방법 논문

Drosophila melanogaster에서 FlyTrDT 파이프라인을 이용한 운동 건강 수명 및 수명 분석의 반자동 통합법

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DOI:

10.3791/70697

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2026년 10월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

Drosophila melanogaster는 노화 연구를 위한 강력한 모델 생물로 활용됩니다. 본 프로토콜에서는 수명과 기능적 건강수명 모두에 대해 재현 가능한 집단 기반 측정을 수행하는 데 필요한 단계들을 상세히 설명합니다.

초록

노화는 점진적인 기능 저하와 수명 단축으로 특징지어지며, 실험 연구에서는 대개 이 두 가지 파라미터를 독립적으로 평가합니다. Drosophila melanogaster에서는 노화와 신경 퇴행을 연구하기 위해 수명 측정법과 음성 지균성(negative geotaxis) 기반의 운동 능력 측정을 흔히 사용합니다. 그러나 초기 운동 성능과 장기 생존율을 정량적으로 통합하는 표준화된 체계는 부족한 실정입니다. 본 연구에서는 노화된 초파리의 수명 분석과 운동 건강수명(motor healthspan)의 객관적 정량화를 결합한 재현 가능한 반자동 워크플로를 설명합니다.

본 프로토콜은 제어된 초파리 사육 조건, 사망률 계산, 그리고 표준화된 MP4 녹화물(최소 1280 × 720 해상도, 30 frames/s)을 이용한 비디오 기반의 음성 광택성(negative geotaxis) 분석을 통합합니다. 운동 성능은 Python 3.12.1과 OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0, Matplotlib 3.5.2로 구현된 맞춤형 Python 기반 파이프라인을 사용하여 정량화합니다. 워크플로우는 프레임별 중심점 검출을 수행하며, 운동 기능의 연속적 지표로서 활성 등반 기울기(pixels/s)를 추출합니다. 생존 궤적은 생존 분율을 계산하고 사다리꼴 수치 적분을 수행하여 생존 곡선 아래 면적(AUC)을 구함으로써 분석합니다. 초기 운동 성능의 정규화를 통해 기능적 저하와 전체 수명 사이의 직접적인 비교가 가능해집니다.

이 워크플로우는 대조군 및 amyloid-β 발현 파리에서 반자동 등반 경사도 측정값과 기존의 수동 엔드포인트 점수를 비교하여 평가되었으며, 두 방법 모두 연령 의존적 운동 능력 저하를 감지하였습니다. 대표 데이터 세트에서는 Canton S 대조군의 재현 가능한 수명 궤적과 신경퇴행 모델에서의 측정 가능한 초기 운동 장애가 입증되었습니다. 이 방법은 관찰자 편향을 최소화하고 재현성을 높이며, 저비용 비디오 획득 시스템과 호환됩니다. 이 워크플로우는 유전적 모델, 약물학적 개입 및 신경퇴행 패러다임에 쉽게 적용될 수 있어, Drosophila의 통합 노화 표현형 분석을 위한 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다.

서론

노화는 수명의 단축뿐만 아니라 생리적 및 행동적 기능의 점진적인 저하로 특징지어집니다1. 신경퇴행성 질환에서는 뚜렷한 사망률이 나타나기 전에 운동 조정 능력이 조기에 손상되는 경우가 많으며, 이는 기저의 신경 세포 기능 장애를 반영합니다2,3. 초파리 Drosophila melanogaster는 짧은 수명, 유전적 조작의 용이성, 그리고 잘 확립된 행동 분석법 덕분에 노화와 신경퇴행을 연구하는 강력한 모델 시스템으로 부상했습니다4. Drosophila의 수명 분석은 개체 생존에 대한 강력한 척도를 제공하며, 음성 지성 운동(negative geotaxis) 분석은 운동 기능과 연령에 따른 운동 능력 저하를 평가하는 데 널리 사용됩니다5,6. 그러나 이 두 가지 측정값은 빈번하게 독립적으로 분석되어, 조기 기능 손상과 장기 생존 궤적 간의 정량적 관계를 규명하는 능력을 제한합니다. 운동 건강 수명(motor healthspan)과 수명을 통합적으로 분석하면, 중재 조치가 노화 속도, 질병 진행 또는 특정 생리적 시스템에 영향을 미치는지에 대한 기전적 통찰을 얻을 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 뚜렷한 사망률에 앞서 조기 운동 결핍이 나타나는 유전적, 약리학적 및 신경퇴행성 모델에 특히 적합하며, 관찰 가능한 생존 차이가 나타나기 전에 기능적 저하를 민감하게 감지할 수 있게 합니다.

전통적인 음성 지성 운동(negative geotaxis) 분석법은 정해진 시간 간격 내에 특정 높이에 도달한 파리의 비율과 같은 종점 기반 점수 산정 방식에 의존합니다. 이러한 수동 점수 산정 방식은 간단하고 비용이 저렴하지만, 관찰자 편향이 개입될 수 있으며 운동 역학의 미세한 차이를 간과할 수 있습니다. 연속적인 궤적 유도 측정법은 기존의 종점 기반 점수 산정 방식에 비해 미세한 운동 장애를 감지하는 민감도를 향상시킬 수 있습니다. 마찬가지로, 수명 분석의 경우 재현성을 보장하기 위해 엄격한 사망률 계산과 환경 표준화가 필요합니다7. 따라서 동일한 코호트 내에서 기능적 건강 수명 지표와 생존 데이터를 통합할 수 있는 접근 가능하고 재현 가능한 방법론이 여전히 필요한 실정입니다.

본 연구에서는 표준화된 수명 분석과 노화된 Drosophila의 운동 성능에 대한 비디오 기반 정량화를 결합한 반자동 워크플로우를 설명합니다. 오픈 소스 계산 도구를 사용하여 프레임별 중심점 검출을 수행함으로써, 운동 기능의 연속적 지표인 등반 기울기(pixels/s)를 추출합니다. 생존 데이터는 생존 분율을 계산하고 사다리꼴 수치 적분을 수행하여 생존 곡선 아래 면적(AUC)을 구함으로써 처리됩니다. 초기 운동 성능을 정규화하고 이를 생존 AUC와 통합함으로써, 본 프로토콜은 기능적 저하와 전반적인 수명 사이의 직접적인 비교를 가능하게 합니다. 이러한 접근 방식은 운동 건강 수명과 수명 결과를 연결하는 객관적이고 비용 효율적인 프레임워크를 제공하며, Drosophila의 노화 궤적에 대한 종합적인 표현형 분석을 가능하게 합니다(그림 1).

