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방법 논문

종단 간 문합 기법을 이용한 경추 이종성 마우스 심장 이식 이식 면역학 연구

211 조회수

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DOI:

10.3791/70704

⸱

2026년 7월 3일

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education; NHC Key Laboratory of Organ Transplantation; Key Laboratory of Organ Transplantation, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Division of Hepato-Pancreato-Biliary Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, 4Department of Clinical Medicine, Bengbu Medical College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마우스 자궁경부 심장 이식을 위한 단순화된 끝 투 측면 봉합 문합 기법을 제시하여, 이식 면역학 연구를 위한 견고하고 재현 가능한 모델을 제공합니다.

초록

마우스 이종소성 심장 이식은 이식 연구에서 중요한 전임상 모델입니다. 마우스 경추 이종소성 심장 이식은 이식편 생존성에 대한 직접적이고 촉각적인 모니터링, 수술 외상 감소, 수술 후 회복 속도 등 뚜렷한 장점을 제공합니다. 따라서 이식 면역학 연구의 점점 더 가치 있는 플랫폼이 되었으며, 특히 유전자 변형이나 약물 유도로 인해 생리적 조건이 좋지 않은 동물에게 더욱 유용하며, 2차 또는 복합 장기 이식이 필요한 실험에서는 자궁경부 부위가 유일한 실행 가능한 부위가 되는 경우가 많습니다. 종단 간 봉합 또는 커프 기반 방법을 사용하는 기존 자궁경부 이식 기법은 수혜자의 총경동맥과 외경정맥을 영구적으로 결찰해야 하며, 이는 뇌 관류를 저해하고 이물질이나 혈역학적 장애를 유발할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 본 논문은 종단 대 옆 혈관 문합을 이용한 정교한 경추 심장 이식 기법을 상세히 소개합니다. 이 방법은 수혜자의 총경동맥과 외경정맥을 보존하여 정상적인 뇌관류를 유지하고 영구 혈관 결찰과 관련된 합병증을 피합니다. 이 프로토콜은 기증자 심장 채취부터 수혜자 문합, 수술 후 관리까지의 단계를 상세히 설명합니다. 대표적인 결과는 높은 수술적 성공률(96.7%)과 동종 이식 거부 반응 연구에서의 효과성을 보여줍니다. 이 기법은 이식 면역학 연구자들에게 생리학적으로 관련성이 높고 기술적으로 접근 가능한 모델을 제공합니다.

서론

지난 반세기 동안 이식 면역학은 면역학자와 이식 전문가들의 중심 연구 주제로 계속 자리 잡았습니다. 오늘날 고형 장기 이식은 널리 시행되고 있으며, 말기 장기 질환에 가장 효과적인 치료법입니다. 그러나 이식편 거부 반응은 근본적으로 해결되지 않았으며, 여전히 이식의 주요 장애물 중 하나이자 이식편 손실의 주요 원인 중 하나입니다. 따라서 전신 면역억제를 줄이거나 피하면서 거부 반응을 극복하거나 완화하는 것은 여전히 중요한 도전이자 연구 목표입니다.

혈관화된 동물 장기 이식 모델, 특히 마우스 모델은 이식 면역학 발전에 중요한 역할을 했으며 임상 번역에 필수적인 과학적 토대를 제공해 왔습니다2. 예를 들어, 오늘날 임상적으로 사용되는 많은 면역억제제들—사이클로스포린, 타크롤리무스, 라파마이신—은 마우스 이식 모델에서 처음으로 성공적으로 검증되었습니다 3,4.

마우스 이종 소성 심장 이식(HT) 모델은 가장 널리 사용되는 전임상 모델 중 하나로, 풍부한 유전적 균주와 연구 시약, 비교적 간단한 절차와 수술 후 모니터링이 용이하기 때문에 선호됩니다. 따라서 급성 거부 반응 기전 연구, 면역 내성 유도, 생체 내 새로운 면역억제제 평가를 위한 핵심 플랫폼 5,6.

