방법 논문

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

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DOI:

10.3791/70693

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2026년 5월 22일

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1Center for Molecular and Functional Biology Research, National Institute of Science and Technology in Tuberculosis, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 2Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, School of Health and Life Sciences, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul, 3Graduate Program in Medicine and Health Sciences, School of Medicine, Pontifical Catholic University of Rio Grande do Sul

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

결핵(TB)은 전 세계적으로 단일 감염성 인종으로 인한 사망 원인 중 주요 원인 중 하나로 남아 있으며, 약물 내성률 증가로 인해 새로운 치료제 개발이 전 세계적인 보건 우선순위가 되고 있습니다. 이 프로토콜은 세 단계의 통합 단계를 거쳐 잠재적인 항결핵 약물 후보를 식별하기 위한 표현형 선별 접근법을 설명합니다. 첫째, 4-아미노퀴놀린 계열의 화합물을 3단계 경로를 통해 합성되며, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 핵자기공명(NMR) 분광법, 고해상도 질량분석법(HRMS)으로 완전히 특성화됩니다. 둘째, 화합물의 항균 활성을 Mycobacterium tuberculosis 에 대해 평가하며, 이는 색도 측정 레사주린 환원 마이크로플레이트 분석법(REMA)을 통해 간단한 시각적 색상 변화 판독을 통해 최소 억제 농도(MIC)를 결정합니다. 셋째, 이 화합물의 세포독성은 두 가지 포유류 세포주인 Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장)와 HepG2(인간 간세포암)에서 MTT 분석법(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)과 중성 적색 흡수(NRU) 분석법을 사용하여 평가합니다. 이 두 상호보완 검사법은 서로 다른 세포 매개변수를 측정하여 세포독성 결과의 교차 검증을 가능하게 합니다. MIC와 세포독성 데이터를 함께 사용하여 각 화합물의 치료 잠재력을 평가하기 위한 선택성 지수(SI)를 계산할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 단계의 항결핵 발작 식별과 전임상 평가를 위한 재현 가능한 단계별 프레임워크를 제공합니다.

서론

주로 결핵균(Mtb)에 의해 발생하는 결핵(TB)은 인간의 감염성 호흡기 질환으로, 주로 폐를 표적으로 하지만, 폐외 변이체도 발생할 수 있습니다. 결핵은 활동성 질환을 가진 개인이 분비하는 MTB 박테리아를 통해 전파됩니다. 질병 진행에 따라 결핵에 감염된 사람은 즉시 활동성 결핵에 걸릴 수 있습니다. 그러나 일반적으로 새로 감염된 사람은 잠복 결핵에 걸리는데, 이는 대사 활동이 낮은 Mtb 세포가 육아종 1,2 내에서 생존하는 경우입니다. 잠복 결핵을 가진 사람은 결국 활성 형태의 질환으로 발병하여 임상 증상을 나타낼 수 있습니다. 현재 전 세계 인구의 4분의 1이 잠복 결핵 감염을 가진 것으로 추정됩니다.

많은 발전에도 불구하고 결핵은 전 세계적으로 심각한 공중보건 문제로 남아 있습니다. 가장 최근 글로벌 결핵 보고서 자료에 따르면 2024년에 1,070만 명이 이 질병을 앓았다고 합니다. 같은 해 전 세계적으로 결핵으로 인한 사망자가 123만 명이 기록되어 결핵이 단일 감염성 인종에 의한 사망 원인 중 가장 큰 원인이되었습니다. MTB의 병리학과 복잡한 생물학 외에도, 빈곤과 영양실조 같은 사회경제적 측면과 흡연, 당뇨병, HIV 동시 감염과 같은 건강 관련 요인들이 질병 통제를 더욱 어렵게 만듭니다. 이로 인해 결핵이 오랜 기간 전 세계적인 보건 문제로 지속되어 왔습니다.

더욱이, 현재의 결핵 치료법들은 질병과의 싸움을 복잡하게 만드는 한계가 있습니다. Mtb 감수성 균주에 대해서는 표준 치료가 4가지 약물의 복합 요법으로 이루어집니다: 이소니아지드(INH), 리팜피신(RIF), 에탐부톨(EMB), 피라지나마이드(PZA). 이 항생제들은 최소 6개월간 투여되며, 치료 내내 엄격한 준수가 필요합니다. 이 치료 요법은 대부분의 경우에 효과적이고 성공률이 약 85%임에도 불구하고, 여전히 많은 도전 과제에 직면해 있습니다 5,6. 가장 큰 문제 중 하나는 부작용과 장기 지속 기간으로, 이는 종종 환자가 조기 중단을 초래하는 원인입니다. 이러한 중단과 잘못된 항생제 투여는 더 독성이 크고 비용이 많이 들며 광범위한 치료 요법이 필요한 내성 Mtb 균주를 선택하도록 유리하게 만듭니다 7,8.

이러한 상황을 고려할 때, 새로운 강력한 항결핵제 개발이 시급하다. 이 프로토콜은 표현형 스크리닝을 이용한 신약 후보 연구의 초기 단계를 개괄합니다. 이 프로토콜의 적용을 설명하기 위해, 평가를 위해 LABIO-17에서 유래한 4-아미노퀴놀린 화합물을 선택했습니다. LABIO-17은 이전에 우리 연구팀에 의해 Mtb 내 에노일-ACP-환원효소(InhA) 효소의 억제제로 확인되었으며, 이 효소는 이소니아자드(INH)9,10과 동일한 분자 표적입니다. InhA는 결핵균의 마이콜산 생합성에 관여하며, 이 균의 생존에 필수적이며, 유망한 분자 표적으로서의 중요성을 강조합니다11

프로토콜

1. 화학 합성 및 특성 분석

참고: 화학 물질의 합성 및 특성 분석은앞서 설명한 대로 수행됩니다. 1.1부터 1.4까지의 모든 단계는 니트릴 장갑을 끼고 잘 통풍되는 연기 후드에서 수행해야 합니다.