프로토콜

모든 실험은 Drosophila melanogaster를 사용하여 기관 실험실  가이드라인에 따라 수행되었습니다. 본 연구는 무척추동물을 대상으로 하였으므로 윤리 위원회의 승인이 필요하지 않았습니다. 무척추동물 연구를 위한 기관 동물 보호 가이드라인에 따라 모든 절차를 유지하십시오.

참고: 실험용 먹이는 4 °C에서 보관하고, 건조한 상태가 유지되는 경우 1주일 이내에 사용하십시오. 초파리를 25 °C, 12:12 h 명-암 주기 및 약 60%의 상대 습도 조건에서 배양하여 표준 환경 조건을 유지하십시오.

1. 표준 초파리 먹이 준비

  1. 기본 먹이 준비
    1. 100 mL 증류수가 담긴 용기에 옥수수 전분 6 g, 효모 5 g, D-glucose 4 g, sucrose 3 g, 효모 추출물 1 g, agar 1 g, malt extract 0.25 g을 혼합합니다.
    2. 균일한 현탁액이 형성될 때까지 스패튤라를 사용하여 내용물을 충분히 섞습니다.
    3. 인덕션 조리기를 사용하여 혼합물을 가열합니다. 500 mL 이상의 부피를 준비할 때는 약 85–100 °C에서 12–15분 동안, 100–400 mL 사이의 부피를 준비할 때는 5–10분 동안 가열하며, 가열하는 동안 지속적으로 저어줍니다.
    4. 표준 실험실 멸균 절차에 따라 가열된 혼합물을 오토클레이브(고압증기멸균)합니다.
    5. 오토클레이브 처리된 배지를 식힙니다. 온도계로 온도를 모니터링하여 50–55 °C에 도달할 때까지 기다립니다.
    6. 식힌 배지에 propionic acid 600 µL와 100% 에탄올 1 mL에 녹인 benzoic acid 100 mg을 첨가하고 충분히 섞습니다.
    7. 주의: propionic acid와 에탄올은 모두 휘발성이며 흡입하거나 피부에 접촉했을 때 자극을 유발할 수 있으므로, 장갑과 보호 안경을 착용한 상태로 환기가 잘 되는 곳에서 취급해야 합니다.
    8. 길이 10 cm, 지름 20 mm의 멸균 바이알 각각에 먹이 5 mL를 분주합니다.
    9. 바이알의 뚜껑을 열어둔 채로 실온에서 최소 5–6시간 동안 둡니다. 외부 파리가 들어가지 않도록 티슈 페이퍼로 덮어줍니다. 이 단계는 배지 제조 및 보관 조건의 차이로 인해 발생할 수 있는 수명 측정값의 변동성을 최소화하기 위한 것입니다.
  2. 약물 포함 먹이 준비
    1. 단계 1.1.1–1.1.5에 설명된 대로 성충용 먹이를 소량 준비합니다.
    2. 먹이를 50–55 °C까지 식힙니다.
    3. 증류수 또는 dimethyl sulfoxide (DMSO)와 같은 적절한 용매를 사용하여 원하는 농도의 테스트 화합물 스톡 용액을 준비합니다. 선택한 용매에 테스트 화합물을 녹여 고농도 스톡 용액을 만들고, 이를 식힌 먹이(50–55 °C)에 첨가하여 원하는 최종 농도를 맞춥니다. 이때 처리군과 대조군 전반에 걸쳐 용매 농도가 동일하게 유지되도록 합니다.
    4. 균일하게 분포되도록 충분히 섞습니다.
    5. 미리 응고시킨 기본 먹이 표면 위에 층을 쌓는 방식으로 약물이 포함된 먹이 2 mL를 각 실험 바이알에 분주합니다.
    6. 기본 먹이 위에 층을 쌓는 먹이에 용매만 동일한 부피로 첨가하여(예: 처리군에 사용된 것과 동일한 최종 농도의 증류수 또는 DMSO) 대조군 바이알을 준비합니다.
    7. 파리를 넣기 전, 층을 이룬 먹이가 실온에서 완전히 응고되도록 둡니다.
      참고: 먹이 취급 및 보관: 먹이를 저녁에 준비한 경우, 바이알을 티슈 페이퍼로 덮어 실온에서 하룻밤 동안 둔 후 다음 날 아침에 면마개를 삽입합니다. 바이알은 사용 전 항상 세척, 오염 제거 및 오토클레이브 처리를 해야 합니다. 면마개용 솜은 마개를 막기 전 별도로 오토클레이브 처리합니다. 면마개는 먹이가 최소 5–6시간 동안 완전히 굳은 후에만 삽입합니다.

