다섯 가지 향료 소포라 플라베스켄 스, 장성 코팅 캡슐은 실험적 대장염과 철압증 관련 변화를 완화합니다

요약

궤양성 대장염 마우스 모델에서 5가지 맛 Sophora flavescens 는 장내 코팅 캡슐을 완화하고 산화 스트레스, 염증성 사이토카인 불균형, JAK2/STAT3 신호 전달, 그리고 철학 관련 표지자의 변화를 개선했습니다.

초록

궤양성 대장염은 효과적이고 표적화된 치료 옵션이 제한적이기 때문에 관리가 여전히 어렵고, 산화 스트레스, 염증성 신호, 조절된 세포사멸 경로가 점막 손상에 기여할 수 있습니다. 이 연구는 5가지 향 Sophora flavescens 장내 코팅 캡슐(FSEC)이 실험적 대장염을 완화하는지 평가하고, 산화 스트레스, 염증, 페로토시스의 관련 변화를 탐구했습니다. 궤양성 대장염의 마우스 모델이 2.5% 덱스트란 황산염 나트륨에 주기적으로 노출되고 종양 괴사 인자 알파 챌린지를 결합하여 구축하였습니다. 쥐들은 저용량, 중용량, 고용량 FSEC 또는 양성 대조군 중재로 TLR4 길항제 CRX-526을 투여하였습니다. 대장 조직병리학은 헤마톡실린과 에오신 염색으로 평가하였다. 생화학적 분석법을 통해 혈청 슈퍼옥사이드 디무타아제, 카탈라제, 글루타티온, 미엘로퍼옥시다아제, Fe²⁺ 수치를 측정하였다. 대장 조직 사이토카인은 효소 결합 면역흡착 분석법으로 정량되었고, JAK2와 STAT3 발현은 면역조직화학으로 평가되었으며, GPX4, FTH1, ACSL4 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석되었습니다. FSEC 치료는 대장 점막 손상과 염증성 세포 침윤을 감소시키고, 항산화 지수를 높이며, 미엘로퍼옥시다제 수치를 감소시켰습니다. FSEC는 또한 TNF-α 및 IL-1α 수치를 감소시키고, IL-13 수치를 부분적으로 회복시켰으며, JAK2와 STAT3 면역염색 약화와 연관되어 있었습니다. 동시에 FSEC는 Fe2^{⁺ 및} ACSL4 수치 감소, GPX4 및 FTH1 발현 증가 등 철세포증 관련 마커 변화를 개선하였습니다. 이 결과는 FSEC가 적어도 부분적으로 산화 스트레스 상태 개선, 염증성 신호 조절, 철학 관련 표지 프로필 복원을 통해 쥐의 실험적 궤양성 대장염을 완화함을 시사합니다.

서론

궤양성 대장염(UC)은 주로 대장 및 직장 점막에 영향을 미치는 만성 염증성 질환으로, 점막 염증, 궤양, 장벽 기능 저하가 반복적으로 나타나는 것이 특징입니다 ^1,2,3. 유전적 감수성, 환경 요인, 상피 장벽 기능 장애, 면역 조절 장애가 UC 발병 기전과 관련이 있다고 밝혀졌으나, 지속성 점막 손상의 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 현재 시행 중인 약물 치료, 예를 들어 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역억제제, 생물학적 제제는 많은 환자에서 질병 활동을 줄일 수 있습니다; 그러나 임상 사용은 치료 중단 후 재발, 부작용, 높은 비용, 불완전한 치료 반응 등으로 인해 제한될 수 있습니다^.

철분 의존성 조절 세포사사의 한 형태인 철분 의존성은 지질 과산화와 철 대사 변화를 특징으로 하며, 장 염증과 UC 관련 상피 손상과 점점 더 연관되어 있습니다 ^4,5,6,7,8. 동시에 전통 중의학 제형은 다표적^{치료 잠재}력 덕분에 UC 치료에 대한 보완적 접근법으로 점점 더 주목받고 있습니다.

