신선한 췌장 조직에서 골수 간엽 줄기세포 유래 섬 오가노이드 유사 구조 생성

요약

여기서는 돼지 췌장 조직 용해액을 사용하여 골수 간엽 줄기세포(BMSC)를 췌장 섬 오가노이드 유사 구조로 분화하는 프로토콜을 제시합니다. 오가노이드 유사 구조는 22일 후에 형성됩니다. 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 시험관 내 연구와 약물 스크리닝을 위한 췌장 섬과 유사한 형태학적 구조를 생성합니다.

초록

전 세계적으로 만성 질환인 당뇨병(DM)은 신체 내 혈당 균형 장애를 특징으로 합니다. 제1형 당뇨병(T1DM)에서는 자가면역 반응이 췌장 β세포를 완전히 파괴하여 인슐린 완전 부족을 초래합니다. 이 질환을 가진 환자들은 평생 보충 인슐린 치료가 필요합니다. 본 연구는 골수 간엽 줄기세포(BMSC)로부터 췌장 섬 오가노이드 유사 구조를 생성할 수 있는 신뢰할 수 있고 경제적인 배양 플랫폼을 만드는 것을 목표로 합니다. 이 플랫폼은 이식을 위한 기증자 섬 부족을 완화할 뿐만 아니라 당뇨병 관련 연구의 시험관 내 모델로도 활용될 수 있습니다.

돼지 췌장 조직 용해액의 준비 과정을 최적화함으로써(4 °C에서 12,000 rpm에서 30분간 원심분리, 0.22 μm 여과 후 멸균), BMSC는 췌장 섬 오가노이드 유사 구조로 성공적으로 분화하도록 유도되었습니다. 형태학적 검증 결과, 유도된 BMSC만이 조밀하고 통통하며 매우 투명한 섬 같은 집합체를 형성하는 반면, 유도되지 않은 BMSC는 상당한 공포화와 투명도 감소를 보였다.

동적 모니터링 결과, 세포 집합체(직경 50–100 μm)는 배양 16일째에 형성되어 22일째에는 캡슐 형태(직경 200–300 μm)로 발전했습니다. 이 방법은 조작이 간단하고 비용 효율적이며 복잡한 장비가 필요하지 않습니다. 결과적으로 생성된 오가노이드는 췌장 섬과 형태학적으로 유사하여 시험관 내 연구와 관련 약물 선별에 유용한 도구를 제공합니다.

서론

3차원(3D) 시험관 내 모델 시스템으로서, 췌장 섬 오가노이드 유사 구조는 당뇨병 연구와 재생 의학에서 중요한 도구로 부상했으며, 이는 천연 췌장 섬의 다세포 구성과 공간 구조를 밀접하게 모방할 수 있기^{때문입니다.} 이러한 모델은 섬 발달 생물학과 당뇨병의 병리적 기전을 이해하는 데 독특한 플랫폼을 제공할 ^{뿐만 아니라}, 세포 대체 치료와 약물 선별 시스템 개발을 지원합니다^. 전 세계적으로 당뇨병의 유병률이 계속 증가하고 있으며, 특히 제1형 당뇨병에서 돌이킬 수 없는 β세포 손상으로 인한 절대 인슐린 결핍이 심해지고 있기 때문에, 기존의 인슐린 대체 요법은 증상을 조절할 수 있지만 질병을 완치하지는 못합니다. 한편, 섬 이식은 기증자 부족에 직면해 있어 확장 가능한 대체 섬 공급원 개발이 시급한 우선순위입니다 ^1,5. 다능성 줄기세포나 성인 줄기세포의 방향성 분화 가능성을 활용함으로써, 췌장 섬 오가노이드 유사 기술은 이 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다 ^6,7,8.

