지 않으면 '프라임' 사이클을 반복하세요.
- 두 칩 채널을 적절한 매체로 한 번 세척하세요.
- 기포 형성을 막기 위해 각 입구와 출구 구멍에 방울을 남겨두세요.
- 칩을 주로 잡는 손에, 휴대용 모듈을 다른 손으로 잡으세요.
- 칩을 트랙에 완전히 끼울 때까지 밀어 넣으세요.
- 조립된 유닛을 컬처 모듈에 넣으세요.
- 회전식 다이얼을 사용해 두 채널의 유량을 30 μL/h로 설정하세요.
- 액체-액체 인터페이스(LLI) 조건을 유지하세요.
- 칩을 모듈에 액체-액체 인터페이스(LLI) 상태로 유지하여 상피 및 내피층이 균일하게 형성되도록 합니다
- 미디엄은 3일마다 교체하세요. 배출구 저장소에서 매체를 흡입하세요. 각 유입구 저장소에 신선한 배지 3mL를 추가하세요.
참고: 현미경으로 기포가 있는지 관찰하세요. 만약 존재한다면, 칩을 분리하고 채널을 매체로 플러시한 후 다시 연결하세요.
- 상피세포 분화 및 공기 액체 인터페이스 배양
- 매일 현미경으로 세포를 관찰하세요.
- 틈이 없는 균질한 상피 세포층 형성(보통 3–5일)을 확인한다.
- 공기-액체 계면(ALI)을 구축합니다.
- 상단 유입구와 출구 저장소에서 매체를 흡입하세요.
- 회전 다이얼을 사용해 유량을 600μL/h로 증가시켜 상단 채널의 잔류 매질을 세척합니다
- 상단 출구 저장소에서 매질을 급속히 흡입하세요.
- 하단 유입구 저장소에서 매체를 흡입하세요.
- 3 mL 상피 분화 배지를 10 ng/mL 혈관 내피 성장 인자(VEGF)와 1 μg/mL 비타민 C를 첨가합니다.
- 상단 채널을 회전식 다이얼로 '에어'로 설정하세요.
- 하단 채널 유량을 30 μL/h로 설정하세요.
- ALI 배양을 2주간 유지하세요.
- 현미경으로 상피 분화의 발달을 관찰하세요.
- 의사층상 상피 형성을 확인하세요. 섬모의 박동과 점액 분비를 관찰하세요.
- 입구 및 출구 영역의 내피세포 형태를 모니터링합니다.
그림 1: 마이크로플루이딕 폐 온 칩 플랫폼. 2채널 마이크로플루이딕 폐 온 칩 장치의 단면도(왼쪽)와 상단(오른쪽)입니다. 도면 도는 설명 목적으로만 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 칩 크래들 내 칩 위치 칩 크래들의 올바른 방향과 위치를 보여주는 대표적인 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 3: 마이크로플루이딕 칩 내 내피세포 시딩. 시딩 직후(A)와 2시간 인큐베이션 후(B) 후의 폐 미세혈관 내피세포의 대표적인 밝은 영역 이미지. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 4: 마이크로플루이딕 칩 내 기도 상피 세포 시딩.
시딩 직후(A)와 4시간 후 잠복 후(B) 후의 기도 상피세포의 대표적인 밝시야 이미지. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 5: 마이크로플루이딕 폐 온-어-칩 시스템의 구성.
그림 상단은 중간 공급 및 폐수 수집에 사용되는 4개의 저수지(2개 유입구와 2개 출구)를 가진 휴대용 모듈을 보여줍니다. 마이크로유체 장치는 유량을 조절하는 컬처 모듈과 가스, 공기, 전력을 공급하는 허브 모듈에 연결되어 있습니다. 회로도는 단지 설명 목적으로만 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
2. 장벽 무결성 평가
장벽 무결성은 두 가지 방법으로 평가되었습니다. 첫째, 기능적으로는 형광 표지된 덱스트란에 대한 투과성을 시간에 따른 평가(ALI 전후와 10일 후), 둘째, 정성적으로는 기관지 상피에서 Zonula occludens-1(ZO-1)과 폐혈관 내피에서 혈관 내피-카데린(VE-cadherin)을 면역 검출하여 평가했습니다.