5가지 향료 Sophora flavescens 장관 코팅 캡슐(FSEC)은 전통 중의학에서 경증에서 중등도의 활성 UC 치료에 임상적으로 사용됩니다. 이전 연구들은 FSEC가 다요인 및 다중 표적 기전을 통해 UC 증상을 개선할 수 있음을 시사합니다¹⁰. 그러나 실험적 UC에서 FSEC가 산화 스트레스, 염증 신호, JAK2/STAT3 활성, 그리고 철세포시증 관련 변화에 미치는 영향은 아직 충분히 규명되지 않았습니다.

산화 스트레스와 염증성 신호는 UC에서 장 점막 손상에 중요한 원인입니다. 과도한 활성 산소 종의 생성은 상피의 무결성을 파괴하고 염증성 세포 침투를 촉진하며 항산화 방어 체계를 저해할 수 있습니다. JAK2/STAT3 신호와 같은 사이토카인 매개 경로는 염증 증폭과 조직 손상에 기여합니다 11,12,13,14,15. 또한 산화 스트레스와 철 단백질 반응은 항산화 방어 능력, 철분 대사, 지질 과산화 변화를 통해 밀접하게 연관되어 있습니다 16,17,18,19,20. 따라서 산화 스트레스 지수, 염증성 사이토카인, JAK2/STAT3 신호 전달, 페로토시스 관련 마커를 동시에 평가하는 것이 실험적 UC에서 점막 손상과 치료 반응에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공할 수 있습니다.

본 연구에서는 고용량, 중용량, 고용량 FSEC의 효과를 평가하기 위해 고리형 덱스트란 황산염 나트륨 및 종양 괴사 인자 알파 도전 마우스 모델을 사용하였습니다. 이 설계의 핵심 방법론적 강점은 조직병리학적 평가와 혈청 산화 스트레스 지수, 대장 조직 사이토카인, JAK2/STAT3 면역조직화학, 철학 관련 단백질의 서부 블롯 분석을 단일 실험 틀 내에서 통합한 점입니다. 이 접근법은 FSEC가 실험적 UC를 완화하는지 여부를 판단하고, 산화 스트레스, 염증 신호 전달, 철융증 관련 마커 프로필의 관련 변화를 특성화하는 데 사용되었습니다. 전체 실험 설계와 분석 워크플로우는 그림 1에 요약되어 있습니다.

그림 1: 마우스 모델의 실험적 워크플로우와 후속 분석. 만성 실험적 궤양성 대장염은 실험 프로토콜 마지막 주에 2.5% 덱스트란 황산나트륨(DSS)에 주기적으로 노출된 후 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 도전을 결합하여 유발되었습니다. 마우스는 정상 대조군, 모델군, 저용량 FSEC, 중용량 FSEC, 고용량 FSEC, CRX-526 양성 대조군에 배정되었습니다. FSEC는 체중 108, 216 또는 432 mg/kg 용량으로 위내 개비 투여로 투여되었습니다. CRX-526은 양성 대조군 중재로 사용되었습니다. 최종 처리 후에는 조직병리학적 평가, 산화 스트레스 관련 생화학적 분석, ELISA를 이용한 사이토카인 분석, 면역조직화학, 서부 블롯 분석을 위해 샘플을 수집하였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

프로토콜

모든 동물 시술은 난창 의과대학 동물복지 및 윤리 위원회(승인 번호)의 검토 및 승인을 받았습니다. NY2SC 20250407). 모든 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 화학물질, 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 동물과 처우

이 연구에서는 수컷 C57BL/6J 쥐(야생형, 8주 생)를 사용하였습니다. 동물들은 온도와 습도가 통제된 표준 실험실 조건 하에 수용되었고, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 적응 후에는 식수에 2.5% 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 세 번 투여하여 만성 대장염을 유도하였다. 각 주기는 1주일간 지속되었고, 그 사이에는 2주간의 회복 기간이 있어 정기적으로 물을 마셨습니다. 실험 프로토콜의 마지막 주에 모델군과 치료군의 쥐들은 위내 게베이지로 종양 괴사 인자 알파(TNF-α; 10 μg/100 g 체중, 하루 두 차례)를 투여하여 대장 손상을 더욱 악화시켰습니다. 정상 대조군 쥐는 차량체만 투여했으며 DSS나 TNF-α에 노출되지 않았습니다.