최근 몇 년간 인간 배아 줄기세포(hESCs)와 유도다능줄기세포(iPSCs)를 기반으로 한 췌장 섬 오가노이드 유사 배양 시스템에서 상당한 진전이 ^{있었습니다9.} 여러 연구에서 유도 프로토콜과 배양 조건을 최적화함으로써 줄기세포가 포도당 반응성 인슐린 분비 기능을 가진 섬 유사 세포로 분화할 수 있음이 확인되었습니다¹⁰. 화학 재프로그래밍 기술의 돌파구는 유전적 조작 없이도 hiPSCs를 생성할 수 있게 하여 번역 잠재력을 향상시켰습니다^. 배양 시스템 측면에서, 3D 배양과 특정 세포외 기질 및 성장 인자 조합을 결합하면 섬 전구체 세포가 α, β, δ 세포로 구성된 오가노이드 구조로 자기조직화되는 것을 촉진할 수 있습니다¹². 그러나 기존 기술은 여전히 불안정한 분화 효율, 기능 성숙도의 부족, 혈관 네트워크 및 면역 미세환경의 부재 등 광범위한 적용을 제한하는 주요 제한 요인¹³ 등 수많은 도전에 직면해 있습니다.

췌장 섬 오가노이드 유사 구조 연구가 진전되었음에도 불구하고, 이 분야에서 해결해야 할 몇 가지 중요한 과학적 문제들이 남아^{있습니다.} 첫째, 표준화된 오가노이드 정의와 구성 절차가 부족해 서로 다른 실험실 간 결과를 직접 비교하기 어렵^습니다. 둘째, 현재의 배양 시스템은 고유 췌장 섬의 복잡한 세포 구성과 정밀한 공간적 배열을 완전히 재현할 수^없다. 셋째, 장기 오가노이드 배양 중 기능적 안정성과 이식 후 생존과 같은 핵심 문제는 아직 충분히 규명되지 않았습니다¹⁷. 또한 대부분의 기존 프로토콜은 여전히 동물 유래 기질 재료에 의존하고 있는데, 이는 불분명한 조성과 배치별 큰 변동으로 인해 임상 응용의 품질 관리를 방해합니다¹⁸. 이러한 지식과 기술적 격차는 췌장 섬 오가노이드 유사 구조의 기초 연구에서 임상 실무로의 전환을 심각하게 방해합니다.

이 프로토콜은 골수 중간엽 줄기세포(BMSC)를 이용해 췌장 섬 유사 구조물을 안정적이고 저렴하며 반복 가능하게 생성하는 방식을 구축하도록 설계되었습니다. 확립된 방법은 실험실 실험 연구 및 전임상 약물 선별 응용 분야를 목적으로 합니다. 현재 BMSC 유도 섬 분화 전략은 과도한 비용, 일관성 없는 운영 표준, 제한된 적용 가능성 등 여러 한계를 겪고 있습니다. 기존 유도 시스템의 대부분은 비용이 많이 드는 재조합 사이토카인, 전문 배양 매트릭스, 고정밀 배양 장치에 의존하여 광범위한 사용을 크게 제한합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해 본 프로토콜은 돼지 췌장 조직 용해액을 핵심 유도 인자로 채택합니다. 이 최적화되고 단순화된 배양 전략은 일상적인 실험실 장비와 조건만으로도 BMSC를 섬 형태 구조로 효율적으로 분화할 수 있게 합니다.

hESC, iPSCs, 또는 고비용 성장인자 조합에 의존하는 기존 방법과 비교할 때, 본 전략은 여러 가지 뚜렷한 실용적 이점을 제공합니다. 이는 고가의 시약과 복잡한 배양 장치를 없애고, 실험 비용을 절감하며, 배치 간 변동성을 최소화하면서 일관된 결과를 가능하게 합니다. 10,11,12,13. 외계유전자 매트릭스 기반 시스템과 달리, 이 프로토콜은 단순화된 조직 용해액을 사용하여 실험실^{15, 16, 17, 18} 전반에서 실험적 제어성과 재현성을 향상시킵니다. 더불어, BMSC는 쉽게 접근할 수 있고, 배양 내에서 안정적이며, 다능성 줄기세포와 관련된 윤리적 제약이 없기 때문에 이 접근법은 일상적인 실험실 사용에 특히 적합합니다.