- 장벽 함수
- 층류 아래에서 VEGF와 비타민 C가 보충되고 100 μg/mL 형광 표지된 덱스트란이 포함된 상피 분화 배지 1mL를 기도 채널 상단 입구 저장소에 첨가합니다. 동시에 혈관 통로의 하단 입구 저장소에 1mL의 트레이서 프리 배지를 첨가합니다.
- 트레이서가 포함된 배지를 상단 채널에 주입하세요. 회전 다이얼을 사용해 두 채널의 유량을 600 μL/h로 3분간 설정한 후, 상하 출구 저장소에서 매질을 흡입합니다.
- 휴대용 모듈에 연결된 칩을 다시 배양 모듈에 넣으세요. 회전식 다이얼을 사용해 두 채널 모두 45 μL/h의 유량으로 설정하고 이 유량을 3시간 동안 유지합니다.
- 상하 출구 저장소에서 각각 100 μL의 배지를 수집하고 플레이트 리더기를 사용해 형광 강도를 측정합니다.
- 표본 투과율(Papp)을 다음 방정식을 사용하여 계산합니다:
여기서 SA는 공동 배양 채널의 표면적(0.17 cm2)을 나타내며, QR 과 QD 는 각각 투입 및 수신 채널의 유체 유량(cm3/s)을, CR,0 및 CD,0 는 각각 투입 및 수신 채널에서 회수된 농도에 해당합니다.
참고: Papp 값이 1 x 10-6 cm/s 미만이면 강한 장벽 무결성을 나타내며, 상피층이 추적자에 대한 투과율이 낮음을 반영합니다. 이 임계값은 시스템 제조업체가 내부 품질 관리 조치로 설정합니다.
- 밀착 접합부와 부착부 접합부의 면역 검출
- ALI를 2주간 사용한 후에는 조심스럽게 휴대용 모듈에서 칩을 제거하세요.
- 세포를 고정하여 20분간 양쪽 채널에 4% 파라포름알데히드(PFA) 50 μL을 추가하여 고정합니다.
주의: PFA는 독성이 있습니다; 인증된 화학 연기 후드에서 모든 과정을 수행하세요. - 두 채널 모두 200 μL DPBS(-/-)로 두 번 세척한 후 4 °C에서 염색 상태가 될 때까지 보관합니다.
- 세포를 투과시키기 위해 5분간 DPBS(-/-)에 0.1% Triton X-100을 5분간 투여합니다. 그 다음 DPBS(-/-)에 50 μL 0.1% Triton X-100을 삽입하여 10% 염소 혈청을 1시간 RT에서 차단합니다.
- 상단(기관지 상피) 채널에는 50 μL 마우스 단클론 항인 ZO-1 1차 항체(1:100)를, 하단(폐혈관 내피) 채널에는 50 μL 토끼 단클론 항인-VE-카데린 1차 항체(1:600)를 배양합니다.
- 두 항체를 항체 용액(0.1% Triton X-100 in PBS(-/-)과 염소 혈청 1%에 섞어 희석한 후, 4°C에서 정적 조건에서 ON을 배양합니다.
- 칩을 200 μL DPBS(-/-)로 세 번 세척하세요. 그 후 각 채널을 RT에서 1시간 동안 적절히 플루오로포어가 결합된 2차 항체 50 μL을 항체 용액에 희석한 상태로 인큐브합니다(1:500): 염소 항생쥐 2차 항체는 상단 채널, 염소 항-토끼 2차 항체는 하단 채널에 있습니다.
- 두 채널을 200 μL DPBS(-/-)로 세 번 세척하세요. 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, DPBS (-/-)에서 1 μg/mL)의 각 채널에 대해 50 μL로 핵 염색을 10분간 RT에서 수행.
- 최종 세척을 200 μL DPBS(-/-)로 수행하고, 칩을 DPBS(-/-)에서 4°C 어두운 환경에서 보관하다가 영상 촬영을 합니다.
- 회전 디스크 모듈, 고감도 카메라, 20배 대물렌즈(NA 0.8)가 장착된 역형 형광 현미경을 사용해 커버슬립(20x60 mm, 두께 0.16-0.19 mm)의 칩을 영상화합니다. 후처리를 위해 적절한 이미지 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하세요.
3. 표현형 분석
- 칩 섹션 준비
- 2.2.2절에 설명된 대로 4% PFA로 칩을 고정하세요.
- 면도날로 칩에 남아 있는 폴리디메틸실록산(PDMS)을 잘라내세요.