최초의 쥐 이종 이염성 HT 모델은 1973년 Corry 등에 의해 확립되었습니다. 이 모델에서는 기증 심장을 수혜자의 복강에 위치시키고, 이식 대동맥과 폐동맥(PA)이 각각 수혜자의 복부 대동맥과 하대정맥(IVC)과 끝 맞닿아 문합됩니다. 이 방법은 수십 년간 복부 HT의 표준 기법으로 남았습니다. 내성 연구에서 제3자 동종이식편을 수용할 필요성에 따라 HT의 두 번째 부지가 탐색되었습니다. 이로 인해 마우스에서 자궁경부 HT 모델이 개발되었으며, 이식편 생존 가능성의 직접 시각적 평가, 수술 외상 감소, 수술 후 감염 위험 감소 등 다른 장점을 제공합니다 5,8,9. 1991년 Chen 등은 쥐를 대상으로 경추 이종성 이형성 HT 모델을 처음으로 기술했으며, 이는 기증자 대동맥과 PA를 수혜자의 총경동맥(CCA)과 외경정맥(EJV)에 종단 수확 봉합하는 방식이었습니다. 그러나 기증자 대동맥과 수혜자 CCA 간의 심각한 불일치로 인해 혈관 문합이 매우 어려워 이 모델이 널리 채택되지 못했습니다.

또한 1991년, Matsuura 등은 경추 HT 모델에서 혈관 문합을 위한 비봉합 커프 기법을 도입했습니다. 이 방법은 기술적으로 까다로운 수작업 혈관 봉합을 없애 절차를 간소화하여 숙달하기 쉽게 만듭니다. 이후 커프 기술에 대한 수많은 기술적 개선이 보고되었습니다10,11. 현재 커프 방법은 특히 미세혈관 봉합 경험이 없는 연구자들 사이에서 자궁경부 고발 치료에 널리 사용되고 있습니다. 그러나 커프 기법은 인공 재료를 도입하여 국소 염증을 유발하고 면역 평가에 방해를 줄 수 있으며, 소구경 혈관에서도 기술적 도전 과제를 제기합니다 5,6. 최근 Liao 등은 경부 HT에서 기증자와 수혜자 혈관을 슬리브 방식으로 직접 문합하는 커프프리 슬리브 기법을 제안했습니다. 인공 재료를 피하고 작은 혈관을 수용함으로써 이 접근법은 2차 심장 이식을 위한 생리학적이고 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다.

그럼에도 불구하고, 종단 간 봉합 및 비봉합 커프 기법 모두 수혜자의 일측 CCA와 EJV의 영구적 결속이 필요합니다. 이로 인해 중추신경계에 대한 일측성 뇌혈 공급이 저해되어 방향성 장애 및 편마비와 같은 신경학적 합병증을 초래할 수 있습니다.13, 14, 15. 더불어, 이러한 종단 간 접근법은 고속 동맥 제트와 같은 혈역학 변화를 초래할 수 있으며, 혈전증과 협착증의 위험을 높여 장기적인 이식편 생존에 해롭습니다. 더불어, 커프 기법은 커프의 존재로 인해 혈전증 위험도 내포하고 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 기증자의 상행 대동맥과 PA를 각각 수혜자의 CCA와 EJV에 맞대는 정교한 끝 투 측면 수동 봉합 기법을 채택했습니다. 이 방법은 수혜자의 주요 경추 혈관의 완전성과 연속성을 유지하여 정상적인 뇌관류를 유지하고 동물 연구의 3Rs(대체, 감소, 정제) 원칙을 준수합니다. 이 기법을 사용하여 약 96.7%의 수술 성공률(29/30, 출혈로 인한 사망은 단 1명)을 달성했습니다. 수술 후 수혜자 쥐에서는 뇌허혈 관련 합병증이 관찰되지 않았습니다. 이 방법은 표준 복부 모델과 매우 유사하며, 혈관 봉합 경험이 있는 외과의가 경추 HT 모델을 설정하는 데 특히 적합합니다.

