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방법 논문

OS-DCE OAI를 이용한 암 및 상처 치유의 전임상 모델에서 산소 공급 및 혈관 관류 평가

276 조회수

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DOI:

10.3791/70689

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2026년 4월 7일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physics, University of Wisconsin, 2University of Texas MD Anderson Cancer Center

이 논문에서

요약

여기서는 암과 상처 치유의 전임상 모델을 평가하기 위한 산소 민감성 – 동적 조영 강화 광음향 영상(OS-DCE OAI)을 수행하는 프로토콜을 소개합니다. OS OAI는 옥시-및 디옥시-헤모글로빈 영상을 통해 조직 산소 공급을 매핑할 수 있습니다. DCE-OAI는 외인성 조영제의 약동학을 영상화하여 혈관 관류를 지도화할 수 있습니다.

초록

산소 민감 광음향 영상(OS OAI)과 동적 조영 강화 광음향 영상(DCE OAI)은 조직 생리학의 보완적이고 비침습적인 판독을 제공합니다. OS OAI는 내인성 옥시헤모글로빈과 디옥시헤모글로빈의 다중 분광 검출을 활용하여 혈중 산소포화도(%sO₂) 지도를 생성하고, DCE OAI는 근적외선 흡수체의 생체 내 약동학을 추적하여 혈관 관류와 투과성을 정량화합니다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지 널리 사용되는 전임상 환경인 정소 유방암 종양과 전층 피부 상처에서 산소 공급과 관류를 동시에 평가할 수 있는 통합 OS-DCE OAI 워크플로우를 제시하는 것입니다.

이 프로토콜에서는 유방암 또는 열상 상처의 마우스 모델에서 OAI를 입증했습니다. OS OAI의 경우, 700–875 nm 거리에서 다중 슬라이스 다중 분광 스캔을 통해 스펙트럼 혼합과 %sO₂ 추정이 가능합니다. DCE OAI의 경우, 인도시아닌 그린(ICG) 정맥 주입 전후로 ≤초 시간 해상도로 반복 획득이 수행되며, 700-875 nm 다중분광 샘플링 또는 800 nm 단일 파장 샘플링을 사용하여 시간 대 OA 신호 진폭 곡선을 생성합니다. 동물 모델 개발, OA 영상 준비, OS OAI 및 DCE OAI 획득, 산소 공급 및 혈관 관류 특성 측정 분석, 그리고 운동 인공물, 표면 흡수체, 실패한 주입에 대한 주요 문제 해결 지침이 상세히 다뤄집니다.

이 OS-DCE OAI 프로토콜은 저산소증과 혈관 수송의 통합된 기능적 초상화를 제공하여 종양과 상처의 생리학적 변화를 육관적 해부학적 측정보다 먼저 감지할 수 있게 합니다. OS-DCE OAI는 다른 질병 모델에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

광음향 영상(OAI)은 광음향 영상 또는 다중광 광음향 단층촬영(optoacoustic tomography)이라고도 하며, 광학 여기와 초음파(US) 검출을 결합하여 심부 조직 영상을 가능하게 하는 비교적 새로운 기법입니다 1,2. OAI에서는 짧은 나노초 레이저 펄스가 산소 및 디옥시헤모글로빈과 같은 내인성 크로모포어를 여기시켜 국소적인 열탄성 팽창과 미국 변환기에 의해 감지되는 광대역 음파를 생성합니다. 이 신호들은 OAI가 초음파와 유사한 공간 해상도로 광학 대비가 있는 이미지를 생성하면서도 생체 내에서 센티미터 규모의 시야심도를 달성할 수 있게 합니다. 여러 파장에서 데이터를 수집하고 스펙트럼 혼합 제거로 분석하면, 산소 민감(OS) OAI는 산소 및 데옥시헤모글로빈의 상대적 농도를 추정하여 조직 산소 포화도(%sO₂)2를 추정할 수 있습니다. 혈중 산소포화도는 다른 방법으로는 비침습적으로 접근하기 어려운 미세혈관 생리학의 기능적 평가를 제공합니다.

혈관 관류는 미세혈관 생리학 평가에도 유용합니다. 혈관 관류는 혈관 흐름, 투과성, 혈관 표면적의 조합을 나타냅니다. 관류를 정량화하기 위해 OAI는 외인성 조영제와 함께 사용되어 동적 조영 강화 OAI(DCE OAI)를 수행할 수 있습니다. 이 접근법에서는 조영제 주입 전, 주입 중, 후에 시간적 영상을 통해 조영제의 약동학(PK)을 모니터링합니다. 이 결과는 혈장 구획에서 종양 세포외 혈관 구획으로의 세척 속도(NKtrans)와 종양 세포외 혈관 구획에서 혈장 구획으로의 세척 속도(kep)를 측정하는 데 모델링할 수 있습니다. 우리는 조직 내에서 산란과 흡수로 인해 조직을 통해 변동되는 복사 에너지를 유발하는 악명 높은 빛 플루언스 문제를 회피하는 PK 모델링 방법을 개발했습니다. 우리 방법은 동적 OAI 신호 변화를 0%(주입 전)에서 100%(최대 향상)로 정규화한 후, 미분방정식을 사용해 NK트랜스 세척 속도와 kep를 추정합니다. 다른 DCE OAI 연구들은 빛의 플루언스가 조직 전반에 걸쳐 균일하다는 주요 가정을 가진 표준 PK 모델링 방법을 사용했습니다 5,6.