  1. 시약 준비
    1. 0.1% 개상산과 MeOH/CH₃CN (1:1) 제제
      1. 메탄올(MeOH)과 아세토니트릴(CH₃CN)의 부피를 같은 양으로 측정하여 1:1(v/v) 혼합물(HPLC 등급)을 준비합니다.
      2. 용매를 깨끗하고 건조한 용기(예: 부피 플라스크)에 섞으세요. 개미산을 첨가하여 최종 농도가 0.1%(v/v)로 만듭니다(예: 1 mL 개산 혼합물에 1 L 용매 혼합물에 추가).
      3. 부드럽게 휘저거나 저어 충분히 섞으세요. 실온에서 빛을 차단한 밀폐된 용기에 보관하세요.
    2. 초순수수에서 1% (v/v) 아세트산 제제
      1. 부피 플라스크를 초순수수(Ultrapure Water)로 헹군 후 작업대 위에 올려놓으세요. 최종 초순수수 부피의 ~80%를 플라스크에 추가합니다(예: 100 mL 플라스크는 80 mL, 1 L 플라스크는 800 mL).
      2. 보정된 피펫을 사용해 빙하 아세트산을 첨가하여 1%(v/v)를 달성합니다: 최종 부피 100mL→ 1.0 mL 아세트산을 추가하고; 최종 1L 용량→ 10.0 mL 아세트산을 첨가합니다.
      3. 빙글빙글 돌리거나 저어서 충분히 섞으세요. 플라스크에 울트라퓨어 워터를 최종 표시까지 채우고 섞으세요.
      4. 용액을 초음파 세척기(탱크 주파수 ~40kHz)를 사용해 상온에서 20분간 탈기 모드로 설정하여 제거합니다.
      5. 라벨이 붙은 호박색 병(라벨: 내용, 농도, 용매 등급, 날짜, 준비자)으로 옮깁니다. 실온에서 꽉 닫아 보관하세요.
    3. 아세토니트릴: 메탄올 (1:1, v/v), HPLC 등급 제제
      1. 아세토니트릴과 메탄올의 부피를 동일하게 측정합니다: 100 mL의 최종 부피 → 50.0 mL 아세토니트릴 + 50.0 mL 메탄올; 최종 부피 1L → 500 mL 아세토니트릴 + 500 mL 메탄올.
      2. 용매를 깨끗한 부피 플라스크나 병에 섞어 뒤집거나 저어서 혼합하세요. 혼합물을 0.45 μm 필터로 깨끗한 용기에 걸러내어 입자를 제거합니다.
      3. 용액을 초음파 세척기(탱크 주파수 ~40kHz)를 사용해 상온에서 20분간 탈기 모드로 설정하여 제거합니다.
      4. 라벨이 붙은 호박색 병(라벨: 조성, 용매 등급, 날짜, 준비자)으로 옮깁니다. 열과 빛에서 멀리 떨어진 실온에서 밀폐해 보관하세요.
    4. 컬럼 크로마토그래피를 위한 헥산/에틸 아세테이트 7:3 (v/v) 용액 준비
      1. 최종 부피의 70%를 헥산으로 측정하세요. 예시: 100 mL 최종 부피 → 70 mL 헥산.
      2. 최종 부피의 30%를 에틸 아세테이트로 측정하세요. 예시: 100 mL 최종 부피 → 30 mL 에틸 아세테이트.
      3. 두 용매를 깨끗하고 건조한 용기(예: 부피형 플라스크나 병)에 섞으세요.
      4. 뒤집거나 저어 균질할 때까지 충분히 섞으세요. 용기에 조성, 날짜, 용매 등급, 그리고 준비자를 적으세요.
    5. 컬럼 크로마토그래피를 위한 헥산/에틸 아세테이트 1:1 (v/v) 용액 제조
      1. 최종 부피의 50%를 헥산으로 측정하세요. 예시: 100 mL 최종 부피 → 50 mL 헥산.
      2. 최종 부피의 50%를 에틸 아세테이트로 측정하세요. 예시: 100 mL 최종 부피 → 50 mL 에틸 아세테이트.
      3. 두 용매를 깨끗하고 건조한 용기(예: 부피형 플라스크나 병)에 섞으세요. 뒤집거나 저어 균질할 때까지 충분히 섞으세요.
      4. 용기에 조성, 날짜, 용매 등급, 그리고 준비자를 적으세요.
    6. 포화 중탄산나트륨(NaHCO₃) 용액의 제제
      1. 수소탄산나트륨(NaHCO₃) 과잉 양을 계량하세요(물 100mL당 약 15–20g).
      2. 중탄산나트륨을 증류수가 알려진 양(예: 100mL)이 담긴 깨끗한 비커에 첨가합니다. 자기 교반기나 유리봉을 사용해 상온(20–25 °C)에서 혼합물을 연속적으로 저어줍니다.
      3. 더 이상 고체가 녹지 않고 바닥에 소량의 용해되지 않은 탄산수소나트륨이 남을 때까지 계속 저어주세요 — 이는 용액이 포화되었음을 나타냅니다.
      4. 현탁액을 10분에서 15분 정도 두어 녹지 않은 고체가 가라앉도록 하세요. 혼합물을 종이 필터나 소결 유리 깔때기로 걸러내어 과도한 미용해의 중탄산염을 제거합니다.
      5. 포화 중탄산나트륨 용액인 투명 여과물을 수집하세요.
      6. 용액을 꽉 닫힌 병에 보관하고, 화합물 이름, 농도(포화), 제조 날짜, 그리고 이니셜을 적어두세요.
      7. 용액은 실온에 두고, 필요할 때는 신선하게 준비하세요.CO2 는 시간이 지남에 따라 천천히 빠져나가며 농도가 변할 수 있기 때문입니다.
  2. 6-브로모-2-메틸퀴놀린-4-올 합성 (3)
    1. 4-브로모아닐린(1.2g, 7.3 mmol)과 무수 황산마그네슘(1.08g, 9.0 mmol)을 에탄올(15 mL)에 담은 용액을 준비합니다.
    2. 용액에 빙하 아세트산(0.33 mL)과 에틸 아세토아세테이트(1.8 mL, 14.1 mmol)를 첨가합니다. 반응 혼합물을 90°C에서 16시간 동안 저어줍니다.
    3. 반응 혼합물을 셀룰로오스, 11 μm 보존, 정성 필터 페이퍼로 여과하여 부유된 황산마그네슘을 제거합니다.
    4. 회전식 증발기를 사용해 에탄올을 증발시켜 아크릴레이트 중간체를 얻습니다.
    5. 고효율 합성 열전달 유체(재료표 참조) (15 mL)가 포함된 적절한 오일 세스를 사용해 230–250 °C에서 15분간 가열하여 반응을 완료합니다.
    6. 혼합물을 실온까지 식힙니다. 형성된 침전물을 걸러내고 헥산과 클로로포름으로 세척하세요.
    7. 최종 제품을 회전식 증발기를 사용하여 저압 하에서 잔류 용매가 모두 제거될 때까지 농축합니다(재료표 참조).
  3. 6-브로모-4-클로로-2-메틸퀴놀린 합성 (4)
    1. 6-브로모-2-메틸퀴놀린-4-올(0.65g, 2.8 mmol) 용액을 톨루엔(10mL)에 준비합니다. 용액에 산소염화인(V) (0.65 mL, 6.9 mmol)을 첨가합니다.
