신선한 알로에 베라 젤 추출물의 배양 기반 검출 불가성 성장 평가 및 항산화 프로파일링

요약

이 프로토콜은 신선한 알로에 베라 내겔 추출물의 무균 제제, 포텐시오메트릭 pH 측정, 자동 ABTS 기반 비도측정법을 통한 총 항산화 용량 평가, 지정된 인큐베이션 조건에서의 배양 기반 비검출 성장 평가, 그리고 70:30(v/v) 알로에 베라의 예비 항균 스크리닝을 설명합니다.디스크 확산 및 질적 2중관 희석에 의한 N-아세틸-L-시스테인 시험 혼합물.

초록

알로에 베라 (Aloe barbadensis Miller)는 국소 및 보완 의약품에 널리 사용됩니다. 그러나 총 항산화 용량(TAC), pH 거동, 정의된 조건 하에서의 배양 기반 검출 불가 증식 상태, 그리고 예비 항균제 스크리닝을 동시에 평가하는 표준화된 실험실 워크플로우는 제한적입니다. 신선한 내부 젤 알로에 베라 추출물이 무균 상태로 준비되어 5%, 10%, 15%, 20%(w/v)로 조제되었습니다. pH는 가위계법으로 측정되었고, TAC는 자동화된 ABTS 라디컬 양이온 기반 색도 측정법으로 측정되었습니다. 배양 기반 검출 불가-증식 평가를 통해 추출물을 혈액 한천, 에오신 메틸렌 블루 한천, 사부로 덱스트로스 한천에 접종한 후, 24시간, 48시간, 72시간에 호기성 배양 및 육안 검사를 수행하였다. 70:30(v/v) 알로에 베라/N-아세틸-L-시스테인 시험 혼합물에 대한 항균 스크리닝을 디스크 확산 및 정성적 2중관 희석 분석으로 표준 기준 균주에 대해 수행하였다. TAC는 그룹 간 유의미하게 차이를 보였으며(Kruskal-Wallis, p = 0.014), 20% 공식화에서 가장 높은 값이 관찰되었다. 72시간 관찰 기간 동안 시험된 배양 조건에서 눈에 띄는 박테리아나 곰팡이 증식은 관찰되지 않았습니다. 알로에 베라/N-아세틸-L-시스테인 시험 혼합물은 11mm에서 17mm까지 다양한 억제 영역을 생성했으며, 이 중 가장 큰 영역은 Pseudomonas aeruginosa 에 대해 관찰되었습니다. 이 워크플로우는 신선한 알로에 베라를 준비하고 예비적으로 특성화하는 실용적인 실험실 접근법을 제공합니다.초기 단계의 보완의학 연구를 위한 -기반 제형.

서론

알로에 베라는 전통 의학에서의 오랜 사용과 제약, 생의학, 화장품,^{식품 연구에서의} 중요성 확대로 인해 과학적 주목을 계속해서 받고 있습니다. 이 약용 식물은 다당류, 페놀 화합물, 안트라퀴논, 비타민, 미네랄, 효소 및 기타 저분자량 대사산물 등 다양한 생물학적 활성 성분을 포함하고 있어 치료 및 기능적 특성에 기여할 수 있습니다 ^1,2,3. 이들 구성 요소 중 아세트만난은 생체재료 잠재력과 조직 수리, 면역조절, 재생 응용 분야에서 보고된 역할로 인해 강조되어 왔습니다 ^4,5. 이와 동시에 페놀 및 기타 항산화 활성 화합물은 알로에 베라의 자유 라디칼 청소, 보호 및 생물학적 지원 효과와 연관되어 있습니다. 제제 ^2,3.