2. amyloid-β를 발현하는 D. melanogaster의 생성

  1. 처녀 드라이버 암컷의 수집 및 검증
    1. 드라이버 플라이 라인을 다음 상태로 유지하십시오. 25 °C 처녀벌 채집 전 12시간 명기/12시간 암기 주기의 광주기 조건 하에 둡니다.
    2. 이산화탄소 마취를 짧게 실시하여, 드라이버 라인에서 갓 우화한 암컷 초파리를 오전과 늦은 오후에 하루 두 번 수집하십시오.
    3. 교배를 방지하기 위해 수집 직후 수집된 암컷들을 새로운 단성 바이알로 옮기십시오.
    4. 바이알을 다음 조건에서 배양하십시오. 25 °C 처녀 상태 검증을 위해 48시간 동안 추가로 배양합니다.
    5. 매일 바이알을 점검하여 유충의 존재 여부를 확인하십시오.
    6. 알 또는 유충 자손이 없는 것을 확인하여 처녀 상태임을 검증하십시오.
    7. 유전적 교배에 사용할 목적으로 유충 생산의 증거가 없는 암컷만 선별하여 유지하십시오.
  2. 유전 교배 설정
    1. 교배 설정 당일에 이산화탄소 마취를 짧게 실시하여 갓 우화한 UAS-APPE693G 성체 수컷을 수집하십시오.
    2. 새 먹이 바이알에 20마리의 virgin elav-GAL4 암컷과 10마리의 UAS-APPE693G 수컷을 넣어 교배를 설정하십시오.
    3. 교차 바이알을 다음 온도에서 배양하십시오. 25 °C 조절된 습도와 12시간 명기/12시간 암기 주기 조건 하에서.
    4. 초파리가 48시간 동안 교배하고 알을 낳도록 둡니다.
    5. 추가 자손이 필요한 경우 성충을 새로운 바이알로 옮기십시오.
    6. 과밀 현상과 세대 중첩을 방지하기 위해 산란 후 부모 파리를 제거하십시오.
    7. 우화가 일어날 때까지 표준 조건에서 자손을 성체로 발달시키십시오.
    8. 아밀로이드를 발현하는 F1 성체 초파리를 사용하십시오.β 후속 수명 및 건강수명 실험을 위해 뉴런에 처리합니다.
      참고: elav-GAL4 드라이버는 E693G Arctic 변이가 포함된 인간 아밀로이드 전구 단백질의 범뉴런성 발현을 가능하게 합니다. 표준 사육 조건에서 발현은 발달 단계 전체와 성체기에 걸쳐 일어납니다. 노화 실험의 경우, 일관된 유전적 배경과 적절한 대조군을 사용하십시오. 각 실험군 내에서 일정한 온도 조건을 유지하십시오.
      실험. 다음과 같은 낮은 배양 온도와 같이 18 °C, 개발 과정 중에 ~하는 데 사용될 수 있습니다.
      성인기에 이르기 전까지 트랜스진 관련 병리를 지연시킨다.

3. 초파리 수집

  1.  음성 지성 운동성 분석을 위한 초파리 수집
    1. 실험 설정 전, 모든 초파리 계통을 25 °C, 상대 습도 약 60%, 12시간:12시간 명암 주기 조건의 표준 초파리 배지에서 유지한다.
    2. 이산화탄소 마취를 짧게 실시하여 우화한 지 2~3일 이내의 성체 수컷 초파리를 수집한다.
    3. 실험 조건에 따라 수컷 초파리를 약물이 포함된 배지 바이알 또는 대조군 배지 바이알로 옮긴다.
    4. 배지를 3일마다 교체하며, 배지 상태가 저하된 경우 더 일찍 교체한다.
    5. 음성 지성 운동성 평가를 위해 지정된 연령이 될 때까지 초파리를 이 조건으로 유지한다.
      참고: 운동 성능 및 노화의 성별 차이로 인한 변동성을 피하기 위해 음성 지성 운동성 분석에는 수컷 초파리만 사용한다.
  2. 수명 분석을 위한 초파리 수집
    1. 마취 패드 위에서 소그룹의 초파리를 짧게 마취시킨다.
    2. 부드러운 붓을 사용하여 수컷 초파리를 선별한다.
    3. 수명 측정 결과에 영향을 줄 수 있는 장기적인 생리학적 영향을 방지하기 위해 선별 과정 중 이산화탄소 노출을 최소화한다.
    4. 실험 설계에 따라 각 신선한 배지 바이알에 수컷 초파리 10마리와 암컷 초파리 10마리를 1:1 성비로 넣는다.
    5. 배치당 3~4분 이내에 선별 및 분주를 완료한다.
    6. 총 마취 노출 시간이 9~10분을 초과하지 않도록 한다.
    7. 주의: 작업자의 노출을 최소화하고 초파리의 장시간 마취로 인한 생리학적 스트레스를 방지하기 위해, 이산화탄소 마취 시 적절한 조절기와 충분한 실험실 환기 시설을 사용해야 한다.
    8. 각 실험 조건당 4~6개의 반복 바이알이 준비될 때까지 단계 3.2.1~3.2.6을 반복한다.

4. 수명 실험

  1. 초파리 전이 및 유지
    1. 표준 조건에서 초파리를 유지한다.
    2. 과밀 상태, 유충 오염 및 먹이 부패를 방지하기 위해 정기적으로 초파리를 새로운 먹이가 든 바이알로 전이한다.
    3. 3일마다 초파리를 새로운 먹이로 전이한다.
    4. 바이알 내 유충 성장을 방지하여 먹이 공급 조건의 교란을 최소화하기 위해 이 전이 빈도를 유지한다.
    5. 모든 전이는 마취 없이 수행한다.
      참고: 수명 실험 중 마취는 특히 노화된 초파리에서 급성 사망을 유발할 수 있으므로 피해야 한다.
  2. 전이 중 사망률 평가
    1. 매 전이 시 코호트의 연령을 일(day) 단위로 기록한다.
    2. 기존 바이알을 주의 깊게 검사한다.
    3. 기존 바이알에 남아 있는 죽은 초파리의 수를 세어 기록한다.
    4. 새로운 바이알로 옮겨진 죽은 초파리의 수를 세어 기록한다.
    5. 중복 계산을 방지하기 위해 이 값들을 각각 별도로 기록한다.
    6. 다음 방정식을 사용하여 각 전이 시의 총 사망 수를 계산한다:
      총 사망 수 = 기존 바이알 내 죽은 초파리 수 + 새로운 바이알로 옮겨진 죽은 초파리 수.
    7. 현재 전이의 총 사망 수에서 이전 전이 때 "옮겨진(carried)" 것으로 기록된 초파리 수를 빼서, 이전 전이 이후 발생한 신규 사망 수를 결정한다.
    8. 이 계산법을 사용하여 바이알 간에 옮겨진 초파리가 여러 번 계산되지 않도록 한다.
  3. 생존해 있으나 비활성 상태인 초파리의 식별
    1. 노화된 초파리가 움직이지 않거나 등으로 누워 있을 때, 사망으로 판정하기 전 바이알 측면을 가볍게 톡톡 친다.
    2. 움직임이 발생하는지 관찰한다.
    3. 자극에 반응하여 움직임을 보이는 초파리는 생존한 것으로 간주한다.
    4. 자극에 움직임을 보이는 초파리를 사망으로 기록하지 않는다.
    5. 기존 바이알의 먹이 표면에 붙어 있는 살아 있는 초파리를 떼어내기 위해 바이알을 가볍게 톡톡 친다.
    6. 떼어낸 살아 있는 초파리를 새로운 바이알로 전이한다.
    7. 떼어낸 살아 있는 초파리를 사망으로 판정하지 않는다.
      참고: 생애 후기 단계에서는 죽은 초파리와 비활성 상태인 초파리를 정확하게 구별하는 것이 매우 중요하다. 사망 상태를 지정하기 전에 항상 가벼운 기계적 자극을 주어야 한다.
  4. 검열(Censoring) 기준
    1. 초파리가 바이알 탈출, 우발적 부상 또는 핸들링 문제로 인해 자연사 전 실험에서 제외된 경우 이를 우측 검열(right-censored)로 간주한다.
    2. 검열된 초파리는 실험에서 제외된 날에 별도의 열에 기록한다.
    3. 검열된 초파리를 사망으로 기록하지 않는다.
    4. 생존 분석의 사망 수 계산에서 검열된 초파리를 제외한다.
    5. 과도한 검열은 실험적 편향을 초래할 수 있으므로 검열을 보수적으로 적용한다.
      참고: 데이터 입력 시 "사망(dead)" 초파리와 "옮겨진(carried)" 초파리를 분리하면 사망 수의 과잉 계상을 방지하고 정확한 생존 곡선 재구성을 보장할 수 있다.
  5. 어세이의 지속
    1. 실험 전반에 걸쳐 단계 4.1–4.4를 반복한다.
    2. 마지막으로 생존한 초파리가 죽을 때까지 어세이를 지속한다.