    2. 반응 혼합물을 110°C에서 2시간 동안 저어줍니다. 회전 증발기를 사용해 과도한 인(V) 옥시클로라이드를 제거합니다.
    3. 잔여물을 얼음 목욕에 식히세요. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 중화시킵니다.
    4. 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 제품을 추출합니다. 유기 상을 결합하여 무수 황산나트륨 위에 건조시킵니다.
    5. 회전 증발기를 사용해 용매를 증발시켜 고체 잔류물을 얻습니다. 회전 증발기를 사용해 생성된 고형물을 건조하여 원재료를 공급합니다.
    6. 화합물을 석리카겔(35–70 메쉬)에 플래시 크로마토그래피로 정제하며, 헥산:에틸 아세테이트(7:3)를 용출액으로 사용합니다.
  4. 6-브로모-2-메틸-N-(4-(피페리딘-1-일)페닐)퀴놀린-4-아민 합성
    1. 6-브로모-4-클로로-2-메틸퀴놀린(0.53g, 2 mmol), 4-(피페리딘-1-일)아닐린(0.57g, 3 mmol), 피리딘(0.24 mL), HCl 37% (0.2 mL) (20 mL)를 이소프로판올(20 mL)에 포함한 반응 혼합물을 준비합니다.
    2. 반응 혼합물을 85°C에서 16시간 동안 저어줍니다. 회전식 증발기를 사용해 용매를 제거하세요.
    3. 잔여물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 처리하세요.
    4. 생성된 고형을 셀룰로오스 11 μm 유지성 필터 페이퍼로 여과한 후 클로로포름(50 mL)에 용해합니다.
    5. 클로로포름 용액을 물(3 x 15 mL)로 씻으세요. 유기상을 무수 황산나트륨 위에 건조시킵니다.
    6. 회전 증발기를 사용해 용매를 증발시켜 녹색 고체를 얻습니다. 제품을 뜨거운 헥산(4 x 10 mL)으로 연속적으로 세척하여 정제합니다.
    7. 최종 정제는 헥산:에틸 아세테이트(1:1)를 용출액으로 사용하여 실리카겔(35–70 메쉬)에 플래시 크로마토그래피를 수행합니다.
  5. 얇은 층 크로마토그래피(TLC)
    1. TLC 실리카 겔 60 F254 플레이트에 얇은 층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 반응 진행 상황을 모니터링합니다.
    2. 시작 물질 4를 기준으로 반응을 모니터링하고 소비를 평가하세요.
  6. 멜팅 포인트 (M.P.)
    1. 녹는점 장치에 주걱 끝을 넣으세요. 녹는점 범위를 기록하세요.
    2. 측정된 값에 보정을 적용하지 마십시오. 실험을 세 개씩 진행하세요.
  7. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
    1. 6번 화합물 1–2 mg의 무게를 측정하세요. 1.0 mg/mL의 아세토니트릴/메탄올(1:1, v/v)에 혼합된 혼합물을 준비합니다.
    2. 분석 위해 재고 용액을 0.5 mg/mL로 희석하세요. 이중 펌프, 자동 인젝터, UV 검출기가 장착된 HPLC 시스템(재료표 참조)을 사용하여 시료를 분석합니다.
    3. 크로마토그래피 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 데이터를 획득하고 처리합니다(재료표 참조).
    4. 크로마토그래피 조건은 다음과 같이 설정하세요: 역상 C18 컬럼, 5 μm(250 x 4.6 mm) 사용(재료표 참조). 유량을 1.5 mL/min으로 설정하고 254nm에서 자외선 감지를 모니터링하세요. 이동상을 0분에서 7분 사이에 100% 물(0.1% 아세트산)으로 유지하세요; 100% 물(0.1% 아세트산)에서 90% 아세토니트릴/메탄올(1:1, V/V)까지 선형 구배를 7분에서 15분 사이에 적용합니다; 5분 동안 100% 물(0.1% 아세트산)으로 다시 넣고 추가로 10분 더 유지하세요.
  8. 핵자기공명 (1H, 13C)
    1. 화합물 6 15–20mg을 NMR 튜브에 무게를 젝습니다. 용매로DMSO-D 6 을 추가하세요.
    2. 표준 펄스 서열을 사용하여 NMR 분광기(재료표 참조)에서 1H및 13CNMR 스펙트럼을 획득합니다.
    3. 1H핵은 400 MHz, 13C 핵은 100 MHz로 기기를 작동시킵니다. 내부 기준으로 테트라메틸실란(TMS)을 사용하세요.
    4. 화학 이동(δ)을 ppm(백만분의 일)로 표현합니다. 실험에서 얻은 FID 파일을 사용하여 NMR 데이터를 시각화하고 처리하세요.
  9. 고해상도 질량분석법(HRMS)
    1. 6번 화합물 1–2 mg의 무게를 측정하세요. 0.1% 개상산이 함유된 MeOH/CH 3CN의 1:1 혼합물로 샘플을 준비합니다.
    2. 선형 이온 트랩 질량분석기와 오비트랩 질량분석기를 결합한 고해상도 오비트랩 질량분석기(재료표 참조)에서 분석을 수행하세요.
    3. 전자분사 이온화(ESI)를 사용하여 양이온 모드에서 분당 10 μL의 유량으로 직접 주입하여 시료를 주입합니다.
    4. 질량분석법 데이터 분석 소프트웨어의 원소 조성 도구를 사용하여 원소 조성을 결정하세요(재료표 참조).
  10. 컬럼 크로마토그래피 – 화합물 4
    1. 실리카겔 컬럼을 60 Å(70–230 메쉬, 0.063–0.200 mm)로 준비합니다. 실리카겔을 적절히 채우세요.
    2. 이동상으로 헥산/에틸 아세테이트(7:3, v/v)를 사용하세요. 조잡한 화합물 4를 컬럼에 적재하세요. 화합물을 희석하고 분획을 수집하세요.
    3. 분획을 TLC로 모니터링하고 순수 성분이 포함된 분획을 혼합하세요.
  11. 컬럼 크로마토그래피 – 화합물 6
    1. 실리카겔 컬럼을 60 Å(70–230 메쉬, 0.063–0.200 mm)로 준비합니다. 실리카겔을 적절히 채우세요.
    2. 이동상으로 헥산/에틸 아세테이트(1:1, v/v)를 사용하세요. 조잡한 화합물 6을 컬럼에 적재하세요. 화합물을 희석하고 분획을 수집하세요.
    3. 분획을 TLC로 모니터링하고 순수 성분이 포함된 분획을 혼합하세요.