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프로토콜

동물 관리는 국제 지침을 준수했으며, 모든 시술은 중국 화중과학기술대학교 통지 병원 장기 이식 연구소, 통지 의과대학에서 진행되었습니다. 이 연구는 동지 병원 동물윤리위원회(승인 번호: TJH-202310010)로부터 윤리 승인을 받았습니다. 연구에 사용되는 적절한 기기는 재료표에 나와 있습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 수술실을 자외선 램프로 30분간 소독하세요. 수술대를 70% 에탄올로 소독하고 모든 수술 기구를 121 °C에서 20분간 오토클레이브하세요.
  2. 성체 수컷 C57BL/6과 BALB/c 마우스(몸무게 20–25g; 8–10주 대)를 사용하세요. 동생이식의 경우, C57BL/6 마우스를 기증자이자 수혜자로 모두 사용합니다. 동종 이식의 경우, BALB/c 마우스를 기증자로, C57BL/6 마우스를 수혜자로 사용하세요.
  3. 수술 1시간 전에 수혜자에게 부프레노르핀(0.05 mg/kg) 피하 주사를 통해 수술 전 진통을 투여합니다.
    참고: 기증자 마우스에게는 수술 전 진통이 시행되지 않으며, 기증자는 심장 채취 시술 직후 안락사됩니다.
  4. 케타민(20 mg/mL)과 자일라진(2 mg/mL)이 포함된 마취액을 준비합니다. 복막 내 주사를 통해 5 μL/g의 용량으로 준비된 케타민 마취제를 투여합니다. 느리고 규칙적인 호흡, 올바른 반사 상실, 발달 반사의 부재를 관찰하여 마취 효과를 확인하세요.
  5. 흉부와 복부 털을 면도하세요. 체온을 유지하기 위해 쥐를 엎드린 채 온찜질 패드 위에 고정하세요. 수술 부위를 포비돈-요오드와 70% 에탄올을 번갈아 3회 소독합니다. 6-0 실크 실로 윗 앞니를 위로 당겨 목을 연장하여 노출을 최적화하세요.
  6. 멸균된 수술용 장갑을 착용하세요. 멸균된 커튼에 절개 부위보다 약간 더 큰 타원형 입구를 만드세요. 그 다음에는 받는 마우스를 가리기 위해 사용하세요.

2. 기증자 심장 수확

  1. 복부 중앙 절개를 한 뒤 횡(십자형) 절개를 하여 복강을 완전히 노출시킵니다.
  2. 생리식염수에 적신 멸균 면봉으로 소장을 부드럽게 왼쪽으로 당겨 복대동맥과 대동맥을 노출시킵니다.
  3. IVC에 0.3mL의 헤파린화된 생리식염수(300 IU/mL)를 주입하고 전신 간파린화가 1분 기다립니다. 복부 대동맥과 정맥을 절단하여 기증자를 출혈시키세요.
  4. 횡격막과 가슴 앞부분을 함께 절개하여 가위를 사용해 갈비뼈를 관통하는 U자형 절개를 하여 흉강을 노출시킵니다.
  5. 흉부 내 IVC를 통해 심장에 2mL의 냉식식염수(4 °C)를 주입하여 잔여 혈액을 씻어내세요.
    참고: 이 단계의 주요 목적은 저체온증을 유도하고 심장이 빠르게 뛰는 것을 멈추게 하는 것입니다. 두 번째 목적은 특히 관상동맥에서 혈액을 철저히 배출하는 것입니다.
  6. 심장을 냉염수(4°C)에 적신 멸균 거즈로 덮으세요. 이 거즈를 부드럽게 아래로 견인하면 대동맥과 PA의 최적의 노출이 가능합니다. 더불어, 차가운 식염수에 적신 거즈는 이후 해리 시 이식편의 저체온증을 유지하는 역할을 합니다.
  7. 흉부 내 IVC를 확인하고 분리하세요. 6-0 실크 봉합사로 결찰하고, 결찰 부위 원위부는 현미 가위로 횡단합니다.
  8. 흉선을 확인하고 제거하여 대동맥궁과 PA를 노출시키세요. 상정맥을 확인하고 분리하세요. 6-0 실크 봉합사로 결사하세요. 결찰 부위에서 떨어진 부분을 횡단하세요.
  9. 상행 대동맥을 확인하고 격리하세요. 혈관 길이를 극대화하기 위해 무명동맥 근위부의 대동맥을 횡단하세요.
  10. PA를 식별하고 격리하세요. 분기점 바로 근처에서 횡단하세요. 심장 뒤쪽(폐정맥)에 있는 모든 혈관을 6-0 실크로 결찰하세요. 미세가위로 심장을 조심스럽게 절제하세요.
  11. 심장을 부드럽게 옮기고, 얼음 위에 올려둔 차가운 식염수(4°C)에 담가 이식 전까지 보관합니다.