5. 음성 지성(Negative geotaxis) 실험

  1. 초파리 준비
    1. CO₂ 마취 없이 실험용 먹이 바이알에서 초파리를 수집한다.
    2. 탈출을 방지하기 위해 작은 깔때기를 사용하여 초파리를 깨끗한 클라이밍 튜브(또는 음성 지오택시스 튜브)로 조심스럽게 옮긴다.
    3. 분석을 시작하기 전, 테스트 챔버에서 초파리를 5분 동안 적응시킨다.
    4. 일주기 변동성을 최소화하기 위해 모든 클라이밍 분석은 오후와 같이 하루 중 동일한 시간에 수행한다.
      참고: 빛의 세기가 운동 행동을 변화시킬 수 있으므로 테스트 중 직사광선을 피한다.
  2. 클라이밍 튜브 설정
    1. 높이 12 cm, 지름 2 cm의 투명한 원통형 클라이밍 튜브를 사용한다.
    2. 튜브 바닥에서 10 cm 높이에 수평선을 표시한다.
    3. 비디오 추적을 용이하게 하기 위해 튜브를 균일한 흰색 배경 앞에 수직으로 배치한다.
    4. 안정적인 스탠드에 스마트폰 또는 디지털 카메라를 설치한다.
    5. 튜브 전체가 프레임 안에 들어오는지 확인한다.
  3. 분석 절차
    1. 모든 초파리가 동시에 바닥으로 떨어지도록 단단한 표면에 놓인 폼 패드나 마우스 패드 위에 튜브를 세 번 강하게 두드린다.
    2. 즉시 약 30 frames/s의 속도로 10–12초 동안 비디오 녹화를 시작한다.
    3. 초파리가 10초 동안 자유롭게 올라가게 한다.
    4. 바이알당 최소 3회의 독립적인 시행을 기록한다.
    5. 시행 사이에 10분의 휴식 시간을 둔다.
    6. 대조군, 약물 처리군, 용매 대조군과 같은 각 실험 조건에 대해 분석을 수행한다.
    7. 10초 이내에 10 cm 표시선에 도달하거나 이를 넘은 초파리의 수를 센다.
    8. 10 cm에 도달한 초파리의 수를 E로 기록한다.
    9. 테스트한 전체 살아있는 초파리의 수를 T로 기록한다.
    10. 클라이밍 활동 백분율을 (E/T) × 100으로 계산한다.
    11. 3회 시행의 값들을 평균낸다.
    12. 값들을 mean ± SD로 보고한다.
  4. Python 스크립트를 이용한 반자동 클라이밍 분석
    1. 비디오 획득
      1. 높이 12 cm, 지름 2 cm의 투명한 클라이밍 튜브에 수직으로 배치한 스마트폰 카메라를 사용하여 음성 지오택시스 분석을 기록한다. 스마트폰 또는 디지털 카메라를 사용하여 약 30 frames/s, 최소 해상도 1280 × 720 픽셀로 비디오를 녹화한다. 카메라를 클라이밍 튜브로부터 약 15–20 cm의 고정된 거리에 배치하고 모든 녹화에서 동일한 획득 기하학적 구조를 유지한다. 픽셀 기반 측정의 내부 공간 보정 기준으로 알려진 튜브 높이(12 cm)를 사용한다.
      2. 튜브를 균일한 흰색 배경 앞에 배치한다.
      3. 10–12초 동안 비디오를 녹화한다.
      4. 모든 녹화에서 조명 조건을 일정하게 유지한다.
      5. 모든 녹화에서 카메라 거리를 일정하게 유지한다.
      6. 모든 녹화에서 튜브 위치를 일정하게 유지한다.
      7. 무게중심(centroid) 검출의 변동성을 최소화한다.
      8. 녹화된 비디오를 .mp4 형식으로 저장한다.
      9. 분석을 위해 녹화된 비디오를 데스크톱 컴퓨터로 전송한다.
    2. Python 기반 비디오 처리
      1. Supplementary File 1로 제공되는 맞춤형 자체 제작 Python 스크립트를 사용하여 비디오를 분석한다. 모든 분석은 Python 3.12.1 환경에서 OpenCV (cv2) 버전 4.9.0, NumPy 버전 1.26.4, Pandas 버전 2.2.0, Matplotlib 버전 3.5.2, Scikit-learn 버전 1.4.2를 사용하여 수행한다.
        1. Python 환경 또는 명령줄 인터페이스에서 스크립트를 실행하기 전에 Supplementary File 1 내에서 입력 비디오 경로와 출력 디렉토리를 지정한다.
        2. VIDEO_PATH 및 OUTPUT_CSV 변수를 편집한 후 python climbing_analysis.py를 사용하여 스크립트를 실행한다.
      2. 프레임 처리 및 객체 검출을 위해 OpenCV(cv2)를 사용한다.
      3. 수치 계산을 위해 NumPy를 사용한다.
      4. 데이터 내보내기를 위해 Pandas를 사용한다.
      5. 시각화를 위해 Matplotlib를 사용한다.
      6. 각 비디오를 프레임 단위로 처리한다.
      7. OpenCV의 VideoCapture 함수를 사용하여 비디오를 읽는다.
      8. 개별 프레임을 순차적으로 처리한다.
      9. 프레임을 그레이스케일로 변환한다.
      10. 배경 노이즈를 줄이기 위해 가우시안 블러링(Gaussian blurring)을 적용한다.
      11. 배경에서 초파리를 분리하기 위해 이진 반전 모드에서 Otsu 임계값 처리(Otsu's thresholding)를 적용한다.
      12. 작은 아티팩트를 제거하고 윤곽선 간극을 채우기 위해 형태학적 opening 및 closing 연산을 수행한다.
      13. 배경 아티팩트와 작은 노이즈 입자를 제외하기 위해 최소 윤곽선 면적 임계값인 60 pixels2를 초과하는 윤곽선을 식별한다.
      14. 각 유효한 윤곽선에 대해 공간 모멘트(spatial moments)를 계산한다.
      15. 각 유효한 윤곽선에 대해 무게중심 좌표 x와 y를 결정한다.
      16. 한 프레임에서 여러 마리의 초파리가 검출되면 무게중심 좌표를 평균낸다.
      17. 프레임당 하나의 평균 코호트 위치를 얻는다.
    3. 품질 관리 평가
      1. 검출된 윤곽선이 녹화 전체 과정에서 보이는 초파리와 일치하는지 확인하여 초파리 분리가 성공적으로 이루어졌는지 검증한다.
      2. 균일한 흰색 배경과 안정적인 조명 조건을 사용하여 초파리와 배경 사이에 충분한 대비가 확보되도록 한다.
      3. 과도한 눈부심, 그림자, 튜브 움직임, 심한 초파리 겹침 또는 튜브 가시성이 불완전한 비디오는 제외한다.
      4. 녹화의 상당 부분에서 무게중심 추적이 실패하거나 임계값 처리로 인해 지속적인 배경 아티팩트가 발생하는 비디오는 분석에 부적합한 것으로 간주한다.
    4. 클라이밍 지표 추출
      1. 단계 5.3.7에 설명된 대로 클라이밍 점수를 수동으로 계산한다.
      2. 초기 및 최종 수직 무게중심 위치의 차이로 클라이밍 높이를 픽셀 단위로 계산한다.
      3. 전체 궤적 길이를 녹화 시간으로 나누어 평균 속도를 pixels/s 단위로 계산한다.
      4. 연속된 프레임 간의 최대 순간 변위를 피크 속도로 pixels/s 단위로 계산한다.
      5. 프레임 전체에 걸쳐 이동한 누적 거리를 궤적 길이로 픽셀 단위로 계산한다.
      6. 모든 무게중심 위치를 둘러싸는 볼록 껍질(convex hull)의 면적을 궤적 면적으로 pixels2 단위로 계산한다.
      7. 수평 방향 전환 횟수를 턴 횟수(turn count)로 계산한다.
      8. 연속된 프레임 간 무게중심 변위가 정지 거리 임계값인 3 픽셀 미만으로 유지되는 프레임 수를 정지 횟수(stop count)로 계산한다.
      9. 시간에 따른 수직 위치를 그래프로 그려 능동적 클라이밍 성능의 객관적 측정값을 얻는다.
      10. 녹화의 능동적 클라이밍 단계 동안 1초 롤링 선형 회귀 윈도우를 사용하여 초당 픽셀 단위의 클라이밍 기울기를 계산한다.
      11. 기울기 값을 생존 분석과 통합하기 위한 주요 운동 성능 지표로 사용한다.
      12. 클라이밍 높이, 평균 속도, 피크 속도, 궤적 길이, 궤적 면적, 턴 횟수, 정지 횟수 및 클라이밍 기울기를 포함한 정량화된 운동 지표를 .csv 파일로 내보낸다. 품질 검증 및 후속 분석을 위해 기울기 시각화 그래프를 .png 이미지 파일로 저장한다.