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그림 1. 시약 및 조건: i = MgSO4, AcOH, EtOH, 90 °C, 16시간; ii = C12H10, C12H10O, 230-250 °C, 15분; iii = POCl3, 톨루엔, 110 °C, 2시간; iv = 피리딘, HCl, (CH3)2CHOH, 85 °C, 16시간. 이 수치의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

2. 최소 억제 농도 결정

  1. 실험 설계 및 플레이트 배치
    1. 앞서 설명한 11,12,13과 같이 M. tuberculosis의 성장을 억제하는 화합물의 최소 억제 농도(MIC)를 측정하기 위해 색도 레사주린 환원 마이크로플레이트 분석법(REMA)을 사용해 평가합니다.
    2. 기술적 복제 없이 시험된 각 화합물에 대해 세 번의 독립 실험(생물학적 복제 3회)을 수행하라(화합물당 1행, 실험당 1판).
    3. 양성 대조군으로 작용하는 화합물과 시험 화합물을 평가하여 분석 조건이 성장 억제를 가능하게 하는지 확인합니다.
    4. 양성 대조군으로 이소니아지드(INH)와 리팜피신(RIF)을 검사합니다.
    5. 대조 화합물(각각 INH와 RIF)에 대해 A와 B 행을 할당합니다.
    6. 시험 화합물( 그림 2의 화합물 A부터 F까지)에 대한 다음 행을 할당합니다.
    7. 1번부터 10번까지는 대조 및 시험 화합물을 두 번 연속 희석하여 각 화합물을 한 줄에 배치하고, 높은 농도는 열에 배치하고, 낮은 농도는 열에 배치합니다.
    8. 11번 열을 성장 배지와 박테리아를 포함한 생존성 조절제로 최종 DMSO 농도인 2.5%로 준비하며, 대조군이나 시험 화합물을 첨가하지 않습니다.
    9. 무균 조절용으로 12번 컬럼을 무균 조절용으로 준비하는데, 세균 세포가 없는 배지에 연속 희석 농도가 높은 대조군이나 시험 화합물을 첨가합니다(컬럼 10과 동일).
    10. MIC 플레이트의 대표적인 배치는 그림 2 를 참조하십시오.
  2. 시약 준비
    1. 올레산, 알부민, 덱스트로스, 카탈라아제(OADC)를 보충한 미들브룩 7H9 육수 조제.
      1. 초순수 90mL가 든 200mL 유리병에 7H9 분말 0.47g, 85% 글리세롤 0.24ml, 10% 트윈-80 0.5mL를 추가합니다.
      2. 매질을 121°C, 98.07 kPa에서 10분간 오토클레이브합니다.
      3. 매체를 식혀 만졌을 때 따뜻해질 때까지 기다립니다(약 45–50 °C).
      4. OADC 10mL를 추가하세요(저희는 시중에 판매되는 OADC를 사용합니다; 자세한 내용은 재료표 참조).
      5. 4°C에서 보관하세요.
        참고: 시약의 비율을 고려하여 실험에 적합한 양을 준비하세요.
    2. ADC와 함께한 미들브룩 7H9 육수 준비
      1. 초순수 90mL가 든 200mL 유리병에 7H9 분말 0.47g을 추가합니다. 매질을 121°C, 98.07 kPa에서 10분간 오토클레이브합니다.
      2. 매체를 식혀 만졌을 때 따뜻해질 때까지 기다립니다(약 45–50 °C). ADC 10mL를 추가하세요. 4°C에서 보관하세요.
        참고: 실험에 필요한 적절한 양을 준비하며, 시약의 비율을 유지하세요.
    3. 화합물 용액 제조
      1. 각 화합물의 기본 용액을 2 mg/mL에 DMSO에 용해하여 준비합니다.
      2. -20°C에서 보관하세요.
        참고: 실험 전에 최대 시험 농도는 용해도 평가를 기반으로 정의됩니다. 용해도 한계를 결정하려면 용액에 결정이 있는지 육안으로 검사합니다. 결정이 관찰되면 알리코트를 이전 농도의 절반으로 더 희석합니다. 이 평가는 5% DMSO를 사용하여 수행하세요.
    4. 화합물 작업 용액의 준비
      참고: 작업 용액은 실험 시점에 7H9 육수에 스톡 화합물을 희석하고 10% ADC를 보충하여 신선하게 준비해야 합니다. 작업 용액 내 최종 DMSO 농도는 5%여야 하며, 화합물 농도는 최고 시험 농도의 두 배여야 합니다. 특히, 분석 과정에서 박테리아가 노출되는 최종 DMSO 농도는 2.5%로, 박테리아 현탁액이 첨가된 후 부피가 두 배로 증가합니다(2.3절, 2.3.8단계 참조).
      참고: DMSO 2.5%는 저희 실험실에서 사용하는 박테리아 균주(M. tuberculosis H37Ra, H37Rv 및 임상 분리주)에서 허용됩니다. 다른 균주나 다른 박테리아 종을 다룰 경우, DMSO를 시험 화합물로 사용하여 성장 억제를 촉진하지 않고 사용할 수 있는 최고 DMSO 농도를 결정하기 위한 예비 MIC 실험을 수행하세요.
    5. 레사주린 용액 제조
      1. 10mL의 초순수수에 1mg의 레사주린을 녹여 0.01% 레사주린 용액을 준비합니다.
      2. 0.22 μm 필터를 사용해 용액을 멸균하세요.
        참고: 필터 멸균 레사주린은14주차 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 하지만 표준 절차로서 사용 전에 즉시 준비하세요.
  3. 마이코박테리아의 제제
    1. M . tuberculosis 단일 집락을 50mL 원심분리관에 접종하고, 10% OADC, 0.2% 글리세롤, 0.05% Tween-80을 보충한 7H9 육수 10mL를 넣습니다.
    2. 37 °C에서 지속적으로 흔들며(100 rpm) 배양하여 배양 밀도가 600 nm(OD600) 0.6에서 0.8(약 3주에서 4주)에 도달할 때까지 배양합니다.
      주의: M. tuberculosis H37Rv는 위험군 3 병원체로 분류되며, 공기 전파가 가능하며 인간에게 치명적인 질병을 일으킬 수 있습니다. 모든 조작은 생물안전 3등급(BSL-3) 실험실 내 인증된 생물안전 캐비닛 내에서 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하여 수행하십시오.
    3. 멸균 유리 구슬(1mm)으로 3분간 소용돌이 작용하여 박테리아 배양을 균질화합니다.
    4. 서스펜션을 15분간 쉬게 하여 덩어리를 가라앉히세요.
    5. 상청액의 OD600 을 측정하고 알리코트를 −80 °C에서 저장합니다.
      참고: 실험 시에는 박테리아 현탁액을 신선한 7H9 육수에 10% ADC를 보충한 후 이론상 OD600 /0.006으로 희석하세요. 분석하는 동안 100μL을 96웰 플레이트에 투여합니다.
  4. 96웰 플레이트 준비
    1. 12번 컬럼에 10% ADC를 보충한 7H9 육수 100 μL을 추가합니다.
    2. 11번과 9번부터 1번까지의 칼럼에 10% ADC(5% DMSO 포함)를 보낸 7H9 육수 100 μL을 추가합니다.
    3. 10번 열에 200 μL 화합물 용액(최고 농도의 두 배로 준비)을 추가하고(화합물당 한 행씩 할당).
    4. 화합물 용액 100 μL을 12번 열에 첨가합니다. 두 번에 걸쳐 연속 희석을 수행합니다: 10번 컬럼에서 9번 컬럼으로 100 μL을 전달하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
    5. 9열에서 1열까지 연속 희석을 계속하세요. 1열에서 마지막 100 μL을 버립니다.
    6. 11번부터 1번까지의 열에 100μL의 박테리아 현탁액(이론적 OD600 /0.006)을 추가합니다.
    7. 플레이트를 덮고 파라필름으로 밀봉한 후 37°C에서 7일간 배양하세요.
      참고: 그림 2 는 MIC 플레이트의 대표적인 배치입니다. 2.3.1부터 2.3.9까지를 해석하려면 이 그림을 참고하세요.
  5. 레사주린 및 데이터 분석
    1. 플레이트의 각 웰에 0.01% 레사주린 용액 60 μL을 추가합니다. 플레이트를 덮고 파라필름으로 밀봉한 후 37°C에서 48시간 배양하세요.
    2. 파란색(성장 억제)에서 분홍색(박테리아 증식)으로 색이 변하는 것을 관찰하세요.
      참고: 일부 실험에서는 불완전한 색상 변화가 보라색 우물을 만듭니다. 이것을 박테리아 증식으로 해석하세요.

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그림 2. 최소 억제 농도(MIC) 측정에 사용되는 육수 미세 희석판의 도식적 표현. 시험 화합물의 2단계 연속 희석이 1열부터 10열까지 분배되었으며, 이후 희석은 10열에서 1열까지 순차적으로 수행되며, 화합물 농도는 10열에서 가장 높다. A행과 B행은 각각 기준 약물인 이소니아지드와 리팜피신을 포함한 양성 대조군에 해당합니다. C–H행은 시험된 화합물에 해당합니다. 열은 생존성 조절(2.5% DMSO 및 박테리아 접종물을 포함한 배지)을 나타내며, 열(열은 박테리아 접종이 없는 상태에서 화합물을 포함한 배지)에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 포유류 세포주에서의 세포독성 평가

참고: 모든 세포 배양 조작은 인증된 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛 내에서 멸균 환경에서 수행하십시오.