DCE OAI 결과는 최대 신호 향상(MSE), MSE 도달 시간(TTP), 기울기(주로 TTP 주입 시), 곡선 아래 초기 면적(IAUC; 역시 주입 후 TTP 주입 시)의 경험적 측정을 통해 세척 속도 평가에도 사용할 수 있습니다. TTP가 PK 곡선의 후반부에서 발생한다면, 기울기(IAUC)는 곡선의 선형 구간이나 주입 시점부터 주입 후 1분까지 측정할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 우리는 실증적 측정이 종양 모델에 투여된 치료 평가나 상처 치유 평가 시 유용할 수 있음을 보여주었습니다. 다른 연구들도 종양 혈관 투과성 및 간 섬유증을 평가하기 위해 실증적 측정을 사용하는 데 가치가 있음을 보여주었다10,11. PK 곡선의 형태는 종양 혈관 관류를 높거나 낮은12, 13, 14로 정성적으로 분류하는 데도 활용될 수 있습니다.

또한, 단일 주입 후 시점에서의 OAI 신호는 관류의 경험적 평가로 사용될 수 있으며, 이를 비동적 조영 강화 OAI(CE OAI)15라고 합니다. 밝은 종양이나 상처를 보여주는 CE OA 이미지는 단순하고 시각적이지만, 종종 고관류 또는 저관류의 질적 평가에만 사용됩니다. 일반적으로 TTP 이후 OAI 신호의 동적 변화는 종양의 혈관 관류를 경험적으로 평가하기 위해 분석되지 않습니다. 하지만 아래에서 보듯이 상처 내 세척 속도가 매우 빠르기 때문에 NKtrans, TTP, 기울기, IAUC 측정이 어렵습니다. 따라서 우리는 세척 단계의 선형 또는 지수 기울기를 상처 내 혈관 관류의 경험적 측정 지표로 사용했습니다.

대부분의 OAI 약물은 근적외선(NIR) 파장 범위에서 흡수하며, 이는 조직 깊숙이 침투할 수 있습니다16,17. 그러나 900 nm 이상의 파장에서의 물 흡수는대부분의 응용 분야에서 생체 내 OAI 파장 범위를 700–900 nm로 제한합니다. 인도시아닌 그린(ICG)은 780–800 nm에서 강한 NIR 흡수를 제공하고, 중간 정도 강한 OAI 신호를 생성하며, 임상 사용을 위한 FDA 승인을 받은 유리한 생체 적합성을 가진 DCE OAI 제입니다. 이러한 특징들은 혈관 내 조영제와 해석 가능한 PK 곡선을 가능하게 합니다.

우리는 고형 종양 및 상처의 전임상 모델에서 산소 공급과 혈관 관류를 평가하기 위한 OS-DCE OAI 통합 프로토콜을 개발했습니다 8,9. 이 프로토콜의 OS 부분은 마우스 모델에서 종양 및 상처 부피 전체를 다룰 수 있는 여러 영상 단면에서 산소 공급을 평가할 수 있습니다. 저희 프로토콜의 DCE 부분에는 여러 레이저 파장을 사용해 종양이나 상처의 단일 단면을 촬영할 수 있는 옵션(조영제 검출 정확도 향상)이나 단일 레이저 파장으로 최대 5개의 단면을 촬영할 수 있는 옵션이 있습니다(공간적 범위 향상). 우리는 방사선 치료 또는 혈관 교란제인 콤브레타스타틴 A4 인산염 치료 후 산소 공급과 혈관 관류 변화를 모니터링하기 위해 OS-DCE OAI를 사용했습니다. 또한 상처 치유 모니터링을 위해 OS-DCE OAI를 사용해9를 사용했습니다. DCE OAI는 다양한 질환에 적용할 수 있는 혈관 관류를 통해 진행 상태를 모니터링할 수 있는 능력을 제공합니다.

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프로토콜

모든 절차를 귀하 기관의 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)의 승인 하에 수행하십시오. 아래 프로토콜의 모든 절차는 우리 기관의 IACUC에서 승인받았습니다.

1. 마취 (후속 시술을 위한 것)

  1. 마취를 유도하세요. 처음에는 5% 이소플루란을 100% 산소 운반체 가스에 투여해 마취를 유도하고 유지하여 쥐가 더 이상 깨어나지 않을 때까지 마취를 유지하세요.
  2. 마취를 유지하세요. 100% 산소 운반 가스에 1.5–2% 이소플루란을 계속 마취하세요. 페달 반사가 없는지 확인하세요.
  3. 정상 체온을 유지하세요. 동물을 따뜻한 표면에 두고, 마취 기간 내내 온도를 모니터링하세요.
    참고: (일시정지) 동물이 완전히 마취된 후 종양 착상 또는 상처 형성으로 진행하세요.

2. 모델 준비

참고: 모든 세포 작업은 노출과 오염 가능성을 방지하기 위해 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다.