6. 초기 운동 건강 및 생존 분석의 통합

  1. 생존 데이터를 그룹, 날짜, 생존 초파리 수를 포함하는 .csv 파일로 내보냅니다.
  2. 각 시점에서 생존 초파리 수를 초기 코호트 크기로 나누어 각 그룹의 생존 분율을 계산합니다.
  3. 생존 분율 대 시간의 사다리꼴 수치 적분을 사용하여 생존 곡선 아래 면적(AUC)을 산출합니다.
  4. 운동 성능 데이터를 각 그룹의 7일 차 등반 기울기를 포함하는 .csv 파일로 내보냅니다.
  5. 각 그룹의 7일 차 기울기 값을 해당 대조군 기울기로 나누어 7일 차 운동 성능을 대조군인 Canton S에 대해 정규화합니다.
  6. 정규화된 7일 차 운동 값과 각 유전자형에 해당하는 생존 AUC 값을 병합합니다.
  7. 정규화된 7일 차 운동 성능과 생존 AUC의 기술적 비교를 수행하여 초기 운동 기능 저하와 생존 결과 사이의 관계를 평가합니다.
  8. 정규화된 7일 차 운동 성능과 생존 AUC 값의 그래픽 시각화 자료를 생성합니다(부속 파일 2).
    참고: 모든 생존-운동 통합 분석은 부속 파일 2로 제공된 맞춤형 Python 스크립트를 사용하여 수행하십시오. 데이터 처리 및 데이터세트 병합에는 Pandas를, 사다리꼴 수치 적분에는 NumPy를, 그래픽 시각화에는 Matplotlib를 활용하십시오.

7. 통계 분석

  1. 생물학적 반복 시료 바이알에서 얻은 대표 데이터셋으로 운동 능력 및 생존 측정값을 제시하십시오.
  2. 운동 능력 측정값은 독립적인 등반 시험의 평균값으로 보고하십시오.
  3. 등반 기울기(pixels/s)와 생존 AUC 값의 그래픽 시각화를 사용하여 운동 성능과 생존 결과 사이의 대표적인 관계를 입증하십시오.