3. 수혜자 운영

  1. 수혜자 혈관 격리
    1. 오른쪽 쇄골 중간점의 상부 경계에서 하악골 아래쪽 경계까지 1cm 길이의 세로 절개를 합니다.
    2. 턱하선의 오른쪽 엽을 절제하세요. 기증자 심장 이식에 충분한 주머니를 만들기 위해 오른쪽 흉쇄유돌근을 절단합니다.
    3. 오른쪽 EJV와 올바른 CCA를 식별하고 분리하세요. EJV의 지휘를 지져서 동원하라. 그 후 CCA를 주변 조직에서 분리합니다. CCA를 해부할 때 동반되는 미주신경을 손상시키지 않도록 주의하세요.
  2. 동맥 문합
    1. 두 개의 미세혈관 클램프를 사용해 동시에 EJV와 CCA를 막으며, 한 클램프는 양측 혈관의 두개골 끝에, 다른 한 클램프는 꼬리쪽 끝에 부착합니다. 먼저 두개골 클램프를 착용하고, 그 다음 꼬리 클램프를 착용합니다.
      참고: 미세혈관 클램프는 마우스 오른쪽에서 왼쪽으로 삽입하는 것이 바람직하며, 클램프 손잡이는 오른쪽에 위치시킵니다. 이 방향은 이후 혈관 문합을 용이하게 하고 기관의 압박을 줄이는 데 도움을 줍니다.
    2. 마우스를 시계 방향으로 90° 회전시키세요. CCA에 세로 절개를 하여 길이가 기증자 상행 대동맥의 직경과 일치하는지 확인하세요. 잔여된 혈전을 완전히 제거하기 위해 내강을 헤파린화된 식염수로 세척하세요.
    3. 문합 창을 만들기 위해 11-0 봉합사를 사용하세요. 바늘을 기증 혈관 직경과 거의 같은 거리로 혈관 벽을 통과시키고, 봉합사로 혈관 벽을 부드럽게 들어 올린 후 미세 가위로 소량을 절제합니다.
    4. 기증 심장을 자궁경부 주머니에 넣으세요. 기증자 상행 대동맥을 수혜자 CCA에 고정시키기 위해 근위와 원위 끝에 바늘이 달린 11-0 봉합사 두 개를 삽입합니다. 기증자 심장을 수혜자의 오른쪽에 위치시키고 젖은 멸균 거즈로 덮으세요.
    5. 원위 봉합선을 사용해 후벽에 원위에서 근위 방향으로 6–8코를 연속적으로 봉합합니다.
    6. 후벽 봉합이 끝난 후에는 마우스를 180° 회전시킵니다. 기증자 심장을 수혜자의 왼쪽 쪽으로 반사시키고 젖은 멸균 거즈로 덮으세요. 문합을 마무리하여 앞쪽 혈관벽을 근위에서 원위 방향으로 6–8코 봉합합니다. 마지막 매듭을 묶기 전에 루멘을 식염수로 세척해 기포를 제거하세요.
  3. 정맥 문합
    1. EJV에 기증자 PA의 직경과 일치하는 세로 절개를 하세요. 잔여된 혈전을 완전히 제거하기 위해 내강을 헤파린화된 식염수로 세척하세요.
    2. 기증자 PA를 수혜자 EJV에 고정시키기 위해 근위와 원위 끝에 바늘이 꽂힌 11-0 봉합사 두 개를 삽입합니다.
    3. 근위 봉합선을 사용해 후벽을 근위에서 원위 방향으로 5–7코로 지속적으로 봉합합니다.
    4. 같은 봉합사로 앞벽을 바깥쪽에서 원위에서 근위까지 5–7코로 봉합합니다. 근위 꼭대기에서 봉합하세요. 마지막 매듭을 묶기 전에 루멘을 식염수로 세척해 기포를 제거하세요.
  4. 재관류
    1. 먼저 원위 클램프를 해제한 뒤, 근위 클램프를 해제하여 재관류를 시작하세요. 재수혈 시 심장 이식은 즉시 붉게 변해야 합니다. 정상적인 리듬과 수축은 보통 1–2분 이내에 회복됩니다.
    2. 지혈이 확인되면, 심장 이식편을 피하 주머니 내에 조심스럽게 위치시켜 혈관이 뒤틀리지 않도록 하세요. 피부 절개부는 5-0 봉합사로 봉합하세요.
  5. 수술 후 관리
    1. 쥐를 깨끗한 우리에 넣고 34°C로 설정된 유아 인큐베이터에 넣어 회복을 돕습니다. 쥐가 자발적으로 깨어날 때까지 1-2시간마다 관찰한 후 다시 우리로 돌려보내세요.
      참고: 저체온증으로 인한 호흡 억제를 예방하고 마취 회복을 촉진하기 위해 재가열이 필요합니다.
    2. 수술 후 첫 48시간 동안 12시간마다 부프레노르핀(0.05 mg/kg)을 피하 주사로 진통을 투여합니다.
    3. 심장 이식편의 맥박을 매일 모니터링하고 이식편 생존 상태를 기록하세요.