  1. 포유류 세포주 준비
    1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 인간 간암(HepG2)과 아프리카 녹색원숭이 신장(Vero) 세포주를 배양합니다.
    2. 배지에 1.8g/L 중탄산나트륨, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1% 암포테리신 B(완전 배지)를 보충합니다.
    3. 세포 배양을 37°C에서 5%CO2가 포함된 가습 환경에서 배양합니다.
    4. 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 5–10분간 처리하여 하위 융합 세포(70%–80%)를 채취합니다.
    5. 트립신을 중화시키려면 같은 양의 완전한 배지를 넣으세요. 세포 현탁액을 15mL 원뿔관에 옮기고 200 x g 의 원심분리기에 5분간 보관합니다.
    6. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 10mL의 신선한 완전 배지에 재현탁합니다.
    7. 자동 세포 계수기나 트라이판 블루 배제 혈구계를 사용하여 세포 농도와 생존 가능성을 측정합니다.
      참고: 트리판 블루 배제를 위해 세포 현탁액 10 μL과 0.4% 트리판 블루 용액 10 μL을 혼합하여 혈세포계(또는 카운팅 슬라이드)에 올려 투여하세요. 죽었거나 막이 손상된 세포는 파란색으로 보이지만, 생존 가능한 세포는 염색되지 않은 상태로 남아 있습니다. 생존 가능성은 % 생존성 = (염색되지 않은 세포 / 총 세포) x 100으로 계산합니다. 생존율이 90%≥ 때만 시딩을 진행하세요.
    8. 세포 현탁액을 목표 씨앗 밀도에 맞게 희석하세요. 96웰 평평한 바닥판의 2번에서 12번 열의 각 웰에 100 μL의 셀 현탁액을 씨앗합니다.
      시딩 밀도: Vero 셀의 경우 4,000 셀/우물; HepG2 세포는 웰당 5,000 세포.
      참고: 세포가 로그 성장 단계에 머물며 48시간 분석 종료 지점 이전에 100% 합류하지 않도록 밀도를 최적화하세요.
    9. 1번 컬럼에는 세포 없는 완전 배지 100 μL을 채워 흡수도 측정을 위한 빈 공간으로 사용한다.
    10. 각 세포주별로 동일한 플레이트 4개를 준비하는데, MTT 분석용 2장, NRU 분석용 2장입니다.
    11. 세포 부착을 위해 37°C,CO2 5%에서 24시간 배양합니다.
  2. 화합물 희석 및 세포 처리
    1. 각 시험 화합물에 대한 재고 용액을 Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS) 또는 적절한 용매(예: 디메틸 황산화물)에 준비하세요; DMSO).
      참고: 분석하기 전에 화합물이 세포 배양 배지에 용해되고 용매 농도가 무독성인지(예: DMSO의 경우 <0.1% v/v) 있는지 확인하세요.
    2. 플레이트 레이아웃을 설계하여 빈칸, 적절한 컨트롤, 기술 복제본을 포함하도록 하세요. 8가지 농도에서 최대 9가지 화합물을 검사할 수 있는 대표적인 레이아웃은 그림 3에 나와 있습니다.
    3. 목표 농도 범위를 커버하기 위해 시험 화합물을 완전한 배지에 연속 희석하여 준비합니다. 모든 복제판을 위해 충분한 부피를 준비하세요.
      참고: 용매(예: DMSO)를 사용할 경우, 희석 배지를 보충하여 전체 희석 시리즈 전체에서 최종 용매 농도가 일정하게 유지되도록 하세요.
      참고: 용매 처리 우정(차량 대조)은 기능적 음성 대조군으로서 100% 세포 생존성을 정의하여 화합물 처리 우물을 정규화합니다. 분석법 검증을 위해 세포 사멸을 유발하는 농도(생존율 0%)의 세포독성 참조 화합물(예: 0.1% Triton X-100 또는 1 mM 도데실 황산나트륨)을 포함해야 합니다. 이 양성 대조 우물의 흡광도 값은 빈 정과 크게 다르지 않아 생존율 0%를 확인시켜야 합니다.
    4. 24시간 세포 부착 기간이 끝난 후, 역현미경으로 판을 육안으로 검사하여 세포가 부착되고 퍼져 있으며, 웰 표면의 약 70%–80%를 균질하게 융합하여 덮고 있는지 확인하라. 오염 또는 부착 불량이 표시된 폐기 판.
    5. 세포 단일층을 방해하지 않도록 피펫 팁을 각 웰 옆으로 기울이면서 배양지를 조심스럽게 흡입하세요. 건조를 방지하기 위해 단면으로 공정판을 설치합니다.
    6. 즉시 해당 웰에 적절한 시험 화합물 희석 또는 대조 배지 100 μL을 첨가합니다.
    7. 처리된 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 48시간 배양합니다.
  3. MTT 분석 프로토콜
    1. 0.5 mg/mL MTT 용액을 혈청 무첨가 DMEM에서 준비하세요. 0.22 μm 주사기 필터로 필터링하고 빛으로부터 보호하세요.
    2. 48시간 치료 후에는 세포를 육안으로 점검하여 예상되는 치료 효과를 확인하세요.
    3. MTT 플레이트에서 매체를 조심스럽게 흡입하세요. 각 웰에 0.5 mg/mL MTT 작업 용액 50 μL을 추가합니다.
    4. 37°C, 5%CO2에서 빛으로부터 보호하여 3시간 배양하세요.
      참고: 2–4시간이 흔하지만, Vero와 HepG2 세포는 일반적으로 3시간 배양으로 충분합니다. 필요하면 최적화하세요.
    5. 각 웰에 100% DMSO 100 μL을 첨가하여 포르마잔 결정을 용해합니다. 판을 100rpm의 궤도 셰이커 위에 15분간 올려놓고, 빛으로부터 보호하세요. 완전한 결정 용해를 확인하기 위해 제어 정을 점검하세요. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 570 nm에서 흡광도를 측정합니다. 가능하다면 기준 파장을 630–690 nm로 설정하세요.
  4. 중성 적혈 흡수(NRU) 분석 프로토콜
    1. 혈청 무첨가 DMEM과 필터에 40 μg/mL 중성 적색(NR) 용액을 준비합니다. NR 탈착 용액을 준비하세요: 1% (v/v) 빙하 아세트산, 49% (v/v) 에탄올, 50% (v/v) 초순수수.
      주의: 빙하 아세트산은 부식성이 있습니다; 배기구 후드에 손잡이가 있어.
    2. 48시간 치료 후에는 세포를 육안으로 점검하세요. NRU 플레이트에서 매질을 조심스럽게 흡입하세요.
    3. 각 웰에 40 μg/mL NR 작업 용액 100 μL을 추가합니다. 37°C,CO2 5%에서 2시간 배양합니다.
      참고: 이 세포주에서 최대 염료 흡수에는 2시간의 배큐 기간이 충분합니다.
    4. NR 작동 용액을 흡입하세요. 각 웰을 150 μL 멸균 PBS로 부드럽게 한 번 세척합니다.
    5. 각 웰에 NR 탈착 용액 150 μL을 추가합니다. 150rpm의 궤도 셰이커에 15분간 올려 염료를 추출합니다.
    6. 염료 추출이 완전히 이루어지도록 제어 우물을 점검하세요. 마이크로플레이트 리더기로 540 nm 흡수도를 측정했습니다.
  5. 데이터 분석
    1. 빈 열의 평균 흡광도를 계산하고 이 값을 모든 우물에서 빼서 배경 뺄셈을 수행합니다.
    2. 용매 독성 검사를 수행하려면 용매 조절 우물과 처리되지 않은 대조군을 비교하여 수행하세요. 생존 가능성이 정의된 임계값(예: 80%) 미만이라면 용매 세포독성을 고려할 수 있습니다.
    3. 용매 조절 우물에 대한 생존 가능성 비율을 계산하기:
      % 생존율 = (처리된 우물 흡광도 / 용매 제어 평균 흡수도) x 100.
    4. 화합물 농도의 로그10 (x축)에 대해 % 생존율(y축)을 그래프로 표시하세요. 비선형 회귀 모델(시그모이드 선량-반응, 가변 기울기)을 사용하여 CC50을 결정합니다.
    5. 선택지수(SI)는 CC50 을 MIC로 나누어 계산합니다.