다섯 가지 맛의 Sophora flavescens 장내 코팅 캡슐(FSEC)이 상업적으로 이용 가능하고 승인된 중국 특허 의약품으로 사용되었습니다. 제형에는 Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) 등이 포함되어 있었습니다. Rchb.f.와 글리시리자 우라렌시스 피쉬. 전 DC가 있습니다. 동일한 생산 배치의 캡슐 내용물을 무게 측정하여 멸균 증류수에 부유하여 신선한 투여 현탁액을 준비했습니다. 각 개비지 전에 현탁액은 균일하게 분산되도록 충분히 혼합되었다. 제품 출처, 승인 번호, 의약품 사양 및 품질 관리 정보는 재료표에 제공되어 있습니다. 제품 품질은 승인된 제약 규격과 제조사가 제공한 정보에 따라 설명되었으며, 여기에는 캡슐 사양, 외관, 장내 방출 및 분해 요구사항, 미생물 한계 요구사항, 품질 관리 기준 등이 포함됩니다.

FSEC 치료 마우스는 모델링 마지막 주에 하루 두 번 위내 개버지(108 mg/kg 체중), 중용량 FSEC(216 mg/kg 체중), 고용량 FSEC(432 mg/kg 체중)를 받았습니다. 용량 수준은 승인된 임상 용량, 체면적-면적 변환, 예비 용량 범위 고려사항을 바탕으로 선정되었습니다. 차량 처리 생쥐는 위내 개버지를 통해 동일한 양의 멸균 증류수를 투여했습니다.

양성 대조군은 모델링 마지막 주에 꼬리 정맥 주사를 통해 TLR4 길항제 CRX-526을 1 mg/kg로 투여받았습니다. CRX-526은 기준 항염증 중재로 사용되었습니다. 이 연구에는 6개 그룹(n=6개)이 포함되었습니다: 정상 대조군, 모델군, 저용량 FSEC, 중용량 FSEC, 고용량 FSEC, 그리고 CRX-526 양성 대조군. 쥐들은 마지막 연구 처리 후 24시간 후에 희생되었다. 안락사는 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 이소플루란 마취 하에 경추 탈구로 이루어졌습니다.

2. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통한 조직학적 평가

대장 조직은 항문과 회골부 사이 거시적으로 가장 영향을 받는 부위에서 채취되었습니다. 각 마우스에 대해 이 부위의 대표 결장 구간을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 파라핀에 박힌 후 절절 처리한 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색했습니다. 조직학적 평가를 위해 각 동물에서 최소 세 개의 절편을 준비하고, 각 절면마다 겹치지 않는 다섯 개의 고출력 필드를 검사했습니다. 필드는 찢어지거나 접히거나 얼룩이 잘 안 된 부분을 피하며 한 가장자리에서 다른 쪽 가장자리까지 무작위로 단면을 무작위로 선정했습니다. 점막 궤양, 분비선 파괴, 울혈, 염증성 세포 침윤 등 조직병리학적 변화를 광학 현미경으로 평가하였다.

3. 산화 스트레스 관련 생화학적 지표 측정

혈액 샘플(0.5mL)은 항응고제 함유관에 담겨 약 1160 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리했습니다. 상청액은 제조사 지침에 따라 재료표에 기재된 해당 분석 키트를 사용하여 혈청 철분, 초산화물 디무타제(SOD), 글루타티온(GSH), 카탈라제(CAT), 미엘로퍼록시다제(MPO) 수치를 측정하는 데 사용되었습니다.