  1. 4T1 정형종양 모델을 설정하세요(그림 1).
    1. 얼음 세포 준비: 4T1 세포를 얼음처럼 차가운 PBS에 2 ×10 7 세포/mL 농도로 재현탁합니다.
    2. 세포와 기질 혼합: 세포 현탁액을 1:1(v/v)에 풍부한 세포외 기질을 가진 얼음처럼 차가운 생물학적 하이드로겔과 결합합니다. 이 조합은 1× 107 cells/ mL의 세포 용액을 얻을 것입니다.
    3. 주사기 주사기 주입: 세포 혼합물을 1.0 mL 이하의 무균 실험실 주사기에 주입하세요. 주입당 부피를 100 μL(1 ×10 6 셀)로 제한하세요. 한 가지 방법은 주사기를 30°C까지 부드럽게 가열하면, 생물학적 하이드로겔이 약간 점성이 높아지고 주사 부위에 더 뚜렷하게 유지되도록 하는 것입니다.
      주의: 주사기는 날카롭기 때문에 뚜껑을 다시 덮지 않도록 주의하세요.
    4. 1절에 설명된 대로 쥐를 마취하세요.
    5. 털이 있으면 제거하세요: 가슴 패드 부위를 제모하세요. 만약 유음 누드 마우스를 사용할 경우에는 이 단계를 생략하세요.
    6. 바늘을 위치시키고 주사하세요: 네 번째 서두부 유방 지방 패드를 소독하세요. 바늘 베벨업을 삽입하고 100 μL를 천천히 지방 패드에 주입해 역류를 방지하세요.
    7. 마취에서 동물을 회복시키기: 쥐를 데운 우리로 돌려놓고 보행 가능할 때까지 관찰합니다.
    8. 종양이 성장하도록 기다려 주세요: 4T1 종양이 최소 직경 0.3cm에 도달할 때까지 8-10일을 기다린 후 영상 촬영을 하세요.
      참고: 직경이 큰 종양도 영상 촬영이 가능합니다. 종양의 직경은 보정된 버니어 캘리퍼스로 측정할 수 있습니다. IACUC(또는 이에 상응하는 기관 위원회)가 승인한 최대 직경을 초과하는 종양은 안락사되어야 합니다. 정형주사를 따라 세포 수와 부피를 원하는 착아 프로토콜에 맞게 조정하세요.
  2. 쥐에서 절제 상처 생성 (그림 2)
    1. 수술 부위 준비: 작업 구역과 기구를 소독하세요.
    2. 1절에 설명된 대로 쥐를 마취하세요.
    3. 털이 있으면 제거: 등쪽 부위를 제모하세요. 만약 유음 누드 마우스를 사용할 경우에는 이 단계를 생략하세요.
    4. 진통제 투여: 쥐를 멸균된 수술용 표면에 고정시킨다. 부프레노르핀을 0.05–0.1 mg/kg의 피하 주사(SC)를 등쪽 부위에 투여합니다.
    5. 상처 부위 소독: 등쪽 피부를 포비돈-요오딘으로 소독한 후 70% 에탄올을 사용합니다.
    6. 절제 상처를 만들기: 6mm 생검 펀치로 부위를 그려주세요. 피부와 판니쿨루스 카르노수스를 절제하여 전층 결손을 형성하세요.
    7. 실리콘 부목을 착용하세요:
      1. 상처 주위에 도넛 모양의 실리콘 부목을 중심에 설치하세요. 분할 부위의 내경이 상처 직경보다 2–4mm 더 크고, 부목 너비는 ~5mm로 해야 합니다.
      2. 실리콘 재질 시트에서 도넛 모양의 실리콘 부목을 잘라내세요. 투명한 봉합 재료를 사용해 부목을 꿰매세요. 필요하다면 얇은 접착 필름을 사용해 링을 고정하세요.
        참고: 색소가 첨가된 봉합 재료는 NIR 빛을 흡수할 수 있으므로 사용해서는 안 됩니다.
    8. 부목 봉합: 부목을 주변 피부에 조르지 않고 고정하기 위해 8개의 간격으로 끊은 봉합사를 설치하세요.
    9. 폐쇄성 드레싱 적용: 상처와 부목을 폐쇄성 드레싱으로 덮어 침대를 보호하고 상처 환경을 표준화합니다.
    10. 마취에서 동물을 회복시키기: 쥐를 데운 우리로 돌려놓고 보행 가능할 때까지 관찰합니다.
    11. 동물이 치유될 수 있도록 허용하세요: 연구 설계에 따라 또는 상처가 완전히 치유될 때까지 매일 돌봄과 평가를 계속하세요.
    12. 매일 드레싱 교체: 영상 촬영이나 사진 촬영 후 오염을 줄이고 멸균을 유지하기 위해 폐쇄성 드레싱을 매일 교체하세요.
      참고: (중요한 단계) 상처를 부목으로 고정하여 수축을 억제하고 재상피화를 촉진하여 인간 치유에 대한 번역적 관련성을 높입니다. (일시정지) 드레싱을 바른 후에는 다음 예정된 평가나 영상 촬영까지 잠시 멈추세요.