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그림 3. MTT/NRU 세포 생존성 분석법 플레이트 설계 예시: 최대 9개 화합물의 세포독성 검사를 위한 조기 스크리닝 설정. (A) 플레이트 설계 체계. 1열은 셀 없이 '빈칸'으로 할당되어 있으며, DPBS 또는 완전한 배지로 채워집니다. 2번과 12번 열에는 세포가 시딩되어 완전한 배지("비처리 대조군") 또는 용매로 처리된 완전한 배지("용매 조절")가 처리됩니다. 3번부터 11번까지는 세포를 시딩하고, 검사 대상 화합물의 연속 희석으로 처리되며, 각 화합물당 농도당 1개의 복제를 수행합니다. (B) 48시간 처리 및 최종 분석 단계 후의 Vero NRU 플레이트(위)와 Vero MTT 플레이트(아래)의 대표적인 사진들입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

합성 과정에서 목표 화합물 6이 연한 녹색 고체(0.53g, 67% 수율)로 나왔다. 이 화합물은 227–229 °C의 녹는점을 가지며, UHPLC 순도는 99%(tR = 14.11 min)를 보입니다(그림 4). 화학 구조는 핵자기공명(NMR) 분광법과 고해상도 질량분석법(HRMS)으로 확인되었습니다. 1H NMR 스펙트럼(그림 5)은 1.50에서 3.13 ppm 사이의 피페리딘 모이에티와 대응하는 신호를 보였다. 2단계 메틸기는 전형적인 단일 유닛으로 2.38 ppm으로 나타났다. 3위 수소는 6.56 ppm의 단일 수소 형태로 나타났습니다. 페닐 링은 6.97 ppm과 7.17 ppm의 두 더블릿을 보였으며, 결합 상수는 8.9 Hz였습니다. 7위와 8위에서 수소는 7.63–7.75 ppm의 다중항을 생성했고, 퀴닐린 핵심의 5위 수소는 8.59 ppm(J = 2.0 Hz)의 이중항을 형성했다. 아민 수소는 8.66 ppm의 단일 입자로 관찰되었습니다. 13C NMR 스펙트럼(그림 6)은 2위치 메틸기에서 23.81 ppm 신호를 보였고, 24.85에서 49.70 ppm 사이의 신호는 피페리딘 모이에티에 해당했습니다. 3위 부위의 탄소는 100.52 ppm으로 나타났습니다. 나머지 다운필드 신호는 퀴놀린 코어와 페닐 링 탄소 때문이라고 추정되었습니다. HRMS는 화합물 6의 분자식을 확인했으며, m/z 396.1063에서 [M+H]+ 이온을 보였다(계산 C21H23BrN3: 396.1070).

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그림 4. 화합 물 6의 HPLC 크로마토그램 및 자외선 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 화합물 6의 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 6. 화합물 6의 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) 스펙트럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

M . tuberculosis 에 대한 화합물의 억제 작용은 MIC를 측정하여 평가하였으며, 이는 눈에 띄는 박테리아 증식을 완전히 방지하는 화합물의 가장 낮은 농도로 정의되었습니다. REMA 분석에서 색 변화가 없고(파란색이 남아 있음)는 성장 억제를 의미하며, 분홍색으로 바뀌면 박테리아 증식을 의미합니다. 이소니아지드(INH)와 리팜피신(RIF)이 약물 통제 역할을 했습니다. 결과는 그림 7에 제시되어 있습니다. 각 플레이트에는 성장 대조군(11열, 약물 없음)과 무균성 대조군(12열, 마이코박테리아 없음)이 포함되어 있었습니다. 화합물은 10번 열(최고 농도)에서 1번 열(가장 낮은 농도)까지 연속적으로 희석되었습니다. 그림 7에서 보듯, A행(이소니아지드)의 화합물의 MIC 값은 4열에서, B행(리팜피신)과 C행(합성 화합물)의 MIC 값은 5열에서 관찰됩니다. 저희 손에 있는 INH MIC 값은 H37Rv 균주에서 0.31 μg/mL, H37Ra 경우 0.16 μg/mL이며, RIF 경우에는 H37Rv 0.08 μg/mL, H37Ra 균주에 대해 0.01 μg/mL를 얻었습니다.

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그림 7. 레사주린 마이크로플레이트 분석법(REMA)을 이용한 마이 코박테리아 결핵 균의 최소 억제 농도(MIC) 결정. A–C 행, 1–10열: 이소니아지드(A행), 리팜피신(B행), 합성 화합물(C행)의 2회 연속 희석. 열11: 생존성 대조군(2.5% DMSO + 박테리아 함유 배지). 열: 멸균 통제 (매체 + 화합물). 파란색은 박테리아 증식을 억제하는 것을, 분홍색은 레사주린이 레소루핀으로 환원되어 세균 생존성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

NRU(Vero, 상단)와 MTT(Vero, 하단) 분석법 모두에 대한 대표적인 96웰 플레이트가 그림 3B에 나와 있습니다. MTT 플레이트에서는 명확한 색상 그라데이션이 관찰되며, 높은 화합물 농도에서는 반투명(생존 가능한 세포 없음)에서 낮은 농도에서는 진한 보라색(높은 세포 생존성)으로 변합니다. 마찬가지로 NRU 플레이트는 반투명에서 진한 분홍색으로 구배되어 중성 적색 염료가 생존 가능한 세포의 리소좀으로 흡수되었음을 나타냅니다.

현미경은 48시간 배큐 후 분석 상태를 시각적으로 확인해 줍니다(그림 8). 그림 8A 는 건강하고 처리되지 않은 대조 세포(Vero와 HepG2)와 세포독성 농도를 가진 세포를 비교합니다. 치료된 세포는 둥글고 분리되어 있으며 생존이 불가능한 것으로 보입니다. 그림 8B 는 최종 용해화 단계 이전의 중요한 시각적 체크포인트를 제공합니다. 이 연구는 생존 가능한 세포 내에서 진한 보라색 포마잔 결정이 형성되는 것으로 예상되는 현상(MTT 분석)과 두 세포 유형 모두에서 리소좀 내 적색 염료의 축적(NRU 분석)을 보여줍니다.