최근 몇 년간 알로에 베라를 첨단 제형 시스템과 생리활성 재료에 도입하려는 관심이 증가하고 있습니다. 알로에 베라 기반 하이드로겔, 생체재료 잉크, 나노복합재, 3차원 인쇄 스캐폴드는 높은 수분 공급량, 생체 적합성, 다기능적 생물학적 특성 때문에 상처 치유 및 조직 지지 응용 분야에서 연구되어 왔습니다 4,6,8,9,10,11. 실험 연구에 따르면 알로에 베라 함유 재료는 습한 환경을 조성하고, 제형의 물리화학적 특성을 개선하며, 선정된 시험관 내 시험관, 생체 내 및 제형 의존적 조건 ^{4,7,8,9,10,11}에서 항산화 또는 항균 지원을 제공함으로써 상처 관리를 지원할 수 있음이 밝혀졌습니다. 또한 알로에 베라는 식품 보존 및 제형 응용 분야에서도 탐구되어 왔으며, 젤 기반 코팅 및 관련 시스템이 산화 안정성 향상, 감각 품질 개선, 미생물학적 성능 향상과 연관되어 있습니다^12,13. 이러한 발전은 알로에 베라가 전통적인 허브 제품일 뿐만 아니라^{광범위한 제형} 지향적 잠재력을 가진 다기능 천연 재료로 점점 더 인식되고 있음을 시사^합니다.

알로에 베라의 생물학적 중요성은 항균 및 미생물학적 용도에도 확장됩니다. 최근 연구들은 Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, Candida 종 및 상처 감염에서 분리된 임상 분리균 등 임상적으로 중요한 미생물에 대해 알로에 베라 또는 알로에 베라 함유 제제의 억제 효과를 보고했습니다^{14, 15, 16, 17}. 이전 시험관 내 증거는 헬리코박터 파일로리 참조 균주와 임상 분리주에 대한 인너젤 알로에 베라의 활성도 보여주^었다. 더불어, 알로에 베라 함유 하이브리드 시스템은 항균, 항산화, 상처 치유 능력을 결합한 것으로 보고되어 이 식물유래 물질의 다기능성을 더욱 뒷받침합니다¹⁹. 그러나 알로에 베라의 생물학적 성능은 식물 분획, 추출 절차, 농도, 취급 조건, 겔의 신도, 그리고 시험된 제제가 내부 젤만 포함하는지 라텍스 관련 성분을 포함하는지에 따라 여러 방법론적 변수에 의해 영향을 받습니다 ^2,20. 이러한 요인들은 특히 내부 젤과 외부 잎 분획이 조성과 독성학적 프로필 모두에서 다르기 때문에 매우 중요합니다²⁰.

문헌이 늘어나고 있음에도 불구하고 중요한 방법론적 공백은 여전히 존재합니다. 많은 연구에서 항산화 거동, 물리화학적 특성, 미생물학적 평가, 항균 효과가 단일 통합 워크플로우 내에서 평가되지 않고 별도로 평가되는 경우가 많습니다. 그러나 조형 중심 연구에서는 이 매개변수들이 밀접하게 연관되어 있습니다. 제제가 항산화 활성을 보일 수 있지만, 추가 실험 개발에 적합하다고 판단되기 전에 신중한 미생물학적 평가와 물리화학적 특성 분석이 필요합니다. 따라서 산화환원 관련 평가, pH 평가, 정의된 조건 하에서의 배양 기반 검출 불가성 증식 검사, 그리고 예비 항균제 스크리닝을 결합한 실험실 워크플로우는 신선한 알로에 베라 제형의 초기 단계 특성 분석에 보다 실용적이고 유익한 기반을 제공할 수 있습니다.

따라서 본 연구는 pH 특성, 총 항산화 용량, 정의된 실험실 조건에서의 배양 기반 검출 불가능 성장 상태, 디스크 확산 및 정성적 2중관 희석을 통한 예비 항균 스크리닝 측면에서 다양한 농도로 조제된 신선한 인너 젤 알로에 베라 추출물 제형을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이 평가들을 단일 실험 워크플로우 내에 통합함으로써, 이 연구는 알로에 베라의 예비 특성 분석을 위한 실질적인 기초 접근법을 제공하도록 설계되었습니다.-보완의학 연구를 위한 기반 제형입니다.