기존 연구 접근법은 췌장 오가노이드 모델링 분야에서 양극화되어 있습니다. 임상 변형을 위한 고급 오르가노이드 플랫폼은 비용이 많이 들고 기술적으로 복잡하며, 단순화된 대체 모델은 심층 기능 분석을 지원하지 못합니다. 이 연구에서 제안된 프로토콜은 표준화된 중간 기술 체계를 제공하여 이 연구 격차를 메운다. 이 접근법은 췌장 섬의 핵심 생리학적 특성을 보존하며, 기존의 기본 실험실 환경과도 완벽히 호환됩니다. 이 도구는 섬 발달 메커니즘, 당뇨병 질환 모델링 및 예비 약물 후보 평가에 집중하는 연구자들에게 실용적인 도구로, 특히 일상적인 세포 배양 인프라를 갖추고 있지만 전문 줄기세포 배양 플랫폼이 부족한 팀을 위한 것입니다. 이 방법은 특정 고급 연구를 위해 완전히 혈관이 풍부하거나 면역학적으로 적합한 오가노이드를 생성하지는 못하지만, 예비 실험 스크리닝, 기전적 탐구 및 섬 생물학 연구의 학문적 훈련에는 적합합니다.

이 연구는 췌장 섬 오가노이드 유사 구조에 대한 경제적이고 표준화된 배양 시스템을 구축하는 데 중점을 두어, 당뇨병 관련 연구를 위한 신뢰할 수 있는 3차원 연구 모델을 제공하는 것을 목표로 합니다. 다양한 유도 요법과 배양 환경이 오가노이드 형성 효율성과 형태학적 특징에 미치는 영향을 체계적으로 분석함으로써, 이 연구는 이 분야의 진전을 가로막는 주요 기술적 장애물을 돌파하고자 합니다. 핵심 연구 목표는 세 가지 핵심 측면을 포함합니다: 정교한 기기 없이 일반 기초 실험실에 적용 가능한 보편적 배양 프로토콜 구축, 오르가노이드 품질 평가를 위한 정량적 평가 기준 수립, 그리고 장기 배양 기간 동안 오르가노이드의 형태학적 및 기능적 안정성을 유지하기 위한 배양 전략 최적화. 본 연구 결과는 시험관 내 실험 탐구에 견고한 기술적 근거를 제공할 수 있으며, 섬 발달 메커니즘 연구와 저혈당 약물 선별에 관한 실용적이고 신뢰할 수 있는 모델을 구축할 수 있습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 광시 의과대학 윤리위원회(승인 번호: SYXK 2014-0003)가 승인한 실험동물 복지 지침을 준수했으며, 국제의학기구협의회(CIOMS)가 제정한 동물 관련 생의학 연구를 위한 국제 지침 및 동물 관리 윤리 규정을 준수하였습니다.

조직 처리 및 시약 준비와 관련된 모든 작업은 오염을 방지하기 위해 Class II 생물안전 캐비닛 내에서 수행되어야 합니다. 신선한 조직 처리와 췌장 섬 오가노이드 유사 구조 유도제 준비를 완료할 때까지 최소 8시간을 두세요. 실험 내내 모든 샘플과 시약을 얼음 보관하세요.