원시 흡광도 데이터는 차량 제어 체계에 정규화되어 비선형 회귀를 통해 분석하여 프로토콜 3.5 단계에 상세히 설명된 선량-반응 곡선을 생성했습니다. 표적 화합물 6 (LABIO-17에서 유래)의 경우, NRU 분석에서 CC50 은 12.2 μM(Vero)과 18.3 μM(HepG2)이었고, MTT 분석에서는 두 세포주 모두 CC50 >20 μM을 얻었습니다. 이로 인해 선택지수(SI)는 30.5에서 >50 사이로 이전까지 보고된10으로 나타났습니다.

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그림 8. Vero 및 HepG2 세포에서 세포독성 분석의 대표적인 현미경 이미지. 모든 이미지는 100배 배율로 촬영되었습니다. (A) 48시간 치료 후 세포 형태 비교. Vero(상단)와 HepG2(하단) 세포의 처리되지 않은 대조군 웰은 건강하고 융합된 단일층을 보였습니다. 반면, 세포독성 농도의 화합물을 처리한 세포는 둥글고 작아졌으며 플레이트 표면에서 분리된 모습을 보입니다. (B) 시약 첨가 후 용해화 전 중요한 시각적 체크포인트. MTT 분석(각 세포주별 왼쪽 패널)에서는 생존 가능한 세포가 눈에 띄는 짙은 보라색 포마잔 결정체를 포함하고 있습니다. NRU 분석(각 세포주별 오른쪽 패널)에서 생존 가능한 세포는 온전한 리소좀 내에 적색 염료가 축적된 모습을 보입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

분리된 효소가 아닌 전체 세포 활성에 의존하는 표현형 선별 접근법은 M. tuberculosis에 대한 활성 화합물을 식별하는 효과적인 전략입니다. 여기서 우리는 후보 화합물의 화학 합성, 최소 억제 농도(MIC) 측정을 통한 억제 작용 평가, 그리고 MTT 및 NRU 분석을 이용한 포유류 세포(Vero 및 HepG2)에서의 세포독성 평가를 포함한 이 접근법의 초기 단계를 설명했습니다.

합성 경로는 세 가지 주요 단계(그림 1)로 구성되었으며, 조작상 단순한 변환을 통해 고순도로 목표 화합물을 제공한다. 재현성과 효율성을 결정하는 여러 중요한 단계가 확인되었습니다. 초기 응축은 완전한 중간 형성을 보장하기 위해 정밀한 화학양론적 제어와 지속적인 역류가 필요합니다. 열 고리화 전에 용매를 완전히 제거하지 않으면 링 클로징 효율에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 순환화 단계 자체는 엄격한 온도 조절이 필요한데, 불충분한 가열은 불완전한 방향화 효과를 초래하고, 과도하거나 장시간 가열은 부산물 형성을 촉진할 수 있기 때문입니다. 염소화 과정에서는 반응 온도를 신중하게 조절하고 인산화염화물을 점진적으로 첨가하여 부반응을 최소화하고 4-위치에서 선택적 활성화를 보장하는 것이 권장됩니다. 방법 최적화 과정에서 소규모 절차적 조정으로 견고성이 향상되었습니다. 순환화 후 불완전한 침전의 경우, 급격한 담냉 대신 점진적인 냉각이 고체 회수를 촉진했습니다. 친핵 치환 단계에서 수율 감소가 관찰된 경우, 반응 시간을 연장하거나 아민 순도를 확인하는 것이 유익했습니다.

이 방법의 주요 한계는 고온 순환화와 인산화염화(hosphoryl chloride)와 같은 부식성 염소 시약이 필요하다는 점으로, 특정 실험실 인프라와 안전성이 요구됩니다. 치환 전자 효과는 서로 다른 아닐린이나 아민에 대한 재최적화를 요구할 수 있으며, 적응 없이 광범위한 스캐폴드 다양화를 제한합니다. 그러나 콘래드-림파흐 방식은 스크라우프형 합성(강한 산화제)이나 전이 금속 촉매 프로토콜(특수 촉매/불활성 대기)보다 운용적으로 더 단순합니다. 이 무금속 전략은 의약화학을 위한 기능화된 퀴놀린 중간체를 효율적으로 생성합니다.

MIC를 결정하는 데 사용되는 프로토콜은 육안 검사에 의존하는 색도 측정법입니다. 이 방법의 잠재적 도전 과제는 색상 변화가 불완전하여 뚜렷한 파란색(억제)이나 분홍색(성장) 대신 보라색 우물이 나타난다는 점입니다. 만약 이런 일이 발생한다면, 이는 마이코세테리아 증식 억제에 실패한 것으로 해석되어야 합니다. 또한, 연속 희석을 통해 화합물을 평가할 때, 최대 검사 가능한 농도는 화합물의 용해도에 의해 결정됩니다. 따라서 일부 경우에는 최대 용해 농도에서 억제가 관찰되지 않으면 결과가 불확실할 수 있습니다. 더불어, 다른 실험실에서는 프로토콜의 특정 단계를 자신들의 특정 조건에 맞게 조정할 수 있으며, 이로 인해 결과에 차이가 있을 수 있다는 점을 인정하는 것이 중요합니다. 처리량을 높이기 위해 이 프로토콜은 자동화에 맞게 조정할 수 있습니다. 96웰 플레이트 준비를 위한 액체 취급 시스템을 도입하면 피펫팅 오류를 줄여 정확성과 재현성을 향상시킬 수 있습니다.

세포독성 평가 프로토콜은 두 가지 서로 다른 포유류 세포주(Vero와 HepG2)와 두 가지 상보적 생존 가능성 검사(MTT 및 NRU)를 사용합니다. 이 프로토콜 내 여러 단계는 데이터 재현성과 정확성을 보장하는 데 매우 중요하며, 각 실험실은 자체 검증을 수행해야 합니다. 예를 들어, 초기 세포 시딩 밀도는 신중하게 최적화되어야 하는데, 과도한 접합은 접촉 억제와 대사 상태 변화를 초래하여 결과를 혼동시킬 수 있고, 덜 씨뿌리면 세포가 경미한 자극에 더 취약해져 독성을 과대평가할 수 있기 때문입니다15. 더불어, 가장 높은 농도는 화합물 용해도에 의해 제한되는 경우가 많으며, 침전은 부정확한 결과를 초래할 수 있습니다. 또한, 제안된 플레이트 배치(그림 3A)는 1차 스크리닝을 위해 설계되었으며, 기술적 복제를 포기하고 가장자리 효과를 무시하고 독립적인 생물학적 복제를 통한 검증을 통해 시험된 화합물 수를 극대화합니다.