- 두 채널 모두 2% 저융 아가로스 50 μL 분의 DPBS(-/-)를 채우고, 아가로스가 RT에서 굳어지도록 합니다.
- 면도날을 사용해 칩을 가로로 두 반으로 자르고, 각 절반을 최적의 절단 온도(OCT) 매체에 박아 −80°C에서 단면을 만들 때까지 보관합니다.
- 냉동 절부
- 크라이오스탯을 준비하고 칩 반쪽에서 200 μm 크라이오섹션을 잘라내세요.
- 칩 조각을 핀셋으로 채취해 DPBS(-/-)로 채운 48 웰 플레이트의 웰에 넣어 4°C에서 면역 염색을 할 때까지 보관합니다.
- 면역형광 염색
참고: 48웰 플레이트에서 각 단계를 수행하며, 기준 부피는 400 μL입니다.- 세포를 투과시키고 2.2.4절에서 설명한 비특이적 결합을 차단합니다.
- 각 절편을 4°C에서 상피 섬모세포(β-튜불린 IV, 1:2000) 또는 내피세포(CD31, 1:25)에 특이적인 1차 항체를 대상으로 항체 용액(0.1% Triton X-100 in DPBS, 1% 염소 혈청)에 희석하여 인큐베이션합니다.
- DPBS로 세 번 세척하세요 (-/-).
- 적절한 형광포자 결합 염소 항생쥐 2차 항체(1:500)를 사용하여 β-튜불린 IV와 CD31을 1시간간 RT에서 인큐베이팅하고, 항체 용액에 희석하고 빛으로부터 보호합니다.
- 절편을 DPBS(-/-)로 세 번 세척한 후, 10분간 DAPI(DPBS 내 1 μg/mL -/-)로 핵 염색을 RT에서 수행합니다.
- 장착 전에 DPBS(-/-)로 한 번 세척하세요.
- 핀셋을 사용해 각 현미경 슬라이드에 스페이서 하나를 놓고, 중앙에 섹션을 배치합니다. 마운팅 매체 1–2방울을 넣고 원형 커버슬립을 놓으세요.
- RT에서 어두운 상태에서 말린 후, 커버슬립 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하세요.
- 슬라이드는 영상 촬영 전까지 어두운 곳에서 4°C에 보관하세요.
- 회전 디스크 모듈, 고감도 카메라, 40배 대물렌즈(NA 1.25)가 장착된 역형 형광 현미경을 사용해 칩 단면을 영상화합니다. 적절한 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다.
4. RNA 추출 및 정량
- 층류 하 칩에서 셀 수집
- 2주간의 ALI 배양 후 휴대용 모듈에서 칩을 분리하고, 200 μL DPBS(-/-)를 37 °C에서 예열하여 두 채널을 두 번 세척합니다.
- 하단 채널의 내피세포에 0.25% 트립신-EDTA(1X) 35 μL 첨가하고 약 30초간 RT 강제 배양합니다.
- 세포를 현미경으로 검사하여 완전히 박리되었는지 확인하세요. 그 후 세포 현탁액을 튜브에 담아 원심분리기에서 900 × g에서 5 분간 RT 상태로 보관합니다.
- 세포 펠릿을 페놀 기반 RNA 분리 시약 50 μL에 재현탁하여 -80 °C에서 RNA 추출 시약을 보관합니다.
- 50 μL 페놀 기반 RNA 분리 시약을 상단 채널에 직접 첨가하여 상피세포를 용해하고, 팁으로 포트를 밀봉한 후 얼음 위에서 3-4분간 배양합니다.
- 완전한 용해를 위해 부드럽게 피펫을 사용하고, 용해액을 튜브에 모아 -80 °C에서 RNA 추출 시까지 보관합니다.
- 두 채널을 현미경으로 검사하여 세포 수집이 완벽한지 확인하세요.
- RNA 추출
- 클로로포름(용해에 사용되는 페놀 기반 RNA 분리 시약 1부피당 0.2부피; 샘플당 10 μL)을 추가하고, 튜브를 흔들어 완전히 혼합한 후 얼음 위에서 2-3분간 배양합니다.
- 12,000 × g에서 4 °C에서 15분간 원심분리하여 상을 분리하고 상부 수상을 조심스럽게 새 튜브로 옮기면서 간기를 방해하지 않습니다. 그 후 수용상에 5 μg의 RNA 프리 글리코겐을 운반체로 첨가합니다.