3. OS-DCE OAI 획득 프로토콜

  1. OAI 스캔을 위해 마우스와 조영제를 준비하세요.
    1. 조영제를 준비하세요.
      1. 멸균수에 1.62 mM ICG 조영제 용액을 준비합니다. 0.3 μm 주사기 필터로 용액을 걸러냅니다. 멸균된 실험실 주사기에 이 용액 100μμL을 채웁니다.
        참고: 이 용량은 775 g/mol의 ICG 분자량을 기준으로 162 nmol 또는 125.5 μμg입니다. 이 용량은 약 20g의 마우스 체중을 고려할 때 6.28 mg/kg입니다. 동물 용량은 인간 용량18의 12.3배에 해당합니다. 따라서 인간 등가량은 체중 0.51 mg/kg입니다. 인간의 최대 내약 용량은 2 mg/kg19입니다. 따라서 이 전임상 연구에서 사용된 용량은 인간에서 최대 허용 용량의 약 1/4에 해당합니다.
    2. OAI 스캐너 준비해.
      1. 영상 탱크에 이온화된 증류수를 채우세요. 몸무게 <25g의 쥐를 위해 수조 온도를 36°C로 설정하세요.
        참고: 이 수조 온도는 쥐가 크래들 안에 비닐봉지에 싸여 있기 때문에 코어 체온을 약 37°C 정도로 유지합니다. 몸무게가 >25g인 큰 쥐는 과열을 방지하기 위해 수조 온도를 35°C로 설정해야 합니다. 큰 쥐는 피하 지방 조직이 더 많아 단열층 역할을 하기 때문입니다.
    3. 1절에 설명된 대로 쥐를 마취하세요. 획득 프로토콜의 나머지 기간 동안, 쥐는 100% 산소 운반 가스에 1.5–2% 이소플루란으로 마취 상태를 유지하도록 하세요.
    4. DCE OAI를 시행할 때는 정맥 접근을 하세요.
      1. 27G 꼬리정맥 카테터에 헤파린화된 생리식염수로 세척하세요. 카테터를 측측 꼬리정맥에 삽입하고, 꼬리정맥에서 분리되는 것을 방지하기 위해 카테터를 고정합니다(그림 3A). 기포가 없는지 확인하세요.
        참고: (중요한 단계) 카테터 개성 유지를 위해 헤파린화된 생리식염수를 사용하세요.
      2. 또한, 카테터에 연결할 수 있는 부피가 500 μL 이하의 멸균 실험실 주사기를 준비하세요. 주사기에는 2.14 mM ICG 100 μL (~322 nmol; 20g 마우스 기준 ~16 μmol/kg)이 들어 있는지 확인하세요.
    5. 마우스와 요람을 초음파 젤로 덮으세요(그림 3B).
      1. 종양이나 상처 부위에 투명 초음파 젤을 얇게 발라주세요(그림 3C). 또한, 요람과 종양 또는 상처 부위 사이에 밀봉을 위해 요람에 초음파 젤을 발라주세요.
        참고: 공기 방울을 제거하세요. 옵션으로, 초음파 젤을 사용하기 전에 원심분리하여 공기를 제거할 수도 있습니다. 또한, 두꺼운 젤 층에 생길 수 있는 기포를 피하기 위해 최소한의 양의 초음파 젤을 사용하세요.
    6. 마우스를 크래들에 넣으세요 (그림 3D): 기기 제조사 설명서를 참고하세요. 마우스를 코가 코 안에 단단히 넣은 상태로 홀더에 넣으세요. 수갑을 사용해 쥐의 손과 발을 고정하세요. 이빨 고리를 사용해 머리를 안정시키세요.
      1. (선택 사항) 쥐를 촬영할 때는 쥐 코 콘이 달린 요람을 사용하세요. 쥐 코 원뿔은 쥐 머리를 요람 바닥에서 들어 올려 소량의 물이 요람에 새어도 우연히 익사하는 것을 방지할 수 있습니다.
    7. 마우스와 크래들을 OAI 기기에 넣으세요. 제조사의 기기 설명서를 참고하세요.
      1. 마우스 크래들에 누수가 있는지 관찰하세요. 누수가 있다면, 마우스와 크래들을 기기에서 분리하고 크래들 안에 다시 밀봉하여 우발적인 익사를 방지하세요.
      2. DCE OAI를 원한다면, 조영제가 있는 카테터를 주사기에 연결하세요.
    8. 영상 촬영 전 마우스의 평형을 맞추세요: 이미지 획득 전에 온수 탱크에서 생리를 안정시키기 위해 10분간 두세요(그림 3E).
    9. 마우스를 OAI 트랜스듀서에 상대적으로 배치하세요:
      1. 제조사의 지침에 따라 마우스나 OAI 트랜스듀서를 이동시켜 종양이나 상처가 다중 슬라이스 이미지 세트에 위치하도록 하세요.
      2. 이미지 세트에 맞춰 음속을 최적화하세요. 이 단계는 영상 촬영 전에 마우스가 평형화되는 동안 완료하세요(3.1.7단계).
      3. (중요한 단계) 모든 마우스와 모든 시점에서 동물의 방향/절단 위치를 일정하게 유지하여 엄격한 결과를 보장합니다
  2. OS OAI 매개변수를 설정하세요.
    1. 이미지 절편 매개변수를 선택하여 종양 또는 상처 부위 전체를 1mm 두께로 덮는 여러 조각을 촬영합니다.