1. 실험적 준비

1. 7일 된 스프래그 도울리(SD)가 젖을 먹이는 쥐를 경추 탈구로 안락사시키세요. 펜토바르비탈 나트륨 20 mg/kg 용량의 정맥 주사로 돼지에 마취하고, 발 철회 반사와 안정적인 호흡 수를 제거하여 적절한 마취를 확인합니다.
2. 무균 조건 하에 Class II 생물안전 캐비닛에서 돼지 췌장 조직을 처리합니다. 신선한 돼지 췌장 조직은 채취 후 24시간 이내에 처리하세요. 수집된 조직 샘플은 완전한 DMEM 배지( 표 1에 표시됨)에서 4°C에 보관하여 처리할 때까지 보관합니다.
3. 냉장 원심분리기를 4 °C로 미리 설정하고, 저속 원심분리 모드를 선택하여 세포 준비물을 손상시키지 않도록 하세요. 실험에 사용할 때까지 1000 μL 피펫 팁, 200 μL 피펫 팁, 50 mL 원심분리기 튜브를 −20 °C 냉동고에 보관합니다. 0.22 μm 멸균 필터와 20mL 일회용 멸균 주사기를 충분히 준비하세요. 안과 가위, 곡선 겸자, 유리 페트리 접시, 앰플을 고온 오토클레이빙(121 °C, 20분)으로 멸균하세요.
4. 실험 사용 전에 완전히 준비된 췌장 조직 용해액을 알리코트합니다. 최적의 실험적 일관성을 위해 100 μL 균질을 개별 1.5 mL 미세원심분리관에 피펫 분리하여 별도의 저장 및 이후 사용하세요.

2. 신선한 췌장 조직을 처리하여 췌장 섬 오가노이드 유사 구조 유도제를 준비한다

1. 신선한 돼지 췌장 표본을 채취하여 즉시 드라이아이스에 옮겨 조직의 생체 활성을 유지하세요. 획득한 조직은 먼저 피펫팅을 통해 멸균 생리식염수로 반복적으로 헹군습니다. 초기 세척 단계 후, 3mL의 멸균 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 사용해 잔여 혈흔과 조직 오염물질을 완전히 제거하기 위해 추가 철저한 세척을 합니다.
2. 멸균 배양 배지 잔여액을 제거하여 버리고, 2mL의 DMEM 배지를 보충합니다. 사전 처리된 췌장 조직은 멸균 안과 가위로 균일한 1 mm³ 조각으로 잘게 만듭니다(그림 1A,B). 모든 다진 조직 조각은 50mL 원심분리관에 모아, 10회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 균질한 혼합을 달성합니다.
3. 조직 균질화는 멸균된 유리 절개를 사용하여 수행됩니다(그림 1C). 분쇄 과정에서 췌장 조직 조각을 DMEM 배지와 1:1 부피 비율로 고르게 혼합합니다. 완전히 균질화된 조직 현탁액은 50 mL 원심분리관으로 옮겨져 4 °C 조건에서 21,600 × g의 고속 냉장 원심분리 30분간 진행됩니다.
4. 원심분리 후, 정화된 상원액은 멸균 피펫으로 천천히 추출됩니다. 채취된 상정액은 0.22 μm 멸균 필터를 통과하여 미세한 조직 이물질과 용해되지 않은 불순물을 제거합니다(그림 1D). 정제된 액체는 최종적으로 1.5mL 마이크로 원심분리관에 나뉘며, 각 튜브당 100 μL의 고정 부피를 사용하여 밀봉 보존 및 이후 실험을 수행합니다(그림 1E).
5. 할당된 췌장 섬 오가노이드 구조 유도제를 −20 °C에 보관합니다.
   참고: 유도기는 적절한 보관 조건에서 1년간 안정적으로 유지됩니다. 준비된 용해액의 유도 활도를 육안 검사와 기능적 유도로 평가합니다. 활성 용해액은 명확한 침전이 없는 맑고 연한 분홍색으로 식별할 수 있습니다; 가시적인 강수로 인한 활동 손실과 전형적인 섬 오르가노이드 형성 실패를 인식합니다.

3. 유도 배지 준비

1. 유도 배지를 세포 배양 수술 직전에 신선하게 준비하세요. 자가 준비한 췌장 섬 오가노이드 유도제와 10% 태아 소 혈청(FBS-H-DMEM)을 포함한 고포도당 DMEM 배지와 표 1에 명시된 비율에 따라 결합합니다.
2. 배양된 췌장 오가노이드 샘플을 37°C의 일정 온도에 CO₂ 포화 5%로 유지한 세포 인큐베이터에 넣어 연속 배양합니다.