프로토콜

1. 알로에 베라 추출물 및 희석 시리즈 제제

1. 상온에서 키운 알로에 베라 식물의 성숙한 잎을 수확한 뒤, 흐르는 물로 깨끗이 씻어 잔여물을 제거하세요.
2. 생물안전 레벨 2(BSL-2) 캐비닛 안에서 멸균 장갑을 착용해 70% 에탄올로 잎 표면을 소독하세요. 70% 에탄올을 발포한 후, 잎 표면을 최소 2분 이상 완전히 자연 건조시키고 무균 절개를 진행하세요.
3. 멸균 메스를 사용해 잎의 원위 끝과 가장자리를 제거하고, 노란 라텍스 분출물이 약 30분간 완전히 배수되도록 한 후 잎을 세로 필렛으로 만듭니다. 투명한 내부 젤만 조심스럽게 분리하고 수집하며, 겉면과 잔여 라텍스 층은 피하세요.
4. 알로에 베라 내부 젤을 조심스럽게 멸균 용기에 옮기고, 약 2,500rpm (또는 동등한 중고소용돌이 설정)에서 간헐적 소용돌이로 약 5-10분간 균질화합니다; 특정 기기에 온도 조절이 필요하지 않은 한 상온에서 시행합니다.
5. 무균 조건 하에서 신선한 알로에 베라 를 준비하세요. 멸균 증류수를 사용해 5%, 10%, 15%, 20%의 인너젤 추출물 제형을 준비합니다; 예를 들어, 5% (W/V)를 5g 젤로 만들어 최종 부피 100 mL로 만들고, 남은 농도도 유사하게 조절합니다.

2. pH 측정

1. 각 측정 시리즈 전에 NIST 추적성과 함께 표준 pH 4.01, 7.00, 10.01 버퍼 용액을 사용하여 3점 pH 측정기 보정을 수행합니다.
2. 상온(20–25 °C)에서 각 농도별 pH를 측정합니다; 농도별로 최소 세 번의 기술적 복제를 기록하세요.

3. 총 항산화 용량(TAC) 측정

1. TAC 측정은 1단계에서 준비된 알로에 베라 추출물 제형(5%, 10%, 15%, 20%)을 사용하세요.
2. 분석 전에 모든 시약과 샘플을 실온(20–25 °C)으로 옮겨 분석 일관성을 확보하세요.
3. 분석 시작 전에 제조사의 표준 운영 절차에 따라 자동 생화학 분석기(Rel Assay, 터키)를 보정하세요.
4. Erel 방법을 기반으로 한 총 항산화 용량(TAC) 시약을 분석기 시약 구획에 적재합니다.
5. 알로에 베라를 피펫으로 추출하세요. 보정된 마이크로피펫을 사용해 적절한 샘플 컵이나 반응 웰에 샘플을 추출합니다. (샘플 부피: 5 μL)
6. 제조사가 지정한 시약 부피와 배양 설정을 따라, 분석기 프로그래밍된 ABTS 라디칼 양이온 기반 프로토콜을 사용하여 TAC 분석법을 실행하세요.
7. 반응이 자동으로 진행되도록 두면, 샘플 내 항산화제가 색깔 있는 ABTS 라디칼 양이온을 감소시켜 흡수율이 감소합니다.
8. TAC 방법으로 정의된 파장에서 흡광도광도의 변화를 측정합니다. (파장: 660 nm)
9. 분석기 소프트웨어를 사용해 샘플 흡수도 변화를 Trolox 등가 보정 곡선과 비교하여 총 항산화 용량 값을 계산합니다.
10. TAC 결과를 추출물 단위 부피당 mmol Trolox 상당량 / L로 표현합니다.
11. 분석 신뢰성을 보장하기 위해 모든 측정을 두 번에 수행하세요.