    2. 흡수 파장을 선택하세요. OS OAI의 경우 700, 730, 760, 800, 850, 875 nm 흡수 파장을 선택하세요.
    3. 신호 평균화 사용: 다음 파장을 획득하기 전, 그리고 다음 영상 단면으로 이동하기 전에 파장당 10개의 평균을 획득하는 매개변수를 선택하세요. 파장당 10개의 평균은 각 이미지 슬라이스의 신호 대 잡음 비율을 증가시킵니다.
    4. 반복 횟수를 설정하세요:
      1. 표 1에 표시된 대로 반복 횟수를 설정하여 총 습득 시간을 약 2분으로 유지합니다. 10Hz 반복률을 가진 기기 사용자의 경우, 이미지 슬라이스당 총 획득 시간은 6.0초입니다.
      2. 마우스를 다음 영상 슬라이스로 이동시킨 후 첫 번째 슬라이스 위치로 돌아가는 데 평균 0.2초가 걸리므로, 각 슬라이스마다 6.2초가 소요됩니다.
      3. 측정 안정성을 위해 최소 3회 반복을 수행하세요. 더 많은 반복이 필요하다면 총 습득 시간이 2분 이상이라도 허용됩니다.
  3. OS OA 이미지를 획득하세요.
  4. DCE OAI 파라미터를 설정하세요.
    1. 다중 파장을 가진 단일 슬라이스 영상 프로토콜에 대해 DCE OAI 획득 매개변수를 설정합니다.
      1. 영상 단면을 위치시키세요. 종양이나 상처 부위에 중앙에 위치하고 두께 1mm의 영상 절편을 ≤ 선택하세요.
      2. 조영제의 최적 흡수 파장을 선택하세요. 인도시아닌 그린을 생 체 내에서 사용할 때는 파장을 800 nm로 설정하세요.
      3. 표 2에 표시된 평균과 반복 횟수를 설정합니다. 이 권고안들은 10Hz 영상 반복 속도를 가진 OAI 기기 사용자에게 5초≤ 시간 해상도와 총 획득 시간을 11.0–11.2분으로 유지할 것입니다.
        참고: 다른 영상 반복률을 가진 기기 사용자는 각 이미지 세트마다 ≤ 5초의 시간 해상도를 유지하기 위해 평균 수를 조정해야 합니다.
    2. 3.4.1 단계 대안으로, 단일 파장의 다중 슬라이스 이미징 프로토콜에 대한 DCE OAI 획득 매개변수를 설정합니다.
      1. 영상 단면을 위치시키세요. 종양이나 상처 부위에 중심을 두고 두께 1mm≤ 5개의 영상 절편을 선택합니다.
      2. 조영제의 최적 흡수 파장을 선택하세요. 인도시아닌 그린을 생 체 내에서 사용할 때는 파장을 800 nm로 설정하세요.
      3. 표 2에 표시된 평균과 반복 횟수를 설정합니다. 이 권고안들은 10Hz 영상 반복 속도를 가진 OAI 기기 사용자에게 5초≤ 시간 해상도와 총 획득 시간을 11.0–11.2분으로 유지할 것입니다.
        참고: 다른 영상 반복률을 가진 기기 사용자는 각 이미지 세트마다 시간 해상도 ≤ 5초를 유지하기 위해 평균 수를 조정해야 합니다.
  5. DCE OA 이미지를 획득하세요.
    1. 기초 이미지 기록: 수집을 시작하고 12세트의 이미지 세트(~1분)를 수집합니다.
    2. 조영제 주입: 카테터를 통해 100 μL을 투여하면서 획득을 계속하세요.
      참고: 연약한 꼬리정맥 내 카테터 내 압력 축적을 방지하기 위해 볼루스 주입은 약 10–15초 동안 일정하게 투여해야 합니다. 이 일관성은 수동 주입 시 주사기 플런저에 일정한 압력을 가하거나 자동 인젝터를 사용하여 조절할 수 있습니다. 중요한 점은, 10–15초의 주입 속도가 종양에 제제를 처음 전달하는 것을 부드럽게 하며, 빠른 주사 타이밍으로 인해 PK 곡선에 1차 속도론 급증이 생기는 것을 방지하여 PK 모델링과 경험적 측정 분석을 개선합니다.
      1. (중요한 단계) 정확한 볼루스 타이밍을 유지하기 위해 혈관에서 주변 조직으로 조영제가 누출되는 것을 방지해야 합니다.
    3. 영상 촬영 계속: 남은 128장의 이미지 세트를 주입 후 10.2분에 확보하여 세척/세척 동역학을 포착합니다.
    4. 영상 촬영 과정을 모니터링하여 영상 촬영을 확인하세요: 마우스의 호흡 속도를 모니터링하여 스캔 중 생리학적 상태를 안정적으로 유지하세요.
    5. 마우스와 크래들을 기기에서 제거하세요: 마우스를 크래들에서 제거합니다. 쥐가 마취에서 회복할 시간을 주세요. 쥐를 데운 우리에 다시 넣고 이동할 수 있을 때까지 관찰하세요.
      참고: 적절한 소프트웨어를 사용하고 제조사의 OAI 기기 설명서를 참고하세요. 아래 단계는 viewMSOT v4.0 소프트웨어와 Matlab R2019b 또는 최신 버전의 Matlab 소프트웨어를 사용하는 OAI 기기의 재구성 및 분석 단계를 설명합니다.