- 이소프로판올(용해 시약 1부피당 0.5 부피; 샘플당 25 μL)을 추가하고, 4 °C에서 10분간 인큐브링한 후, 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리기를 합니다.
- 상청액은 버리면서 RNA 펠릿은 남겨두세요.
- RNA의 세척과 재현탁
- RNA 펠릿을 75% 에탄올(용해 시약 1부피당 1부피; 샘플당 50 μL)로 세척하고, 잠시 소용돌이를 한 뒤 7,500 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
- 상정액을 버리고 펠릿을 5–10분간 자연 건조시킵니다.
- RNA를 30 μL 무효액수에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁하고, -80 °C에서 RNA를 저장하여 추가 사용 후 보관합니다.
- 마이크로플루이딕 칩 기반 핵산 분리 시스템을 사용하여 RNA의 무결성과 정량을 평가합니다.
결과
폐 온 칩 공동 배양 모델 설립
브라이트필드 영상 촬영은 폐 온 칩 공동 배양 시스템에서 세포 부착과 시간이 지남에 따른 성장을 밝혀냈습니다. 기관지 기도 상피 세포는 액체-액체 경계면(LLI)에서 잠긴 배양에서 증식하여 상단 채널을 따라 균일한 층을 형성했고(그림 6A), 폐혈관 내피세포는 하단 채널 전체를 덮으며 융합 단일층을 형성했습니다(그림 6B).
공동 배양이 확립된 후, 현미경 검사가 가능한 유일한 구역인 하단 채널의 입구 및 출구 영역에서 내피 세포를 모니터링했습니다. 그림 7에서 보듯, 내피 세포는 생존 가능했으며 흐름 방향에 따라 길쭉한 형태를 보였습니다. ALI 배양 14일 후, 건강한 모델과 COPD 모델 모두에서 상피층이 눈에 띄는 섬모 박동을 보였습니다(보조 영상). 예상대로 COPD 모델은 건강한 모델에 비해 점액 생성이 현저히 증가하여 COPD 병리의 주요 특징을 재현했다.
그림 6: 미세유체 장치 내 기도 상피 및 내피 세포의 공동 배양.
액체-액체 경계면(LLI) 조건 하에서 다공성 막의 상부 표면(A)에 위치한 원발 기관지 상피세포(A)와 하부 표면(B)에 위치한 일차 폐 미세혈관 내피 세포의 대표 이미지입니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 7: 공기-액체 경계 중 하단 미세유체 채널 내피세포.
공기-액체 인터페이스(ALI) 중 하단 채널의 입구(상부)와 출구(하부)에 있는 폐 미세혈관 내피 세포를 보여주는 대표적인 밝시야 이미지. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
그림 8: 기도 내 점액 축적.
건강한 (A) 및 COPD (B) 공동 배양 모델에서 14일간 공기-액체 인터페이스(ALI) 후 점액 생성을 보여주는 대표적인 이미지. 기도 구획의 갈색 층은 축적된 점액을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
장벽 무결성의 정량적 평가
장벽 무결성에 대한 기능적 평가는 건강한 모델과 COPD 모델 모두에서 긍정 대조군(세포 없는 ECM 코팅 칩)에 비해 낮은 투과성(Papp)을 보였다(그림 9).
세포가 없을 경우, 높은 Papp 수치는 장벽 형성이 최소화되었음을 나타냈다. 반면, 상피 및 내피층이 존재할 경우 형광 덱스트란 추적자가 ECM을 통과하지 않아 투과성이 현저히 감소하고 강한 장벽을 시사합니다. 이 효과는 ALI 전과 10일 후 모두 관찰되었으며, 분화 초기 단계에서 장벽 기능이 확립됨을 입증했습니다.
그림 10에서 보듯, 건강한 모델에서 ALI 이전 평균 Papp 값은 이미 견고한 장벽 무결성을 나타내는 임계값(1 × 10⁻6 cm/s) 이하였으며, ALI 배양 과정에서 더 감소했습니다. COPD 모델에서 평균 Papp 값은 ALI 전에도 강한 장벽 범위 내에 있었으며, 10일 후 약간 증가했음에도 장벽 무결성은 견고하게 유지되었습니다.
그림 9: 폐 온 칩 모델에서의 장벽 기능 평가.