4. 알로에 베라 의 배양 기반 무검출 성장 평가. 내부 젤

1. 각 추출물의 각 10 μL을 혈액 한천, 에오신 메틸렌 블루 한천, 사부로 덱스트로스 한천에 보정된 루프(10 μL)(군집 계수법)를 사용하여 접종합니다.
2. 배양 기반 검출 불가능 성장 평가를 위해, 보정된 마이크로피펫을 사용해 표준 50 μL 알리코트를 혈액 한천, 에오신 메틸렌 블루 아가, 사부로드 덱스트로스 한천 플레이트에 무방하게 분사하고, 멸균 일회용 루프(10 μL)로 부드럽게 발라(직접 점적 방법을 이용한 배양 기반 생식 평가)합니다.
3. 혈액 한천과 에오신 메틸렌 블루 한천 판을 37 °C에서 유기적으로 배양하고, Sabouraud 덱스트로스 한천 판을 25–28 °C에서 유기적으로 배양한 후, 24, 48, 72시간에 육안으로 배양 여부를 검사합니다. 각 배지별로 접종되지 않은 접종판 1개를 병행하여 음성 대조군으로 배양하세요.

5. 알로에 베라 검사 혼합물의 항균 활성 평가

1. 멸균 조건에서 멸균된 알로에 베라 인너겔 추출물과 30% N-아세틸-L-시스테인 용액(멸균수 내 10% w/v 용액)을 혼합하여 균질한 시험액을 준비합니다.
   참고: 이 혼합물은 잎에서 긁어낸 젤의 높은 점도를 줄이고 더 유동적인 농도를 제공합니다. 이 복합 조제법을 예비 선별 혼합물로 간주하세요. 따라서 항생제 결과를 두 성분의 복합 활성으로 해석하십시오.
2. 균질화된 혼합물을 완전히 소용돌이로 하여 균일한 용액을 얻습니다.
3. 이전에 냉동 보존된 표준 박테리아 군통인 Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, 대장균의 하위 배양 . ATCC 25922는 -80 °C에서 표준 혈액 한천(그람 양성 박테리아용)과 표준 에오신 메틸렌 블루 한천(그람 음성 박테리아용)에 보관하고, 37°C에서 18-24시간 배양합니다.
4. 인큐베이션 종료 시, 표준 접종 준비 권고에 따라 배양된 군락에서 추출한 멸균 식염수를 사용하여 0.5 맥팔랜드 탁도로 조절한 박테리아 현탁액을 준비합니다. 항생제 감수성 시험³⁸.
5. Mueller-Hinton 한천 플레이트에 멸균 면봉을 사용해 표준화된 박테리아 현탁액을 균일하게 접종합니다.
6. 보정된 마이크로피펫을 사용해 각 멸균 6mm 항균 디스크에 15 μL 무균 알로에 베라/NAC 테스트 혼합물을 표준화하여 도포합니다. 절차적 일관성을 보장하기 위해 복제 전 모든 디스크에 동일한 적재량, 흡수 시간(최소 2분), 공기 건조 시간(약 5분)이 적용되었습니다. 이 부피는 식물 추출물 기반 디스크 확산 스크리닝에서 6mm 디스크의 실용적인 하중 용량으로 선택되었으며, 모든 실험에서 일정하게 유지되었습니다.
7. 추출물이 함침된 디스크를 멸균 겸자를 사용해 접종된 한천 플레이트 표면에 놓습니다.
8. 판을 37°C에서 18–24시간 동안 호기성 조건에서 배양하세요.
9. 배양 후에는 자로 각 억제 영역의 직경(디스크 직경을 포함)을 가장 가까운 밀리미터 단위로 수동으로 측정합니다. 실험을 단일 기술적 측정으로 수행하며, 기록된 구역 직경을 개별 관측값으로 보고합니다. 표준 디스크 확산 판독 권고사항에 따라 판을 육안으로 검사하여 측정을 수행하세요.³⁸.
10. 70:30(v/v) 알로에 베라/NAC 테스트 혼합물을 뮬러-힌턴 육수에 두 배 연속 희석(1/2, 1/4, 1/8, 1/16)을 준비합니다.
11. 각 튜브에 멸균 식염수로 준비한 0.5 맥팔랜드 표준화 박테리아 현탁액 500 μL 을 접종합니다. 각 기준 균주별로 별도의 희석 시련을 준비하고, 아래에 명시된 조건에 따라 접종관을 배양하세요.
12. 접종관을 37°C에서 18–24시간 배양하세요.
13. 육수 대조군에 비해 탁도를 통해 미생물 성장을 육안으로 평가합니다; 이 분석을 공식적인 MIC 결정보다는 질적으로 해석합니다.
14. 알로에 베라/NAC 함유 디스크와 병행하여 시프로플록사신 디스크(5 μg)를 양성 대조군으로 사용하세요. Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922에 동일한 양성 대조 디스크를 적용하여 디스크 확산 조건에서의 감수성을 확인하라.
    참고: 모든 미생물학적 절차를 BSL-2 조건 하에서 수행하고, 배양 직후 모든 구역 직경 및 탁도 관찰 결과를 기록하여 후속 기술적 분석을 수행하십시오. 이 프로토콜은 A. vera의 무균 제제를 결합한 것입니다.국소 및 보완 의학용 식물성 제형 개발을 지원하기 위해 보완적인 생화학 및 미생물학적 분석법을 이용한 추출물. 이 워크플로우는 일상적인 실험실에 실용적으로 설계되었으며, pH 및 산화환원 스크리닝(TAC)을 멸균 배양과 두 가지 일반적으로 사용되는 항균 분석법(디스크 확산 및 튜브 희석)과 함께 수행할 수 있습니다.