4. 오가노이드의 형태학적 관찰 및 성장 모니터링

1. 현미경 관찰은 세포 시드 후 1일, 3일차, 7일차, 10일차, 15일차 등 배양 기간 동안 예정된 시점에 수행됩니다.
2. 각 검출 세션 동안 췌장 오가노이드 유사 구조의 형태학적 변화, 성장 조건 및 세포 생존성을 추적하기 위해 광학 현미경을 사용하여 구성체의 동적 성장 특성을 기록합니다.

5. 오가노이드의 통과 및 냉동 보존

1. 6웰 배양판에서 1×^{10 5} 세포 밀도로 씨앗 통과 3 BMSC를 전부 배양지에서 하룻밤 동안 배양하여 유도 전에 세포 부착을 가능하게 합니다.
2. 0.02% EDTA를 포함한 1mL의 트립신을 배양 시스템에 추가합니다. 배양 접시 표면을 5–8번 부드럽게 피펫팅하여 췌장 오가노이드를 접시에서 분리합니다.
3. 트립신 소화를 종료하기 위해 10% H-DMEM-F12 배지 2mL를 추가합니다. 냉장 원심분리기를 사용해 혼합물을 1,500 × g에서 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다. 원심분리 후 상액을 흡입하고 버리세요.
4. 세포 펠릿에 신선한 10% FBS-H-DMEM 배지를 두 배 부피로 첨가하여 1:2 통과 비율을 달성합니다.
5. 오가노이드 배양의 냉동 보존은 다음과 같이 수행합니다: 얻은 세포 펠릿을 1mL의 혈청 무첨가 냉동 보존 용액에 재현탁합니다. 재현탁된 오가노이드는 단기(최대 1년) 보존을 위해 −80 °C에 보관하고, 장기 보관은 액체 질소에 보관합니다.
   참고: 신선한 배지의 부피를 조절하여 다양한 통과 비율을 달성하세요. 예를 들어, 1:1 지문에는 초기 음량과 같은 양을 사용하거나, 1:3 지문에는 초기 양의 3배를 더하는 식입니다.

결과

췌장 섬 유사 오가노이드 배양의 성장 역학을 시간에 따라 기록하는 것은 특히 배양 초기 몇 주 동안 매우 중요하며, 이는 이후 실험에서 배양 시스템의 성능을 예측할 수 있게 합니다. 그림 2는 22일 배양 사례로, 7일 된 젖을 먹는 쥐의 골수에서 BMSC를 효율적으로 분리하여 췌장 섬 유사 구조를 성공적으로 생성한 사례를 보여줍니다. BMSCs의 정체는 삼계통 분화와 표면 표지 발현(CD29⁺, CD90⁺, ^CD34−, CD45⁻)으로 확인되었습니다(보충 그림 S1). 새로 형성된 오가노이드의 표현형은 다양하며, 흩어진 구형 오가노이드부터 구체/집합체 유사 배양에 이르기까지 다양하며, 이러한 표현형 차이는 췌장 섬 오가노이드 유사 구조의 발달 단계에 따라 달라집니다. 췌장 섬...