세포 없는 ECM 코팅 칩(누출 양성 대조; 검은색)과 건강한 (분홍색) 및 COPD(녹색) 공동 배양 모델에서 10일간의 공기-액체 인터페이스(ALI) 전후 측정된 겉보기 투과성(Papp). 각 점은 개별 칩을 나타냅니다. 건강한 모델은 별도의 기증자 세포를 포함하는 반면, COPD 모델은 단일 환자에서 유래한 세포를 사용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 10: 건강한 모델과 COPD 모델에서의 장벽 기능 비교.
건강(왼쪽) 및 COPD(오른쪽) 공동 배양 모델에서 공기-액체 인터페이스(ALI) 10일 전후 측정된 겉보기 투과성(Papp). 각 점은 개별 칩을 나타냅니다. 값은 표준표준± 평균입니다. COPD 모델은 세 명의 환자 세포를 포함하는 반면, 건강한 모델은 서로 다른 기증자의 세포를 결합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
밀착 접합부와 부착부 접합부의 면역 검출
면역형광 분석을 통해 접합 단백질의 구조적 조직이 확인되었습니다. ZO-1은 기관지 상피세포 경계를 따라 연속적으로 위치하는 모습을 보여, 온전한 상피 장벽이 있음을 나타냈다(그림 11A). 마찬가지로, VE-카데린 염색은 내피 접합부에서 균일한 분포를 보여주었으며, 이는 합류 내피 단일층과 일치하였다. 내피세포는 흐름 방향에 맞춰 길게 늘어진 형태를 보였다(그림 11B).
건강한 모델과 COPD 모델 간 조밀 및 부착 접합 단백질의 위치 지정에 차이는 관찰되지 않았습니다. 이 결과는 기능적 장벽 데이터와 일치하며, 두 모델 모두에서 접합 무결성이 보존된 생리학적으로 중요한 상피-내피 경계면의 존재를 뒷받침합니다.
그림 11: 폐 내 칩 공동 배양 모델에서의 접합 단백질 발현.
14일간의 공기-액체 인터페이스(ALI) 후 얻은 상부 노출 면역형광 이미지에서는 기도 상피 구획(A)에서 ZO-1이 위치하고 내피 구획(B)에서 VE-카데린이 위치됨을 보였습니다. 핵은 DAPI로 염색됩니다. 화살표는 흐름 방향을 나타냅니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
표현형 분석
칩 냉동절부의 면역형광 염색 결과, 막 꼭대기면에 β-튜불린 IV 양성 세포가 발견되어, 기도 상피세포가 섬모세포로 분화되었음을 나타냈으며, 이는 성숙한 기관지 상피의 특징이다(그림 12A). CD31 염색 검사는 막의 기저면을 따라 합류하는 내피 단일층의 존재를 확인했습니다(그림 12B). 이 결과들은 공동 배양 시스템이 두 모델 모두에서 생리학적으로 관련된 상피 및 내피 표현형 확립을 지원함을 보여줍니다.
그림 12: 폐 칩 단면의 면역형광 이미지. 14일간의 공기-액체 인터페이스(ALI) 후 칩 단면의 대표적인 면역형광 염색으로, 기도 상피 구획(A)에서 β-튜불린 IV 발현과 내피 구획(B)에서 CD31 발현이 나타났습니다. 핵은 DAPI로 염색됩니다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.
RNA 추출 및 정량화
기도 상피 세포에서 분리된 RNA는 59에서 135 ng/μL 사이의 농도를 보였으며, RNA 무결 번호(RIN)11 은 7.4–9.6이었고, 미세혈관 내피세포에서 추출한 RNA는 12에서 46 ng/μL 범위, RIN 값은 9.6–10이었습니다. 데이터는 두 모델 모두 하위 분자 분석에 적합한 고품질 RNA를 충분히 확보했다는 것을 보여주었습니다.
보충표 1: 기관지 기도 상피세포의 기증자 정보. 표는 건강한 모델에서 사용되는 기관지 기도 상피세포를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충표 2: 폐 미세혈관 내피세포 기증자 정보. 건강한 모델에서 사용되는 폐 미세혈관 내피세포의 기증자 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충표 3: 환자 정보. 이 표는 COPD 모델에서 사용되는 기도 상피 및 폐 미세혈관 내피세포에 대한 정보를 나타냅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보충표 4: 프로토콜에 사용된 주요 시약 및 배양 배지 개요.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 영상 1: 기도 채널에서의 섬모 박동 (건강한 모델).