결과

표준화된 사육 조건 하에서의 재현 가능한 수명 프로필
신선하게 준비된 표준 사료를 사용하여 제어된 환경 조건(25 °C, 습도 60%, 12시간:12시간 명-암 주기)에서 초파리를 유지했을 때, 대조군 집단은 독립적인 실험 전반에 걸쳐 일관된 생존 궤적을 나타냈다. Canton S 대조군 초파리는 약 65–72일의 중앙 수명을 보였으며, 최대 생존 기간은 75일까지 연장되었다(그림 2). 수명 실험은 조건당 2회의 생물학적 반복으로 수행되었으며, 각 반복에는 20마리의 초파리가 포함되었다. 표준화된 환경 및 사료 조건에서 얻은 대표적인 생존 궤적은 대조군 집단에서 재현 가능한 수명 프로필을 보여주었다.

이와 대조적으로, 범신경세포성 amyloid-β 발현 초파리는 Canton S 대조군에 비해 생존율이 감소했으며, 이는 Drosophila 알츠하이머병 모델에서 이전에 보고된 신경퇴행성 표현형과 일치합니다4,5,6.

먹이의 품질이 저하되거나 취급 조건이 일정하지 않을 때 수명 결과가 최적화되지 않을 수 있습니다. 이러한 조건에서는 처음 7–10일 이내에 초기 사망률이 급증하고 바이알 간 변동성(>25%)이 증가하는 것이 확인되었으며, 이는 실험 재현성이 손상되고 생물학적 반복 실험 간의 일관성이 감소했음을 나타냅니다.

반자동 등반 분석을 통해 검출된 연령 의존적 운동 능력 저하
전통적인 수동 음성 지성(negative geotaxis) 점수 측정 결과, Canton S 대조군에 비해 amyloid-β를 발현하는 초파리에서 연령 의존적인 운동 능력 저하가 검출되었다(그림 3). 7일 차에는 집단 간 등반 능력이 대체로 비슷하게 유지되었으나, 28일 차에 이르러 amyloid-β 발현 초파리는 대조군 초파리에 비해 등반 활동이 감소한 모습을 보였다. 대조군 코호트는 노화 시점 전반에 걸쳐 상대적으로 안정적인 등반 성능을 유지했다. 이러한 수동 측정 행동 경향은 반자동 FlyTrDT 파이프라인의 등반 기울기 값 감소와 일치했으며, 이는 전통적인 종점 점수 측정 및 컴퓨터 추적 워크플로우와 유사한 연령 의존적 경향을 나타냈다(그림 4). amyloid-β 발현 초파리에서 관찰된 운동 능력 저하는 전통적인 음성 지성 분석법을 사용한 Drosophila 신경퇴행 모델에서 보고된 확립된 연령 의존적 행동 장애와 일치한다6,7.

FlyTrDT를 이용한 반자동 등반 분석 결과, 대조군 초파리에서 초기 운동 기능이 유지됨이 확인되었습니다. 7일 차에 대조군 초파리는 평균 86.64 pixels/s의 등반 기울기를 보였으며, 이는 활발한 등반 단계 동안 상향 변위가 지속되었음을 나타냅니다(그림 4). 28일 차에는 기울기가 0에 가까워졌으며(−1.50 pixels/s), 이는 연령 증가에 따른 속도 저하와 일치하는 결과입니다.

이와 대조적으로, amyloid-β를 발현하는 초파리는 조기 운동 장애를 보였다. 7일 차에 등반 경사도는 34.25 pixels/s로 감소했으며, 이는 정규화 후 대조군 성능의 약 39%에 해당한다. 28일 차에는 등반 경사도가 −72.25 pixels/s로 크게 감소하여, 상향 운동 능력이 저하되었음을 나타냈다.

기울기 기반 지표는 능동적인 등반 구간을 포착하며, 초기 놀람 잠복기, 정체기 및 확률적 움직임 아티팩트로 인한 영향을 줄여줍니다. 양의 기울기는 순수 상향 이동을 나타내고, 0에 가까운 기울기는 제한적인 수직 변위를 나타내며, 음의 기울기는 순수 하향 변위를 나타냅니다. 이러한 대표 궤적은 연령이 일치하는 대조군과 비교하여 amyloid-β 발현 파리의 점진적인 운동 기능 저하를 보여줍니다.

최적의 기록 조건 하에서, FlyTrDT 파이프라인은 안정적인 윤곽선 분할과 일관된 수직 변위 프로파일을 갖는 연속적인 중심점 궤적을 생성하였습니다(그림 4A). amyloid-β를 발현하는 초파리에서 나타난 운동 능력 저하는 덜 지속적인 상향 궤적과 더 낮은 기울기 값으로 반영되었습니다(그림 4B–D). 과도한 눈부심, 불안정한 튜브 위치, 불일치하는 조명 또는 부적절한 배경 대비로 기록된 비디오는 불연속적인 중심점 궤적과 간헐적인 추적 아티팩트를 생성하였으며, 품질 관리 평가 과정에서 제외되었습니다.

초기 운동 성능과 생존 결과 사이의 연관성
초기 운동 성능과 생존 결과 사이의 연관성을 조사하기 위해, 유전자형 전반에 걸쳐 정규화된 Day 7 등반 경사 값과 생존 AUC(곡선 아래 면적)를 비교하였다(그림 5). 초기 운동 성능이 유지된 대조군 초파리(정규화된 운동 지수 = 1.0)는 더 높은 생존 AUC 값(48.2)을 보인 반면, 초기 운동 성능이 감소한 amyloid-β 발현 초파리(정규화된 운동 지수 = 0.395)는 더 낮은 생존 AUC 값(24.65)을 나타냈다. 대표적인 운동 능력 데이터 세트는 조건당 2개의 생물학적 반복 실험 vial로부터 생성되었다. 이러한 대표 데이터 세트는 amyloid-β 질환 모델에서 초기 운동 성능의 감소와 생존 기간 단축 사이에 연관성이 있음을 시사한다. 단 두 개의 대표 유전자형만 분석되었으므로, 이러한 결과는 통계적 검정력이 확보된 예측 상관관계보다는 기술적인 결과로 제시되었다.