토론

당뇨병은 전형적인 대사 질환으로, 주로 제1형 당뇨병(T1DM)과 제2형 당뇨병(T2DM)으로 분류됩니다. T1DM은 췌장 β세포가 선택적으로 파괴되어 절대 인슐린 결핍을 초래하는 자가면역 질환입니다. 환자들은 평생 지속되는 외부 인슐린 치료가 필요하지만, 여전히 심각한 저혈당과 미세혈관 합병증의 위험에 직면해 있습니다²⁰. 섬 이식은 현재 내인성 인슐린 분비를 회복시킬 수 있는 유일한 치료 방법^이지만, 기증자 부족과 면역 거부 반응으로 임상 적용이 제한됩니다²¹. 따라서 대체 섬 공급원과 새로운 치료 전략 개발은 당뇨병 연구에서 중요한 방향이 되었습니다. 최근 몇 년간 줄기세포 기술과 오르가노이드 배양의 급속한 발전은 당뇨병 치료에 새로운 희망을 가져다주었습니다^14<...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & mu; m 멸균 필터	메르크 밀리포어	SLGP033RB	췌장 조직 용해액의 무균 여과를 통해 불순물과 이물질을 제거합니다
0.25% 트립신(0.02% EDTA 이내)	와이즌트	325-043-CL	통과 수술을 위한 췌장 섬 오가노이드의 경미한 해리
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	코닝 악시겐	AXY-20-1500	췌장 조직 용해액의 분리 및 저장(100 & mu; 튜브당 1리터)
10 & 뮤; L 피펫 팁	에펜도르프	22491653	항체 및 소용량 효소 용액의 액체 전달
1000 & mu; L 피펫 팁	에펜도르프	22491651	시약 및 셀 현탁을 위한 액체 이송
-20° 냉동고	하이얼	HYC-326	시약(예: FBS, 트립신) 및 피펫 팁의 저장
200 & mu; L 피펫 팁	에펜도르프	22491652	소용량 시약을 위한 정밀 액체 이동(예: 용해물 분할 추출)
10 & 뮤; L 피펫 팁	하이얼	DW-86L626	췌장 조직 용해액 및 냉동 보존 오가노이드의 장기 저장
50 mL 원심분리관	코닝	430829	췌장 조직 용해액과 세포 현탁액의 고속 저온 원심분리
6웰 배양판	코닝	3516	췌장 섬 오가노이드 및 BMSC의 배양
클래스 II 생물안전 캐비닛	하이얼	HR40-IIA2	돼지 췌장 조직의 멸균 처리 및 오가노이드 배양 수술
CO2 인큐베이터	써모피셔 사이언티브	3111	췌장 섬 오가노이드의 37°에서 배양; C, 5% CO2 환경
곡선 겸자	상하이 화기 의료기기 유한회사.	HQ-1302	가공 중 췌장 조직 취급, 고온 멸균
DMEM 미디엄(고혈당)	와이즌트	318-025-CL	췌장 섬 유가노이드 유도 배양에 사용됨
DMEM 중간 (저혈당)	와이즌트	319-015-CL	BMSC 배양 및 조직 처리를 위한 기저 배지
태아 소 혈청 (FBS)	깁코 (써모피셔 사이언티픽)	10099141C	세포 배양 및 소화 종료를 위해 10% 부피 비율로 DMEM에 첨가
H-DMEM-F12 매체	와이즌트	315-080-CL	오르가노이드 통과 중 트립신 소화를 종료하는 데 사용됨
고온 오토클레이브	하이얼	GR80DA	기구 멸균 (121° C, 20분) 그리고 유리 제품들
광학 현미경	올림포스	CX43	췌장 섬 오가노이드의 다양한 배율(및 시간) 관찰 및 영상 촬영 4, 그리고 배; 10, 그리고 배; 20)
안과 가위	상하이 화기 의료기기 유한회사.	HQ-1201	돼지 췌장 조직을 1mm³로 절단하기; 고온 오토클레이빙으로 멸균된 조각들
페니실린-스트렙토마이신 용액	써모피셔 사이언티브	15140122	배양 배지 내 박테리아 오염을 방지하기 위해 1% 부피 비율로 사용
인산염 완충 식염수(PBS)	깁코 (써모피셔 사이언티픽)	10010023	돼지 췌장 조직과 세포 세척을 위한 세척 완충제
냉장 원심분리기	에펜도르프	5810R	고속 원심분리는 4° 췌장 용해액 준비 및 세포 펠릿 수집을 위한 C입니다
혈청 없는 냉동 보존 솔루션	쑤저우 신사마이 생명공학 유한회사.	#C40050	췌장 섬 오가노이드의 냉동 보존에 사용되며, -80도 이전에 세포 펠릿을 재현탁합니다; C 저장장치