4. OS-DCE OAI 결과 분석

  1. OA 이미지를 재구성하세요.
    1. 이미지 재구성 매개변수 선택: 50 kHz–6.5 MHz 밴드패스 필터를 사용하여 필터링된 후방 투사 방식을 사용하도록 이미지 재구성을 설정하고, 자동 펄스 대 펄스 에너지 보정을 활성화합니다.
    2. 모든 이미지를 재구성: 모든 레이저 파장, 모든 이미지 슬라이스 위치, 모든 시점에서 이미지를 얻습니다. 이 방대한 데이터 양은 이미지 재구성에 상당한 시간이 필요할 수 있습니다.
  2. OS OA 이미지를 분석하세요.
    1. 색포자 혼합 해제: 엑스펙트럼 분리를 수행하여 옥시헤모글로빈(HbO2), 디옥시헤모글로빈(Hb), 총 헤모글로빈(HbT = HbO2 + Hb), %sO2 (여기서 %sO2 = HbO2/HbT)의 파라메트릭 맵을 생성합니다.
    2. ROI의 정의:
      1. 각 이미지 단면에서 종양이나 상처를 나타내는 ROI를 수동으로 그려보세요. 보수적인 투자 대비 투자 대비(ROI)를 산출하는데, 정상 조직의 주변 조직 픽셀을 포함하기보다는 종양 말초나 상처 주변의 픽셀을 제외하는 쪽으로 기울어집니다.
      2. 대안으로, 종양 가장자리를 나타내는 ROI와 종양 핵심을 나타내는 두 번째 ROI를 수동으로 그리는 방법도 있습니다. 종양 가장자리는 종양 중심부보다 혈관 분화가 더 심할 수 있어 잠재적으로 유용한 하위 영역 분석을 제공합니다.
        참고: 종양이나 상처 하위 영역의 추가 ROI를 그리거나 HbO2, Hb, HbT, 또는 %sO2 의 픽셀별 값을 평가할 수 있지만(ROI 필요 없음), 이 작은 영역들은 신호 대 잡음 비율이 낮아 측정이 부정확합니다.
      3. 각 파장과 시간대에서 모든 이미지에서 ROI 위치를 일관되게 유지하세요.
    3. 전체 종양의 평균 지표를 계산하세요.
      1. 각 영상 단면과 각 시점에 대해 종양 ROI 또는 상처 ROI에서 HbO2, Hb, HbT, %sO 2의 평균 값을 계산합니다.
      2. 다중 슬라이스 OS OAI의 경우, 모든 영상 슬라이스에서 HbO2, Hb, HbT, %sO2 의 평균값을 계산하여 종양 또는 상처 전체의 각 매개변수별 단일 평균값을 얻습니다.
    4. 매개변수 안정성을 평가하세요. 각 반복마다 %sO2 의 값을 그려내세요(3.2.4 단계 참조). 스캔 중 %sO2 값이 10% 이상 변했는지 평가하여 시간적으로 불안정한 측정을 나타냅니다.
  3. DCE OA 이미지를 분석하세요.
    1. 다중 파장 DCE OA 이미지에서 색소자 혼합 해제: HbO2, Hb 및 조영제의 파라메트릭 맵을 생성하기 위해 스펙트럼 혼합을 수행합니다. 이 단계는 단일 파장 DCE OAI에는 필요하지 않습니다.
    2. ROI를 정의해 주세요.
      1. 각 이미지 단면에서 종양이나 상처를 나타내는 ROI를 수동으로 그려보세요. 보수적인 투자 대비 투자 대비(ROI)를 산출하는데, 정상 조직의 주변 조직 픽셀을 포함하기보다는 종양 말초나 상처 주변의 픽셀을 제외하는 쪽으로 기울어집니다.
      2. 대안으로, 종양 가장자리를 나타내는 ROI와 종양 핵심을 나타내는 두 번째 ROI를 수동으로 그리는 방법도 있습니다. 종양 가장자리는 종양 중심부보다 혈관 분화가 더 심할 수 있어 잠재적으로 유용한 하위 영역 분석을 제공합니다.
        참고: 종양 하위 영역의 추가 ROI를 그리거나 조영제의 픽셀별 값을 평가할 수 있지만(ROI가 필요 없음), 이 작은 영역들은 신호 대 잡음 비율이 낮아 측정이 부정확합니다.
      3. 각 파장과 시간대에서 모든 이미지에서 ROI 위치를 일관되게 유지하세요.
    3. DCE OA 이미지에서 PK 곡선을 추출합니다.
      1. 각 이미지 슬라이스의 ROI를 위해서는 시간점을 평균 ICG 신호(다중 파장 DCE OAI에서) 또는 단일 선택 파장에서의 OAI 신호(단일 파장 DCE OAI의 경우)와 비교해 내보냅니다.
      2. 모든 이미지 슬라이스의 평균 신호를 계산하세요. 종양이나 상처 전반에 걸친 평균 신호를 시간에 따라 그래프로 표시한 것을 PK 곡선이라고 합니다.
      3. 각 시점에서 모든 이미지 슬라이스의 평균 신호를 아래에 나열된 경험적 매개변수를 평가할 수 있는 컴퓨터 프로그램에 전송합니다. 예를 들어, Microsoft Excel과 Graphpad Prism은 그래프의 간단한 분석을 수행할 수 있습니다.
    4. 4.3.5–4.3.11 단계에서 설명된 경험적 매개변수를 계산합니다.
    5. PK 곡선을 정규화하기: 주입 전 시간점의 평균 값인 기준선 신호를 결정합니다. 모든 인젝션 후 신호값에서 기준선 신호값을 빼세요.
    6. 최대 신호 증강(MSE) 산정: PK 곡선에서 주입 후 신호 값이 가장 높은 값을 식별합니다.
    7. 시간-최대 시간(TTP) 결정: MSE의 시간 포인트 값을 식별합니다.
    8. PK 곡선의 초기 기울기를 계산합니다.
      1. 초기 주입 시점부터 TTP까지의 이 초기 기울기를 얻습니다. 또는 곡선 형태가 너무 가파르거나 TTP가 너무 늦으면 주입 후 1분 경사를 계산할 수도 있습니다.
      2. 이 시나리오에서는 1분 전의 주입 이미지를 촬영하고, PK 곡선에서 1.0분부터 2.0분까지의 기울기를 계산하세요.
    9. 곡선 아래 초기 면적(IAUC) 계산: 초기 주입 시점부터 PK 곡선의 TTP까지의 신호 값의 평균값을 계산합니다.
    10. 세척 단계의 경험적 비율을 계산하세요.
      1. TTP 후 1분부터 마지막 시점까지의 PK 곡선 부분에 대해, 이 곡선 부분을 직선이나 일정한 오프셋 항을 가진 단지수 감소 함수로 적합시킵니다.
      2. 직선의 기울기나 지수 감쇠 상수를 워시아웃 단계의 PK 속도를 경험적으로 측정하는 지표로 사용하세요.
    11. 조영제로 강화된 OAI를 계산하세요.
      1. TTP보다 긴 시간대를 선택하세요. 이 시점의 신호 값을 대비 향상의 척도로 결정합니다.
        참고: 주사 후 10분 시점이 자주 선택되지만, 필요에 따라 다른 시점도 선택할 수 있습니다.
      2. 대안으로, TTP에서 선택한 시점까지의 평균 신호, TTP에서 마지막 시점까지의 평균 신호, 또는 필요에 따라 다른 시점 범위를 계산할 수 있습니다.
      3. 평균 신호는 이 두 시간점의 PK 곡선 아래 면적과 동등하며, 이는 기술적으로 신호 진폭의 척도가 아니라 신호 강도의 측정으로 알려져 있습니다.
    12. 4.3.13–4.3.20 단계에서 설명한 PK 모델링을 수행합니다.