형질전환 Drosophila 등반 분석; 알츠하이머병 연구를 위한 박스 플롯 및 카플란-마이어 곡선.
그림 1이동성 건강수명 지표와 생존 분석을 통합한 반자동 FlyTrDT 파이프라인의 워크플로우 개요. 워크플로에는 표준화된 초파리 사육 및 수명 분석, 수동 및 반자동 음성 광택성 평가, 등반 영상에서의 프레임별 중심점 추출, 등반 기울기(pixels/s) 계산, 생존 곡선 하 면적(AUC) 분석, 그리고 운동 성능과 생존 결과의 통합 분석이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CS 대조군과 Aβ 군을 비교한 생존 분석 그래프; 일수에 따른 확률.
그림 2: Canton S 대조군 및 amyloid-β 발현 초파리의 Kaplan–Meier 생존 분석. 생존 곡선은 표준화된 환경 및 식이 조건 하에서의 수명 궤적을 보여준다. Canton S 대조군 초파리는 범뉴런성 amyloid-β 발현 초파리에 비해 생존 기간이 연장되었으며, 후자는 노화 시점에 걸쳐 수명이 단축된 것으로 나타났다. 데이터는 조건당 2개의 생물학적 반복 vial에서 얻은 대표적인 생존 궤적을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

초파리 등반 분석 결과; 7일 차 및 28일 차의 CS와 elav-Gal4/UAS-Aβ42를 비교한 상자 그림.
그림 3: 대조군 및 아밀로이드-β(amyloid-β) 발현 초파리의 7일 차와 28일 차 수동 음성 지성(negative geotaxis) 수행 능력. 박스 플롯은 10초 이내에 10cm 임계값을 통과한 파리 개체 수의 백분율로 표시한 대표적인 등반 활동 측정값을 보여줍니다. Canton S (CS) 대조군 파리는 노화 시점 전반에 걸쳐 비교적 안정적인 등반 활동을 유지한 반면, amyloid-β 발현 파리는 28일 차에 등반 능력이 감소하였습니다. 각 점은 개별 바이알의 측정값을 나타냅니다. 대표 데이터 세트는 조건당 2개의 생물학적 반복 바이알로부터 생성되었습니다. 이 그림의 확대 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

등반 높이 분석; 그래프 A-D는 pixel/sec 기울기를 나타냄; 시간 대비 높이 차트; 데이터 추세.
그림 4: 대조군 및 amyloid-β 발현 초파리에서 등반 궤적과 능동적 등반 기울기의 반자동 추출. FlyTrDT 추적 파이프라인을 사용하여 음성 지성 행동(negative geotaxis) 비디오에서 대표적인 평균 수직 위치 궤적을 추출하였다. 파란색 선은 검출된 초파리의 시간에 따른 프레임별 평균 수직 중심 위치를 나타내며, 빨간색 세그먼트는 롤링 선형 회귀 윈도우를 사용하여 식별한 대표적인 능동적 등반 세그먼트를 나타낸다. 기울기 값은 pixels/s로 표시되었다. (A) 7일 차 Canton S 대조군 초파리. (B) 7일 차 amyloid-β 발현 초파리. (C) 28일 차 Canton S 대조군 초파리. (D) 28일 차 amyloid-β 발현 초파리. 대표 궤적은 조건당 2개의 생물학적 반복 실험 vial에서 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

초기 운동 건강 대 생존 그래프; 축은 정규화된 7일차 운동 건강 및 생존 AUC를 나타냄.
그림 5: 아밀로이드-β 독성 Drosophila 모델에서 초기 운동 능력과 생존 결과 사이의 연관성. 정규화된 7일차 등반 경사도 값을 Canton S (CS) 대조군 초파리와 아밀로이드-β 발현 (AD) 초파리(n = 2)의 생존 곡선 아래 면적 (AUC)에 대해 도식화하였다. 대조군 초파리는 아밀로이드-β 발현 초파리에 비해 더 높은 초기 운동 능력과 증가된 생존 AUC 값을 보였다. 이 대표 데이터 세트는 초기 운동 능력과 생존 결과 사이의 연관성을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 음성 지오택시스(negative geotaxis) 비디오로부터 반자동 운동 능력 정량화를 위해 사용된 Python 기반 FlyTrDT 등반 분석 스크립트입니다. 이 스크립트는 프레임별 이미지 처리, 중심점 검출, 궤적 추출 및 등반 기울기, 속도, 궤적 길이, 궤적 면적, 정지 횟수, 회전 횟수를 포함한 등반 지표 계산을 수행합니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 운동 건강수명 및 수명 데이터 통합을 위한 Python 스크립트. 이 스크립트는 생존율 계산, 사다리꼴 곡선 아래 면적(AUC) 분석, 7일 차 등반 경사값의 정규화, 데이터셋 병합, 그리고 운동 능력 및 생존 결과의 그래픽 시각화를 수행합니다.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 논문에서는 Drosophila melanogaster의 수명 분석과 반자동화된 운동 건강수명 정량화를 통합한 프로토콜을 제시합니다. 수명 및 운동 능력 측정의 신뢰성 있는 통합은 환경적 일관성, 먹이의 품질, 그리고 생물학적 반복 실험 전반에 걸친 표준화된 처리 절차에 크게 의존합니다7. 먹이의 건조 상태 차이, 전이 지연 또는 일관되지 않은 사망률 기록은 조기 사망 급증과 바이알 간 변동성 증가를 초래할 수 있으며, 이는 생존 곡선의 재구성 및 노화 표현형의 후속 해석에 영향을 미칠 수 있습니다.