이 프로토콜의 주요 강점은 MTT와 NRU 분석법을 병렬로 구현할 수 있다는 점입니다. 두 가지 모두 잘 확립되어 있지만, 서로 다른 세포 매개변수를 측정합니다. MTT 분석은 일반적으로 세포 생존력과 상관관계가 있는 미토콘드리아 탈수소효소의 대사 활성을 정량화합니다. 그러나 이 검사법은 환원 또는 산화 특성을 가진 화합물이나 미토콘드리아 호흡을 교란하는 화합물의 간섭에 취약하여 잠재적인 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다15. NRU 분석을 병렬로 실행하면 이러한 아티팩트를 문제 해결하는 데 도움이 됩니다. NRU 분석은 생존 가능한 세포가 리소좀 완전성을 유지하고 염료 흡수에 필요한 pH 구배를 유지하는 능력을 측정합니다. MTT와 NRU 결과 간의 불일치는 미토콘드리아 기능 장애와 같은 특정 독성 기전을 드러낼 수 있어 추가 조사가 필요합니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 잠재적인 항결핵 약물 후보를 식별하는 기본 단계를 제시합니다. 유망한 선택성과 효능을 보여주는 화합물은 이후 생체 내 연구와 같은 더 복잡한 감염 모델로 발전시킬 수 있습니다.

공개 사항

저자(들)는 이해 충돌 가능성을 보고하지 않았습니다.

감사의 글

이 연구는 국립과학기술연구소(NCTI/CNPq/SECTICS/MS/CAPES/FAPERGS, 보조금 번호 404838/2024-0), CNPq/MCTI 번호 44/2024 – 유니버설(보조금 번호 420934/2025-1), FAPERGS 06/2025 – PqG(연구비 번호 25/2551-00002734-9)의 지원을 받았습니다. C.V.B(CNPq, 보조금 번호 311949/2019-3), L.A.B.(CNPq, 보조금 번호 303499/2021-4), P.M.(CNPq, 보조금 번호 310888/2022-0)는 CNPq의 연구 경력 수상자입니다. 이 연구는 브라질 코르데나낭 데 아페페이크오아멘토 데 페소알 데 니벨 수페리어(CAPES, 재무 코드 001)의 일부 자금 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
세포주
HepG2 (human hepatocellular carcinoma)ATCCHB-8065Human liver carcinoma cell line
Mycobacterium tuberculosis H37RaATCC25177
Mycobacterium tuberculosis H37RvATCC27294
Vero (African green monkey kidney)ATCCCCL-81Primate kidney epithelial cell line
화학물질 – 합성
4-(Piperidin-1-yl)anilineSigma-AldrichTCI: P0887Amine precursor for compound 5/6
4-BromoanilineSigma-Aldrich108-67-8Starting material for quinoline synthesis
Acetic acid (glacial)Sigma-Aldrich695092Reagent in synthesis and mobile phase preparation
Acetonitrile (HPLC grade)Sigma-Aldrich34967HPLC mobile phase component and NMR solvent
ChloroformSigma-AldrichC2432Solvent for product extraction
DMSO-d6 (deuterated)Sigma-Aldrich175641NMR solvent
Dowtherm A (heat transfer fluid)Sigma-Aldrich / SolutiaTBDHigh-boiling solvent for thermal cyclization (230–250 °C); formerly listed as Dowtherm® A
Ethanol (absolute)Sigma-Aldrich459836Reaction solvent for Conrad–Limpach step
Ethyl acetate (HPLC grade)Sigma-Aldrich270989Column eluent component
Ethyl acetoacetateSigma-AldrichE12806β-ketoester reagent for quinoline ring formation
Formic acid (HPLC grade)Sigma-AldrichF05070.1% additive in mobile phase for HPLC and HRMS
Glass beads (1 mm, sterile)Sigma-AldrichG8772For homogenization of M. tuberculosis culture
HCl (hydrochloric acid, 37%)Sigma-Aldrich320331Acid catalyst in nucleophilic substitution
Hexane (HPLC grade)Sigma-Aldrich34859Non-polar eluent for column chromatography
IsopropanolSigma-Aldrich278475Reaction solvent for synthesis of compound 6
Magnesium sulfate (MgSO4, anhydrous)Sigma-AldrichM7506Drying agent and reaction catalyst
Methanol (HPLC grade)Sigma-Aldrich34860HPLC mobile phase and NMR solvent component
Phosphorus(V) oxychloride (POCl3)Sigma-Aldrich201170Chlorination reagent for intermediate 4
PyridineSigma-Aldrich270970Base catalyst in nucleophilic substitution
Silica gel (35–70 mesh) for flash chromatographyMacherey-Nagel815349Stationary phase for flash chromatography steps
Silica gel 60 Å (70–230 mesh) for column chromatographyMacherey-Nagel815381Stationary phase for column chromatography
Sodium sulfate (Na2SO4, anhydrous)Sigma-Aldrich239313Drying agent for organic phase
TLC Silica gel 60 F254 platesMerck1.05554Thin-layer chromatography monitoring
TolueneSigma-Aldrich244511Solvent for chlorination step
Ultrapure waterMillipore / equivalentN/AUsed in mobile phase preparation; formerly referenced as Milli-Q water in text
장비 및 기기
0.22 µm syringe filterMillipore / anySLGP033RSSterilization of resazurin solution (2.1.4); filtration of MTT working solution (3.3); filtration of Neutral Red working solution (3.4)
0.45 µm syringe filterMillipore / anySLHA033SSFiltration of mobile phase solutions
15 mL conical tube (sterile)Falcon / any352097 or equivalentCollection and centrifugation of cell suspension after trypsinization
96-well plate (flat bottom, tissue culture treated)Corning / any3596For cytotoxicity and MIC assays
Aluminum foilAny—Light protection of plates during MTT and NRU incubation and shaking steps
AutoclaveAny—Sterilization of media (121 °C, 98.07 kPa, 10 min)
Biosafety cabinet (Class II, certified)Any (BSL-3 certified)—Required for M. tuberculosis manipulations (BSL-3)
Cell counter (automated) or hemocytometere.g., Bio-Rad TC20 / NeubauerTBDFor cell concentration and viability determination
Centrifuge (capable of 200 × g)Any—Cell pelleting step
CO2 incubator (37 °C, 5% CO2, humidified)Any—Cell culture and treatment incubation
Heating mantleFisotom 12MTemperature-controlled heating mantle with Dowtherm® A
HPLC system (Dionex UltiMate 3000)Thermo Fisher Scientific5035.9200Dual pump, automatic injector, UV detector; for purity analysis of compound 6
Inverted microscope (or equivalent)Any—Visual inspection of cells at attachment (3.2), during treatment checkpoint (3.3, 3.4), and for assay status verification
Magnetic stirrer / hotplateAny—Solution preparation and reaction mixing
Mass spectrometer (LTQ Orbitrap Discovery)Thermo Fisher Scientific—High-resolution Orbitrap combined with LTQ XL; for HRMS of compound 6
Melting point apparatusAny (e.g., Stuart SMP10)—Melting point determination of compound 6
Microplate reader (absorbance)Any (e.g., BioTek Epoch)—Reads absorbance at 570 nm (MTT) and 540 nm (NRU)
NMR spectrometer (Avance III HD, 400 MHz)Bruker CorporationN/A1H and 13C NMR acquisition; located at PUCRS facility
Orbital shakerAny—100 rpm (MTT crystal dissolution); 150 rpm (NRU extraction)
Parafilm MBemis / Sigma-AldrichP7793Sealing of 96-well plates during incubation
Qualitative filter paperUNIFIL50,11,250Whatman Grade, cellulose; 11 µm retention; ~80 g/m²
Reverse

참고문헌

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