공기-액체 인터페이스(ALI) 14일 후 섬모 박동을 보여주는 대표적인 영상입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
보조 영상 2: 기도 채널에서의 섬모 박동 (COPD 모델).
공기-액체 인터페이스(ALI) 14일 후 섬모 박동을 보여주는 대표적인 영상입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.
토론
본 연구는 상업적으로 이용 가능한 기관지 상피 및 폐 미세혈관 내피세포를 이용한 건강한 모델과, 환자 유래 폐 세포를 이용한 COPD 모델을 모두 생성하는 폐 온 칩 공동 배양 시스템을 구축하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 두 모델 모두 두 세포 유형은 다공성 신축성 막으로 분리되어 있으며, 이 막은 세포 유형별 세포외기질(ECM)으로 코팅되어 생 체 내 폐와 더 유사한 미세 환경을 가능하게 합니다. 프로토콜에는 장벽 무결성 평가, 세포 표현형 분석, 각 구획에서 RNA 추출 방법도 포함되어 있습니다. 두 모델 모두 동적 관류 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 조건에서 성공적으로 유지되어, 생리학적으로 중요한 상피-내피 장벽과 완전히 분화된 가성 층화 기도 상피를 구현했습니다. 내피세포는 생체 내에서 관찰된 흐름 방향에 맞춰 정렬되었고, 양쪽 구획에서 고품질 RNA가 얻어졌습니다.
이 공화계 시스템을 성공적으로 구축하기 위해서는 여러 중요한 단계가 필수적입니다. 균일한 커버리지를 달성하려면 정밀한 상피 세포 시딩이 필요하며, 불균일한 분포는 표면 피복 불완전과 장벽 형성 저하를 초래할 수 있습니다. 이 경우 첨단 구획을 경유흡취하고 상피 세포를 재씨앗해야 합니다. ALI의 형성은 상피층과 내피층이 모두 연속적인 단층층을 형성할 때만 시행해야 하며, 조기 ALI 노출은 혈관 배지가 기도 구획으로 누출되고 분화 장애를 초래할 수 있습니다. 만약 일치가 이루어지지 않으면 ALI 설립을 지연해야 합니다.
첨단 배지의 불완전 제거나 ALI 노출 불규칙은 상피 성숙의 불질성을 초래할 수 있습니다. 상단 채널의 잔류 매질은 유량을 600 μL/h로 3–4분 동안 증가시켜 제거할 수 있습니다. 기포 형성은 관류를 방해하고 세포 생존 능력에 영향을 미치며, 이는 충분한 평형 상태가 아닐 때 발생할 수 있습니다. 기포는 3-4분 동안 유량을 600μL/h로 일시적으로 증가시키거나, 지속될 경우 칩을 분리하고 피펫으로 수동으로 제거함으로써 제거할 수 있습니다. COPD 모델에서는 과도한 점액 생성이 기도 경로를 막아 관류를 방해할 수 있습니다; 이런 경우에는 DPBS로 부드럽게 세척한 후 ALI를 재설치하는 것이 권장됩니다.
기존의 대부분 기도 상피세포와 폐 내피세포를 결합한 공동 배양 시스템은 상업적으로 구할 수 있는 1차 세포와 콜라겐 또는 피브로넥틴과 같은 일반 ECM 코팅에 의존합니다 10,12. 이들은 부착을 지원하지만, 기도-혈관 경계면의 생화학적 및 기계적 특성을 부분적으로만 재현합니다. 반면, 현재 시스템은 세포 유형별 ECM 코팅을 사용하여 인간폐 조직을 더 가깝게 모방하는 미세 환경을 제공합니다.
장벽 기능은 일반적으로 상피/내피 전기저항(TEER)을 사용하여 평가되지만, 이 방법은 상피 다층 조직에 의해 영향을 받을 수 있습니다14. 본 연구에서는 덱스트란 투과성을 사용하여 기능적 완전성을 평가하였습니다. 관찰된 Papp 값은 강한 장벽 무결성 임계값(1 × 10⁻6 cm/s) 이하로 보였으며, 이는 견고한 상피-내피 경계면을 나타냅니다. 기도 상피는 섬체 박동과 점액 생성 등 분화 특징을 보였으며, 세포 접합부에서 ZO-1과 VE-카데린이 지속적으로 위치하는 모습을 보였다. 또한, 두 구획 모두에서 고품질 RNA가 일관되게 얻어져 세포 유형별 후속 분석이 가능했습니다.