음성 지오택시스(negative geotaxis) 분석 시, 비디오 처리 과정에서 신뢰할 수 있는 중심점 검출을 보장하기 위해 일관된 조명 조건, 카메라 위치 및 튜브 정렬이 필요합니다. 마취는 수명과 운동 성능 모두에 영향을 미칠 수 있으므로, 분류 과정 중 과도한 CO₂ 노출을 최소화해야 합니다. 동일한 코호트에서 반복적인 행동 측정을 수행할 때는 일주기 변동성을 줄이기 위해 매번 같은 시간대에 분석을 진행해야 합니다. 배경 대비가 부족하거나 조명이 일관되지 않으면 자동 분석 중 임계값 설정(thresholding) 및 윤곽선 검출(contour detection)이 저해될 수 있습니다. 비디오 처리 중 윤곽선 단편화나 불안정한 중심점 궤적이 관찰되면, 배경 대비를 높이고, 눈부심을 줄이며, 카메라 위치를 고정하고, 모든 녹화 과정에서 균일한 조명을 유지하십시오. 지속적인 임계값 설정 아티팩트는 녹화 각도를 조정하거나, 그림자를 줄이거나, 전체 등반 튜브가 프레임 내에 계속 보이도록 하여 최소화할 수 있습니다. 튜브 내에 초파리가 과도하게 밀집되면 정확한 중심점 추정이 어려울 수 있으므로, 실험 전반에 걸쳐 일관된 코호트 크기를 유지하여 이를 최소화해야 합니다.

전통적인 음성 지오택시스(negative geotaxis) 분석은 일반적으로 정해진 시간 간격 내에 미리 정의된 높이에 도달하는 초파리의 비율을 정량화하며, 노화 및 신경퇴행 과정 중의 운동 능력 저하를 평가하는 데 널리 사용됩니다5,6. 이와 대조적으로, 본 반자동 워크플로우는 상향 이동의 능동적 등반 단계를 추출하고, 프레임별 중심점 궤적으로부터 능동적 등반 기울기(pixels/s)를 계산합니다. 중심점 위치는 각 프레임 내에서 검출된 모든 초파리의 평균값으로 계산되므로, 개별 운동 궤적과 초파리 간의 행동적 이질성은 구분되지 않습니다. 이러한 접근 방식은 종점 기반의 수동 점수 산정에 영향을 미치는 놀람 반응 잠복기, 일시적 정지 및 군집 행동으로 인한 기여도를 줄여줍니다. 기존의 종점 기반 점수 산정 방식과 달리, 본 워크플로우는 연속적인 상승 기울기(pixels/s) 측정값을 제공하여 연령 및 유전형에 따른 운동 능력 저하를 정량적으로 비교할 수 있게 합니다. 이와 유사한 계산 추적 방식은 자동화된 운동 정량화 플랫폼을 이용한 Drosophila 행동 분석의 객관성과 일관성을 높이기 위해 점점 더 많이 적용되고 있습니다8,9,10,11,12.

몇 가지 추가적인 제한 사항을 고려해야 합니다. 등반 경사도의 픽셀 기반 측정값(pixels/s)은 실험 전반에 걸쳐 일관된 카메라 보정 및 기록 기하학적 구조에 의존합니다. 카메라 거리나 해상도의 차이는 절대적인 경사도 값에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 내부 대조군을 통한 정규화가 필요할 수 있습니다. 또한, 본 연구에서 제시된 amyloid-β 모델에서는 초기 운동 능력 저하가 생존율 감소와 정성적으로 연관되어 있었으나, 추가적인 유전자형, 중재 또는 약물 치료에 걸친 더 광범위한 검증이 이루어져야 운동 성능과 생존 결과 사이의 관계에 대한 해석을 강화할 수 있을 것입니다. 여기에 제시된 대표 데이터 세트는 질환 상황 전반에 걸친 일반화된 예측 모델을 구축하기보다는, 워크플로우의 구현 및 해석 방법을 보여주기 위한 목적으로 작성되었습니다.

이러한 제한점에도 불구하고, 본 프로토콜은 노화 연구에서 기능적 건강수명 지표와 생존 결과를 연결하는 재현 가능하고 비용 효율적인 프레임워크를 제공합니다. 이 방법은 유전자 조작, 약물 스크리닝 패러다임, 그리고 사망에 앞서 기능적 저하가 나타나는 신경퇴행 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다. 등반 경사도(pixels/s)의 객관적 정량화와 표준화된 생존 분석을 통합함으로써, 이 접근 방식은 Drosophila의 노화 궤적에 대한 포괄적인 표현형 분석을 용이하게 합니다. 추가적인 신경퇴행 유전형, 약리학적 중재 및 종단적 행동 데이터셋을 포함하는 향후 연구를 통해 통합 건강수명 분석을 위한 이 워크플로우의 유용성이 더욱 강화될 수 있을 것입니다13,14.

공개 사항

저자들은 공개할 이해관계가 없습니다.

감사의 글

본 연구는 Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri의 Amrita School of Biotechnology로부터 연구비를 지원받아 수행되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천(Agar)Himedia GRM666응고제
벤조산(Benzoic acid)HimediaGRM488항균 보존제
Canton-SBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #1야생형 참조 균주
등반 튜브(Climbing tube)자체 제작N/A투명 원통형 튜브, 높이 12 cm × 직경 2 cm, 투명 플라스틱 또는 유리
옥수수 가루(Corn flour)현지 공급업체 N/A초파리 먹이 조제용
데스크톱/노트북 컴퓨터제조사 무관사용자 정의최소 듀얼 코어 프로세서, ≥8 GB RAM, Python 3.x 호환 운영 체제
D-글루코스(D-glucose)HimediaMB037초파리 먹이 성분
elav-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC #458범신경 GAL4 드라이버
Matplotlib오픈 소스 라이브러리Version 3.5.2플로팅 및 시각화
NumPy오픈 소스 라이브러리Version 1.26.4수치 계산
OpenCV오픈 소스 라이브러리Version 4.9.0비디오 처리
Pandas오픈 소스 라이브러리Version 2.2.0데이터 핸들링
프로피온산(Propionic acid)HimediaGRM3658항진균 보존제
PythonPython Software Foundation Version 3.12.1분석 환경
Scikit-learn오픈 소스 라이브러리Version 1.4.2선형 회귀 분석
스마트폰 카메라 / 디지털 카메라제조사 무관사용자 정의최소 30 frames/s 녹화, 안정적인 초점, 수직 배치, 최소 1280 × 720 해상도
자당(Sucrose)HimediaGRM601초파리 먹이 성분
UAS-APP.Aβ.E693GBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #33774인간 APP Arctic 변이 모델
효모(Yeast)HimediaRM027영양 보충제

참고문헌

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