      참고: 다음 단계는 inVision OAI 기기로 획득한 DCE OA 이미지를 분석합니다. 다른 OAI 기기들은 다른 데이터 형식으로 이미지를 생성할 수 있습니다. 아래 단계들은 다른 OAI 기기를 사용하여 DCE OA 이미지를 분석할 수 있으며, 다른 기기들의 데이터 형식을 MatLab으로 전송하고 소프트웨어 패키지에 포함된 예제 데이터 파일과 일치하도록 조정할 수 있습니다.
    13. 소프트웨어를 다운로드하세요.
      1. 다중 파장 DCE OAI를 원하시면 깃허브의 CAMEL-MartyPagel 저장소나 https://github.com/CAMEL-MartyPagel/OE-DCE_MSOT_Matlab 에서 OE-DCE_MSOT_Matlab를 다운로드하세요.
      2. 단일 파장 DCE OAI는 Github의 CAMEL-MartyPagel 저장소에서 DCE-MSOT_SingleWavelength_Matlab을 다운로드하거나 https://github.com/CAMEL-MartyPagel/DCE_MSOT_SingleWavelength_Matlab 다운로드하세요.
      3. 압축된 파일을 압축 해제하세요. doc 폴더에서 SOP 파일을 열고 소프트웨어 설치 및 사용 표준 절차를 따르세요.
    14. 소프트웨어 구성 요소를 여러 폴더로 정리하세요. 다음 소프트웨어 파일을 한 폴더에 저장하세요:
      주요 코드: run_MSOT_nonneg.m
      하위 코드: run_DCE_MSOT_MSP.m ; run_OE_MSOT_AK_nonneg.m
      기타 코드: Negative_pixel_count.m; Voxel_count.m; ROI_modification.m
      폴더 제목: com.itheramedical.msotlib_beta_rev723_20221128_M2022b
      재구성 및 스펙트럼 언믹싱 후 ViewMSOT에서 내보내는 데이터입니다.
    15. MatLab에서 프로그램을 실행하세요.
      1. run_MSOT_nonneg.m을 더블 클릭하면 Matlab에서 프로그램을 시작할 수 있습니다. Matlab 창 상단의 "실행" 버튼을 클릭하세요. 코드는 현재 폴더나 MATLAB 경로에 run_OE_MSOT_AK_nonneg 없는 오류를 보고할 수 있습니다.
      2. 이 오류를 해결하려면 addpath를 입력한 후 파일 위치를 따옴표로 표시하세요(예: addpath 'C:\Users\yourname\Documents\Non negative analysis').
    16. 분석 유형을 선택하세요: OE 분석은 N 을, DCE 분석은 Y 를 입력하세요.
      참고: 이 프로그램은 산소 증강(OE) OA 이미지를 분석할 수 있는데, 이는 21% 산소 흡입 가스(의료용 공기) 또는 100% 산소 2 호흡 가스와 결합된 %sO2 지도를 조합하여 이루어져 있으며, 이 프로토콜에서 설명된 OS-DCE OAI 연구에는 사용되지 않습니다.
    17. 데이터를 선택하세요:
      1. DCE OAI 파일이 포함된 폴더를 선택하세요. MSP 하위 폴더가 아니라 메인 스캔 폴더를 선택하세요.
      2. 그 다음 스캔 이름을 확인하세요. 마지막으로, 분석된 데이터를 저장할 폴더를 선택하세요.
    18. 색소자 수를 위해 3 을 입력합니다. 색소는 Hb, HbO2, 그리고 대조제입니다.
      참고: 이 프로그램은 필요 시 마우스 모델에 공동 주입되는 여러 색포어에 대한 DCE OAI 분석을 수용하도록 설계되었습니다. 하지만 이 프로토콜의 DCE OAI 프로토콜은 하나의 크로모포어만 사용합니다.
    19. 4.3.19.1–4.3.19.4 단계에 설명된 대로 투자 수익률(ROI)을 그립니다.
      1. 분석을 위한 동맥 입력 함수로 작용할 혈관의 ROI를 그리세요: 스캔의 그레이스케일 이미지가 나타납니다. 혈관을 나타내는 ROI를 수동으로 추적하세요.
        참고: 이미지 오른쪽 상단에 플러스 기호가 있는 돋보기를 클릭하면 확대할 수 있습니다. 돋보기를 다시 클릭하면 ROI를 그리는 모드로 돌아가세요. 척추 근처의 하대정맥은 종종 AIF로 식별되어 사용될 수 있습니다.
      2. 종양의 ROI를 그리세요: 스캔의 회색 이미지가 나타납니다. 종양 전체, 즉 종양 가장자리 또는 종양 핵심을 나타내는 ROI를 추적하세요. 두 가지 이상의 ROI를 분석하려면 추가 ROI를 위해 이 전체 PK 모델링 절차(Step 4.3.12)를 반복하세요.
      3. 근육 부위의 ROI를 그리기: 이 ROI를 DCE OAI 계산에 사용하지 마세요. 이 보고서에서는 사용되지 않은 선형 참조 영역 모델을 사용하여 DCE OAI 분석에 근육의 ROI를 사용합니다. 이 단계는 프로그램이 계속되기 위해 반드시 수행되어야 합니다.
      4. 올바른 ROI가 인출되었는지 확인하세요. PK 곡선의 모델링이 시작될 것입니다.
    20. 분석된 DCE OAI 결과를 시각화하세요.
      1. 분석된 DCE 데이터를 불러오려면 브라우저 바에서 DCE_MSOT_MSP을 선택하세요.
      2. 명령 창에서 모두 지우기(clear all)를 입력하세요.
        참고: 현재 폴더 탭에는 분석된 DCE OAI 데이터가 채워져 있으며, 여기에는 다음이 포함됩니다:
        Average_signal_Wavelength_ICG.mat: 종양 ROI의 NKtrans 와 kep 값을 더블 클릭하면 표로 확인할 수 있습니다. 운동 변수는 세 가지 방식으로 표로 정리됩니다:
        NK트랜스_avg: 각 픽셀에 대해 계산된 NK트랜스 의 평균값입니다.
        NKtrans _avg_signal: 전체 종양의 신호를 평균화한 후 계산된 단일 NKtrans 값
        NK트랜스 _nz: NK트랜스_avg 0이 아닌 픽셀 값만으로 계산됨.
        마찬가지로 kep 값도 표시할 수 있습니다.
        NKtrans.fig: NK트랜스 _avg 지도를 회색 이미지 위에 겹쳐 표시합니다.
        kep.fig:kep_avg 지도를 그레이스케일 이미지 위에 겹쳐 표시합니다.
        Maps_Wavelength_ICG.mat: 다른 북유트랜스 포트 또는 KEP 맵을 시각화하려면 이 파일을 불러와야 합니다. 이 행렬을 로드한 후, 별도의 포함된 "오버랩 코드"를 사용하여 원하는 매개변수를 표시합니다.
        Muscle_Average_signal_Wavelength_ICG.mat 및 Muscle_Maps_Wavelength_ICG.mat : 근육 ROI 매개변수 표시.
        ICG의 정규화 신호. fig: 세 ROI에서 ICG의 평균 신호를 최대 신호로 정규화하여 시간에 따른 평균을 나타냅니다.
        ICG.fig의 신호: 세 가지 ROI에서 ICG의 평균 신호를 나타냅니다.