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결과

이 수정된 모델을 사용해 30건의 사례가 수행되었으며; 수술 성공률은 96.7%(29/30)였습니다. 수술 중 출혈로 인한 사망자는 단 한 건뿐이었습니다. 나머지 29건은 수술 시간과 이식편 결과 분석을 위해 포함되었습니다. 수술 후 수혜자에게서 뇌 허혈 관련 합병증은 관찰되지 않았습니다. 기증자 심장 채취는 6.4분 ± 0.7분, 수혜자 수술은 28.7분 ± 1.2분에 완료되었습니다. 구체적으로, 혈관 준비, 동맥 문합, 정맥 문합은 각각 6.1 ± 1.4분, 8.4 ± 1.2분, 6.1 ± 1.0분 만에 완료되었습니다(그림 1).

29건의 성공적인 이식 중 16건은 동유(C57BL/6에서 C57BL/6), 13건은 동종(BALB/c에서 C57BL/6)이었습니다. 생존 분석을 위해 10명의 동유 수혜자와 10명의 동종 수혜자를 심장 이식편의 맥박을 관찰하여 매일 모...

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토론

종단-측면 문합 기법을 사용하는 경추 HT 모델은 여러 가지 장점을 제공합니다. 종단 간 봉합법이나 커프법과 비교할 때, 이 방법은 CCA와 EJV의 연속성을 완전히 유지하여 정상적인 뇌 혈역학을 유지하고 뇌 허혈 관련 합병증을 효과적으로 방지합니다. 끝과 좌우 문합은 기증자와 수혜자 혈관 직경 불일치로 인한 기술적 어려움도 피합니다. 복부 HT와 비교할 때, 이 방법은 쥐에게 적은 외상을 주고 수술 후 회복을 더 빠르게 합니다. 따라서 이 모델은 유전자 변형이나 약물 유도로 인해 생리적 조건이 좋지 않은 실험 동물에 특히 적합합니다. 더불어, 2차 HT 또는 복합 장기 이식이 필요한 실험에서는 자궁경부 부위만이 유일한 실질적인 부위가 됩니다.

복부 HT와 기술적으로 유사함에도 불구하고, 경추 종결과 좌우 문합은 특정한 도전 과제에 직면해 있습니다. 복부 이식에서는 수술 영역이 넓으며, 복부 대동맥과 하대정맥이 가까이 ...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(81700571)의 지원을 받았습니다.

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1mL 주사기Becton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309628
바늘이 있는 11-0 봉합사Jinhuan Medical Products Co., Ltd.H1101혈관 문합용
3mL 주사기Becton Dickinson Medical Devices Co., LtdB309657
바늘이 있는 5-0 봉합사Jinhuan Medical Products Co., Ltd.CR537피부 봉합용
6-0 실크 봉합사Jinhuan Medical Products Co., Ltd.2650182
혈액 정지 소작기Ningbo Shunye Medical Co., Ltd.BDD-YE-DT-1
부프레노르핀Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., LtdH12020275진통제
면봉Fuqing Health & Integral Medical20230R
곡선형 마이크로 힘질RWD life Science Co.F11031-11수술 도구
곡선형 마이크로 가위66 Vision Tech Co., Ltd.54108B수술 도구
거즈 면봉Yubei Medical Materials Co., LTD21080274
헤파린 나트륨 주사North China Pharmaceutical Co., LTD2101131-2
마이크로 바늘 홀더World Precision Instruments Co., Ltd.555408NT수술 도구
마이크로 혈관 클립Roboz Surgical Instrument CoRS-5481T
마이크로 혈관 클립 어플리케이터Roboz Surgical Instrument CoRS-5480
바늘 홀더RWD life Science Co.F31025-13복부 봉합
식염수Zhejiang Tianrui Pharmaceutical Co.,Ltd716092103
직선형 마이크로 힘질RWD life Science Co.F11029-11수술 도구
수술 현미경LeicaM650
수술 플랫폼맞춤형, 자기
조직 힘질RWD life Science Co.F12002-12수술 도구
조직 가위RWD life Science Co.S12003-09수술 도구
```

참고문헌

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  20. Gu, X., et al. Improved cuff technique for cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. , (2007).
  21. Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. J Vis Exp. , (2014).
  22. Li, Y., et al. A highly reproducible cervical cuff technique for rat-to-mouse heterotopic heart xenotransplantation. Xenotransplantation. , (2017).
  23. Ma, Y., Wang, G. Comparison of 2 heterotopic heart transplant techniques in rats: cervical and abdominal heart. Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. , (2011).

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