결과

알로에 베라. 추출물의 다양한 농도에서의 pH 값

pH 프로필은 농도별로 비단조적 패턴을 보였다. 평균 pH 값은 5%, 10%, 15%, 20% 각각 6.47, 6.60, 6.26, 6.28이었습니다. 전체 그룹 차이는 유의미했습니다(p = 0.024). 5% 및 10% 제형은 상대적으로 높은 pH값을 보였고, 15% 및 20% 제형은 낮은 pH값(p < 0.05)에 집중되었습니다(표 1 및 표 2).

총 항산화 용량(TAC)

총 항산화 용량(TAC)은 네 가지 A. vera 추출물 농도에서 유의미하게 차이가 있었습니다. Kruskal-Wallis 분석 결과, 그룹 간...

토론

본 연구는 pH 측정, 총 항산화 용량(TAC) 분석, 배양 기반 검출 불가능 증식 평가, 기술적 항생제 선별을 결합하여 신선한 내부 젤 알로에 베라 추출물 제형의 예비 특성 분석을 위한 통합 실험실 워크플로우를 제공합니다. 신선한 내부 젤 알로에 베라 의 농도가 증가할수록 TAC 수치가 높아졌으며, 정의된 실험실 조건 하에서 단기 배양 모니터링 중에는 눈에 띄는 박테리아나 곰팡이 증식이 관찰되지 않았습니다. 이러한 발견은 검증된 불임성, 장기 미생물학적 안정성 또는 임상적 적합성의 증거가 아니라, 검사 조건에서 측정 가능한 항산화 활성과 배양 기반 검출 불가능한 성장의 증거로 해석되어야 합니다.

항산화 결과는 알로에 베라 젤이 페놀 화합물, 다당류 및 기타 산화환원 활성 성분을 포함한 항산화 활성 성분의 천연 공급원으로 설명된 이전 보고서와 일치합니다 21,23,27.<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(-)80 C 냉동고	Thermofisher/USA	시료 저장	TSX40086A
보르텍스	Thermofisher/USA	시료 준비	88882010
블러드 아가	RTA/터키	배양 접종	2001
에오신 메틸렌 블루 아가	RTA/터키	배양 접종	2010
SDA 아가	RTA/터키	배양 접종	2036
뮐러 힌턴 아가	RTA/터키	배양 접종	2022
뮐러 힌턴 브로스	RTA/터키	배양 희석	1018
피펫	Thermofisher/USA	시료 준비	4642090N
하나 pH 미터	히타치/일본	시료 분석	HI2211-02
렐 분석 플레이트 리더	렐 분석(터키)	시료 TAC 분석	M201 (스마트 모델)
TAC 키트	렐 분석(터키)	키트	RL0017