이 연구의 주요 진전 중 하나는 상피세포와 내피세포가 동일한 환자에서 유래한 COPD 폐 온 칩 모델의 개발입니다. 최근 알려진 바로는, 이러한 환자 매칭 공동 문화는 이전에 보고된 적이 없습니다. 이전 연구들은 COPD 유래 상피세포 7,8을 포함했으나, 상업적으로 공급된 내피 세포에 의존하여 질병 특이적 상피-내피 상호작용 연구가 제한적이었습니다. 본 모델은 환자 특이적 세포 상호작용을 보존함으로써 이 한계를 극복합니다.
COPD 모델은 점액 생성 증가를 포함한 주요 질병 특징을 재현하면서도 내피 정렬과 유류 시 접합부의 무결성을 유지하였습니다. 중요한 점은, 환자 유래 상피세포와 내피세포의 공동 배양이 점액 생성 증가에도 불구하고 장벽 기능이나 생존력을 저해하지 않았다는 것입니다. 이 시스템은 ALI 조건과 지속적인 관류 하에서도 안정적을 유지하여 장기 연구에 활용할 수 있게 되었습니다. 또한, 이 플랫폼은 기계적 신장을 가능하게 하여 생리학적 중요성을 더욱 높입니다.
이 워크플로우의 중요한 강점은 동일한 플랫폼 내에서 건강한 상태와 COPD 상태를 비교 가능한 실험 매개변수 하에서 평가할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 상피 분화, 내피 기능, 장벽 무결성에서 질병 관련 차이를 직접 평가할 수 있습니다. 연구 질문에 따라 모델들은 독립적으로 사용할 수도 있습니다. 건강한 모델은 기전 연구와 경로 조절에 적합하며, COPD 모델은 치료 평가와 약물 검사의 플랫폼을 제공합니다. 각 구획에서 고품질 RNA를 개별적으로 추출할 수 있는 능력은 세포 유형별 분자 프로파일링을 더욱 가능하게 합니다. COPD 모델에서 환자 매칭 세포를 사용하면 관련 없는 세포원을 결합할 때 손실될 질병 관련 상호작용을 보존할 수 있습니다.
이러한 장점에도 불구하고 여러 가지 제한점이 고려해야 합니다. 폐 온 칩 시스템 사용에는 전문 장비와 기술 전문성이 필요해 접근성이 제한될 수 있습니다. 또한, 현재 모델에는 병원체 및 약물에 대한 반응에 영향을 줄 수 있는 면역세포나 기질 세포와 같은 다른 관련 폐 세포 유형은 포함되어 있지 않습니다. 그러나 이 플랫폼은 순환 면역 세포를 통합하도록 조정하여 상피 및 내피 구획과의 상호작용을 조사할 수 있습니다. 환자 유도 COPD 자료에 대한 접근도 제한될 수 있으며, 환자 간 변동성은 재현성에 영향을 줄 수 있습니다. 더불어, 과도한 점액 생성은 관류에 방해가 될 수 있습니다.
순환 기계적 신장의 영향은 본 연구에서 조사되지 않았으나, 중요한 미래 방향을 제시합니다. 신축성 멤브레인은 호흡과 관련된 기계적 힘을 시뮬레이션할 수 있게 하며, 이는 세포 기능, 수리, 항상성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다 15,16. 이전 연구들은 기계적 변형이 나노입자의 흡수와 상피 장벽을 통한 수송을 증가시킬 수 있음을 보여주었다10.
결론적으로, 여기서 제시된 건강한 및 COPD 폐 온 칩 모델은 건강과 질병에서 상피-내피 상호작용을 연구하는 생리학적으로 중요한 플랫폼을 제공합니다. 이 시스템의 동적 특성은 유동 조건을 정밀하게 제어할 수 있게 하며, 약물 검사 및 병원체 노출 연구와 같은 응용 분야를 지원합니다. 이 프로토콜은 전통적인 시험관 내 및 동물 모델에 대한 강력한 대안을 제공하며, 중개 호흡기 연구를 발전시키는 귀중한 도구를 제공합니다.
공개 사항
어떤 저자도 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 플랑드르 연구재단의 연구비(G065221N)로 지원받았습니다.