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결과

OAI 신호는 종양과 상처에서 산소 포화 지도를 생성할 수 있습니다
다중분광 OAI 데이터셋을 획득하고 재구성한 후, 종양이나 상처 침대 내에서 관심 영역(ROI)을 정의하여 서로 다른 파장에서의 신호 강도를 정량화할 수 있습니다. 그 후 스펙트럼 혼합 알고리즘을 적용하여 복합 광음향 신호에서 옥시헤모글로빈(HbO2)과 디옥시헤모글로빈(Hb)의 기여도를 분리합니다. 이 처리 과정을 통해 HbO2, Hb, 총 헤모글로빈(HbT), 혈중 산소포화도(%sO2)의 정량적 지도를 생성할 수 있습니다(그림 4).

OAI에서 도출된 %sO2 지도는 종양과 상처 모두에서 조직 산소 공급과 저산소증을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 종양에서는 비정상적이고 뒤틀린 혈관이...

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토론

DCE OAI PK 곡선은 PK 분석의 신뢰성을 떨어뜨리는 다양한 인공물에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 일반적인 함정 중 하나는 영상 필드 내에 표면 상처, 딱지, 마른 혈액이 존재하는 점으로, 이로 인해 피부 표면에서 강한 비특이적 흡수가 발생해 더 깊은 신호가 흐려질 수 있습니다(그림 8). 종양 내에서 ROI를 그릴 때는 이러한 표면 구조를 포함하지 않도록 주의해야 하며, 추출된 곡선이 표면 인공물이 아닌 종양 내 조영 역학을 반영하도록 해야 합니다.

혈관 접근과 주사 품질도 매우 중요합니다. 그림 8E는 조영제 주입 실패 또는 부분 주사 후 나타나는 대표적인 PK 곡선을 보여줍니다. 카테터가 정맥 접근을 유지하지 못하거나, 주사가 침투되어 있거나, 볼루스가 비교적 빠르고 일...

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공개 사항

저자들은 이 연구와 관련하여 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자들은 상담을 해주신 iThera Medical, GmbH의 닐 버튼 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 UW-매디슨 방사선학 NRSA 보조금(2T32CA009206-46), ITPT 방사선과학 연수생 파일럿 보조금, 임상 및 중개 과학상(CTSA) 프로그램, 국가 중개 과학 진흥 센터(NCATS), UL1TR002373 및 TL1TR002375 보조금, NIH R43 CA265603, NIH R01 EB034261, NIH R21 EB037731, 그리고 Falk 의학 연구 신탁의 Falk Catalyst Award로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
20G 바늘엑셀 지능26417주사주사; 20G x 1", 헤파린 용액 제조에 사용됩니다
4T1 세포ATCCCRL-2539삼중음성 유방암 세포주
안티-앤티 (100배)깁코15240-062항생제 혼합
생검 펀치인테그라 33-366mm 일회용 생검 펀치 
세포 배양 등급 물코닝25-055-CV500 mL; USP 무균 세이터에 따라 인정 사양에 대해 시험 및 nbsp;
콜라겐 매트릭스 용액코닝354262종양 형성 및 주입을 위한 콜라겐 매트릭스
에탄올디컨 연구소2701범용 소독제
눈 윤활제 옵틱스케어 50-218-844220 g/0.70 oz; 동물용으로만 사용하며,
거즈 피셔브랜드22-415-468면 거즈 패드; 3인치 x 3인치(7.6 x 7.6 cm); 12층 합판
장갑VWR76457-130니트릴 검사 장갑
헤파린메이힐NDC71288-402-1010 mL당 10,000 USP 단위, 1000 USP 단위 10 mL 다중 투여 바이알
인도시아닌 그린TCII0535광음향조영제
이소플루란이소스피어17033-091-25말과 개에게 사용되는 불가연성 비폭발성 흡입 마취제; 250 mL  
실험실 필름파라필름 PM-9922인치 x 250피트; 1인치 직경 코어
네어 바디 브림 제모  나이어LL4038피빌러티브 크림; 풍부한 코코아 버터 & 비타민 E
니들 테루모NN2732R27G x 1 1/4" (6.40 mm x 32 mm); R.W. 레지. 베벨  
광음향 영상 기계iTheraMedical 비전 512 석사 과정광음향 스캐너
PBS, 1회코닝 21-040-CV500 mL; 칼슘과 마그네슘 없이 인산 완충 식염수;
RPMI코닝 10-040-CV세포 배양 배지
생리식염수호스피라NDC0409-4888-0210 mL 단일 용량; 0.9% 염화나트륨 주입, USP
스톱워치iTheraMedical 4135333분과 초를 기록하는 데 사용되었습니다.
주사기카디널 헬스11881280121 mL 인슐린 주사기; U-100 인슐린만 사용; 27G x 1/2" (0.35 x 12.7 mm)
투명 상처 드레싱테가덤1624W투명 필름 드레싱 프레임 스타일; 2 3/8" x 2 3/4" (6 cm x 7 cm)
핀셋테르모 일렉트론과 nbsp;7626쥐에 세포를 주입할 때 피부를 뒤로 당기는 데 사용되었습니다
초음파 젤에코뷰28332g 팩, 프르필렌 글리콜 프리, 수용성, 파라벤 및 염료 프리
무염색 봉합사에티콘VR49318인치 커팅; P-3 3/8 13 mm; 염색하지 않고 꼬인 합성 흡수성 봉합사, 비 USP
워밍 패드렙티 열기 UTH120VAC 60Hz 8W 마취 상태에서 동물을 데우는 데 사용되었고; 그리고 nbsp;
부목그레이스 바이오랩스476684투명 실리콘, 14mm 외경 x 10mm 내경, 두께 0.5, 봉합 부위와 nbsp;
상처 클립반사 7203-1000반사 스킨 클로저 시스템, 7mm, 스테인리스 스티

참고문헌

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