4. JAK2와 STAT3의 면역조직화학적 분석

파라핀 내재 대장 조직 절편(5 μm)은 자일렌에서 탈파라핀된 후, 등급 에탄올 시리즈를 통해 재수화한 후 인산염 완충 식염수로 세척하였습니다. 항원 회재는 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에서 마이크로파 가열을 이용해 수행되었습니다. 상온으로 냉각한 후, 3% H₂O₂로 10분간 내인성 과산화효소 활성을 차단했습니다. 절편은 5% 정상 염소 혈청으로 상온에서 30분간 차단하고, 4°C에서 1:50과 1:80 희석된 1차 항체와 함께 4°C에서 배양하였습니다. 인산염 완충 식염수 세척 후, 제조사 지침에 따라 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체로 절편을 배양하였습니다. 면역반응성 신호는 3,3′-디아미노벤지딘을 사용해 시각화하였고, 핵은 헤마톡실린으로 염색하였다. 단면은 탈수되어 부착된 후 광학 현미경으로 검사되었습니다.

5. 효소 결합 면역흡착 분석법을 통한 사이토카인 정량

대장 조직은 2–^{3mm 3} 조각으로 잘라내어 인산염 완충 식염수에 얼음 위에 균질화한 후, 12,000 × g에서 4 °C에서 15분간 원심분리했습니다. 상청액을 수집하고, 제조사 지침에 따라 해당 ELISA 키트를 사용해 TNF-α, IL-1α, IL-13 농도를 측정했습니다. 흡광도 값은 마이크로플레이트 리더기를 사용해 측정했으며, 각 분석법마다 생성된 표준 곡선에서 사이토카인 농도를 계산하였습니다.

6. 철강 단백질 관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석

대장 조직에서 총 단백질을 추출하고, 단백질 농도는 비신코닉산 분석법을 사용해 측정하였다. 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 막 위로 옮겼습니다. 5% 무지방 우유 또는 이에 상응하는 차단제로 상온에서 2시간 동안 차단한 후, 막을 4°C에서 하룻밤 동안 GPX4, FTH1, ACSL4 및 재료표에 기재된 로딩 조절 단백질 β-actin에 대한 1차 항체와 함께 배양하였습니다. 다음 날, 막을 세척하여 해당 고추냉이 과산화효소 결합 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 배양하였다. 단백질 밴드는 화학발광 기질을 사용하여 시각화하고 화학발광 이미징 시스템으로 영상화하였습니다. 밴드 강도는 덴시토메트리 소프트웨어를 사용해 정량화하였습니다. GPX4, FTH1, ACSL4의 발현 수준은 β-액틴으로 정규화되었고, 통계 분석을 위해 상대 단백질 발현을 계산하였다.

7. 통계 분석

데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 여러 그룹 간 비교는 분산의 일방향 분석을 사용했으며, 정규성과 분산의 균일성 가정이 충족되면 본페로니의 사후 검정을 수행하였습니다. P < 0.05 값은 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었습니다.

결과

FSEC는 궤양성 대장염 마우스에서 조직병리학적 손상을 완화하고 산화 스트레스 관련 지표를 향상시킵니다
그림 2에서 보듯, 정상 대조군은 대장막 구조가 온전했고, 잘 조직된 샘과 최소한의 염증 세포 침윤을 보였습니다. 반면, 모델 그룹은 상피 파괴, 점막 궤양, 분비선 파괴, 울혈, 그리고 뚜렷한 염증성 세포 침윤을 특징으로 하는 심각한 점막 손상을 보였다. 모델 그룹과 비교했을 때, 고용량, 중용량 또는 저용량 FSEC 치료를 받은 쥐들은 점막 파괴와 염증성 세포 침윤 감소를 포함한 조직병리학적 손상이 감소했습니다. 가장 뚜렷한 조직학적 개선은 고용량 및 중용량 FSEC 그룹과 CRX-526 양성 대조군에서 관찰되었습니다.

토론

본 연구는 실험적 궤양성 대장염(UC) 마우스 모델에서 5가지 향 Sophora flavescens 장내 코팅 캡슐(FSEC)의 효과를 조사하고, 산화 스트레스 관련 지표, 염증성 사이토카인, JAK2/STAT3 신호 전달, 철학 관련 표지자의 관련 변화를 평가하였습니다. 주요 연구 결과는 FSEC 치료가 대장의 조직병리학적 손상을 완화하고, 항산화제 관련 생화학적 지표를 개선하며, TNF-α 및 IL-1α 수치를 감소시키고, IL-13 수치를 부분적으로 회복하며, JAK2 및 STAT3 면역염색 약화와 연관되어 있으며, 철학 관련 마커 프로필이 개선되었다는 점이었습니다. 종합적으로 이 관찰들은 FSEC가 실험적 UC에서 보호 효과를 발휘하며, 산화 스트레스, 염증 신호 전달, 철학 관련 경로의 조정 변화와 연관됨을 시사합니다.