재료
```html
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) (for endothelial cells) | Gibco | 25200-056 | 폐 미세혈관 내피 세포의 효소적 분리에 사용됩니다. |
| 120 mm x 120 mm 정사각형 셀 컬처 접시 | VWR | 688161 | 칩 준비 및 취급 중 칩 크래들을 고정하는 데 사용됩니다. |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939A | RNA의 품질과 무결성을 평가하는 데 사용됩니다. |
| 2-프로판올 | Sigma-Aldrich | I9516 | 추출 중 RNA를 침전시키는 데 사용됩니다. |
| 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 면역형광 염색 중 세포핵을 염색하는 데 사용됩니다. |
| 50 mL 원추형 튜브 | Cellstar | 227261 | 세포 수집, 원심분리 및 세포 현탁액 준비에 사용됩니다. |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Bioanalyzer를 사용한 RNA 품질 분석에 사용됩니다. |
| 양성 세균 방지제 B | Gibco | 15290-026 | 세포 배양 중 곰팡이 오염을 방지하는 데 사용됩니다. |
| 자동 세포 카운터 | NanoEntek | EVE PLUS | 파종 전 세포 농도 및 생존율을 결정하는 데 사용됩니다. |
| 세포 배양 다공 플레이트, 48개 웰, 무균 | Falcon | 353078 | 염색 절차 중 단면을 고정하는 데 사용됩니다. |
| 원심분리기 | Hettich | 320R | 파종 전 세포를 펠렛화하는 데 사용됩니다. |
| 칩 크래들 | Emulate | support@emulatebio.com | 표면 활성화, 코팅 및 세포 파종 중 칩을 지지하고 고정하는 데 사용됩니다. |
| 클로로포름 | Sigma-Aldrich | 366927 | RNA 추출 중 위상 분리에 사용됩니다. |
| Cicero 스피닝 디스크 모듈 | CrestOptics S.p.A. | 고속 콘포컬 형광 이미징을 수행하는 데 사용됩니다. | |
| 커버 슬립 | Epredia | BB02400600AC13MNZ0 | 콘포컬 이미징 중 칩을 지지하는 데 사용됩니다. 설명: 24 x 60 mm, #1.5 |
| 냉동 현미경 | Thermo Fisher Scientific | NX70 | OCT 임베드 샘플을 절단하는 데 사용됩니다. |
| 배양 모듈 (Zoë-CM) | Emulate | support@emulatebio.com | 미세 유체 시스템 내의 세포 배양을 위한 환경 조건을 제어하는 데 사용됩니다. |
| Define trypsin inhibitor (DTI) | Thermo Fisher | R007100 | 상피 세포 분리 후 트립신 활성을 중화하는 데 사용됩니다. |
| Dextran Cascade Blue 3KDa | Thermo Fisher | D7132 | 배리어 투과성을 평가하기 위해 형광 추적자로 사용됩니다. |
| Endothelial cells Growth Medium MV2 kit | PromoCell | C-22022 | 폐 미세혈관 내피 세포의 유지 및 확장에 사용됩니다. |
| ER-1 표면 활성화 시약 (감광성 활성화 시약 분말) | Emulate | support@emulatebio.com | 후속 코팅을 위한 칩 표면을 활성화하는 데 사용됩니다. |
| ER-2 표면 활성화 시약 (버퍼) | Emulate | support@emulatebio.com | 칩의 표면 활성화 중 버퍼로 사용됩니다. |
| 절대 에탄올 | Thermo Fisher Scientific | 437433T | 추출 중 RNA 펠렛을 세척하는 데 사용됩니다. |
| 형광 플레이트 리더 | Agilent | BioTek Sinergy H1 microplate reader | 투과성 분석을 위한 형광 강도를 측정하는 데 사용됩니다. |
| 소 피부 젤라틴 | Sigma-Aldrich | G9391 | 내피 세포 접착을 촉진하기 위해 배양 표면을 코팅하는 데 사용됩니다. |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (ZO-1 및 β-tubulin IV용) | Thermo Fisher | A11001 | 녹색 형광으로 마우스 1차 항체를 검출하는 데 사용됩니다. |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (CD31용) | Thermo Fisher | A11005 | 빨간색 형광으로 마우스 1차 항체를 검출하는 데 사용됩니다. |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (VE-cadherin용) | Thermo Fisher | A21429 | 주황색-빨간색 형광으로 토끼 1차 항체를 검출하는 데 사용됩니다 |
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