산화 스트레스는^UC-15에서 장 ...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3,3′-디아미노벤지딘(DAB) 기질 키트	ZSGB-BIO	ZLI-9018	HRP 기반 면역조직화학 염색용 발색 기질.
ACSL4 항체 (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	웨스턴 블롯용 마우스 단일클론 1차 항체; 1:500 농도로 사용; RRID: AB_10842002.
항원 재현 용액, 구연산 완충액, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	파라핀 절편 면역조직화학 염색을 위한 열 유도 에피토프 재현 완충액.
BCA 단백질 분석 키트	Beyotime Biotechnology	P0012	웨스턴 블로팅 전 단백질 정량화.
C57BL/6J 마우스	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	8주령 남성 SPF 마우스; 제출된 윤리 승인 자료와 일치하는 동물 출처.
카탈레이스 (CAT) 분석 키트	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	혈청 CAT 활성 측정을 위한 컬러 분석 키트.
ChemiDoc XRS+ 이미징 시스템	Bio-Rad Laboratories	1708265	웨스턴 블로트 검출을 위한 화학 발광 이미징 시스템.
CRX-526	TargetMol	T27090	TLR4 길항제로 양성 대조군 개입으로 사용; CAS 번호 245515-64-4.
덱스트란 황산염 나트륨염 (DSS), 대장염 등급	MP Biomedicals	160110	대장염 등급의 DSS, 분자량 36,000–50,000 Da; 음용수에 2.5% 농도로 사용.
ECL 화학 발광 기질	Bio-Rad Laboratories	1705061	HRP 기반 웨스턴 블로트 신호 검출을 위한 Clarity Western ECL 기질.
ELISA 키트, 마우스 IL-13	Abcam	ab219634	마우스 IL-13 정량화를 위한 샌드위치 ELISA 키트; 450 nm 판독.
ELISA 키트, 마우스 IL-1α	Abcam	ab199076	마우스 IL-1α 정량화를 위한 샌드위치 ELISA 키트; 450 nm 판독.
ELISA 키트, 마우스 TNF-α	Abcam	ab208348	마우스 TNF-α 정량화를 위한 샌드위치 ELISA 키트; 450 nm 판독.
절대 에탄올	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	조직 처리, 탈수 및 시약 제조에 사용.
2가 철 (Fe2+) 분석 키트	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	혈청 또는 조직 시료에서 Fe2+ 측정을 위한 컬러 분석 키트.
오향 갈쑤나무 장용 캡슐	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA 승인 번호 Z20150002	중국 특허 의약품; 캡슐 당 0.4 g; 포뮬레이션에는 갈쑤나무, 혈액귀, 자색초, 혈련 및 감초가 포함됨; 제약 사양 YBZ00152015
글루타티온 (GSH) 분석 키트	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	혈청 GSH 측정을 위한 감소 글루타티온 분석 키트.
GPX4 항체 (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	웨스턴 블롯용 마우스 단일클론 1차 항체; 1:500 농도로 사용; RRID: 공급업체 데이터시트에 나열되지 않음.
헤마톡실린 및 에오신 염색 키트	Solarbio	G1120	파라핀 매장 결장 조직 절편의 H&E 염색.
고양이항-마우스 IgG에 연결된 양고양이 과산화수소효소	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	웨스턴 블롯용 2차 항체; 1:50,000 농도로 사용; RRID: AB_631736.
ImageJ 소프트웨어	National Institutes of Health	버전 1.54	웨스턴 블로트 밴드 정량화를 위한 이미지 분석 및 밀도계 소프트웨어.
면역조직화학 검출 키트	ZSGB-BIO	PV-9000	파라핀 절편 면역조직화학 염색을 위한 폴리머 기반 HRP 검출 키트.
JAK2 항체 (D2E12)