식물 추출물, 곰팡이 여과산물, 박테리아 배양물을 이용한 금 및 은 나노입자의 녹색 합성

요약

이 프로토콜은 식물 추출물, 곰팡이 여과액, 박테리아 배양물을 이용해 금 및 은 나노입자를 제조하는 재현 가능한 녹색 합성 방법을 설명하며, 이후 자외선-가시광선 분광법과 투과전자현미경을 통해 나노입자를 확인합니다.

초록

생물학적 시스템을 이용한 금속 나노입자(NP)의 친환경 합성은 기존 화학 제조 방법에 대한 지속 가능한 대안을 제공합니다. 이 프로토콜은 박테리아 배양물, 곰팡이 여과액, 식물 잎 추출물을 환원 및 안정화제로 사용하여 금(Au) 및 은(Ag) NPs의 합성을 위한 재현 가능한 실험 및 분석 절차를 제시합니다. AgNPs는 Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera, Earliella sp.에서 추출한 추출물을 사용해 합성되었으며, 405nm에서 425nm 사이의 특징적인 자외선-가시광선(UV–Vis) 흡수 밴드를 보여 NP 형성을 확인했습니다. Shewanella oneidensis 와 Cupriavidus metallidurans의 AuNP 합성에 산소 조건, pH, Au 농도, 세포 농도, 전자 공여 유형, 온도 등 환경 요인이 미치는 영향을 평가하기 위해 실험 설계 방식을 도입하였습니다. 이상적인 조건(0.2 mM Au, pH 5)에서 S. oneidensis 는 주로 구형 AuNP를 생성했으며, 평균 크기는 11.0 nm± 43.6이고 특징적인 흡수 피크는 520 nm였습니다. NP의 형성과 형태는 UV–Vis 분광법과 투과 전자현미경을 통해 확인되었습니다. 이 워크플로우는 생물 원형 NP 합성을 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공하며, 생체감지, 생물복원, 항균 기술 분야의 응용을 지원합니다.

서론

금속 나노입자(NP)는 높은 표면적과 관련된 독특한 물리화학적 특성을 지니며, 여기에는 독특한 전자, 자기, 촉매 거동과 높은 반응성을 포함합니다. 이러한 특성들은 질병 진단 및 약물 전달을 위한 의학 1,2,3,4,5,6, 자외선 차단제 제형용 화장품 7, 트랜지스터 및 태양전지 전자공학 8, 수처리 환경공학 ^2,9,10 등 다양한 분야에서 적용을 촉진했습니다비료와 농약 농업^11,12. NP 신청이 학문 분야별로 지속적으로 확대되고 있으며, 최근 몇 년간 관련 출판물이 증가한 것으로 반영되어 있습니다.^{13, 14}.

금속 NP에 대한 합성 방법은 입자 크기, 형태, 안정성과 같은 중요한 특성을 정밀하게 제어할 수 있게 하여, 합성 공정이 NP 성능의 중요한 결정 요인이 됩니다. 기존의 화학 합성 방법은 광범위하게 최적화되어 왔으며; 하지만 독성 시약, 높은 에너지 소비, 높은 생산 비용이 자주 발생합니다^14,15. 이러한 한계는 더 친환경적이고 지속 가능한 대안 개발을 촉진했습니다. 녹색합성 접근법은 식물 추출물 ^16,17, 균류와 박테리아¹⁸을 포함한 미생물, 조류¹⁹와 같은 생물학적 시스템을 천연 환원 및 안정화제로 사용합니다. 이 과정에서 금속 염은 무가 형태로 환원되어 환경 친화적이고 비용 효율적인 경로를 통해 NP를 생성합니다. 또한, 생물학적으로 합성된 NP는 종종 생체 적합성을 가지고 있어 의료, 농업, 환경 응용 분야에서 사용이 용이합니다 ^8,14.

NP 합성을 위한 적절한 생물학적 경로 선택은 의도된 응용 분야뿐만 아니라 이용 가능한 인프라 및 운영 요구사항에 따라 달라집니다. 식물 기반 합성은 최소한의 멸균 취급이 필요하기 때문에 빠르고 저비용 NP 생산에 일반적으로 선호됩니다; 그러나 추출물 조성의 변동성은 재현성에 영향을 미칠 수 있다 ^20,21. 곰팡이 매개 합성은 높은 NP 수량과 세포외 효소를 제공하여 NP의 안정화 및 후속 가공을 개선할 수 있으나, 이 방법은 더 긴 배양 기간과 통제된 성장 조건을 요구합니다²². 반면, 박테리아 시스템은 정의된 대사 조건과 빠른 바이오매스 생성 하에서 조정 가능한 합성을 가능하게 하여, 기전 연구와 NP 관련 응용에 적합하다²². 그러나 박테리아 합성은 종종 엄격한 무균 처리, 통제된 생물반응기 조건, 그리고 세포 내 NP가 회수될 때 추가적인 하위 처리 과정을 필요로 합니다^21,22.

언급된 장점에도 불구하고, 녹색합성 방법은 재현성과 표준화와 관련된 도전에 여전히 직면해 있습니다. 더불어, 금속 NP의 그린 합성을 위한 상세한 시각적 단계별 프로토콜^{은 여전히 제한}적이며, 연구자들이 기존 방법론을 성공적으로 재현하고 구현하는 데 한계가 있습니다. 이 연구의 목표는 식물 추출물, 곰팡이 여과액, 박테리아 배양물을 사용하여 금(Au) 및 은(Ag) NPs에 대한 재현 가능한 녹색 합성 프로토콜을 제시하는 것입니다. 구체적으로, Psidium guayaquilensis 와 Acanthophora spicifera의 수용성 추출물, Earliella 속의 세포외 균류 여과물, 그리고 Shewanella oneidensis 와 Cupriavidus metallidurans 와 관련된 박테리아 시스템이 NP 합성에 사용되었습니다. 제시된 프로토콜은 생물학적 추출물 준비, NP 합성, 그리고 예비 NP 특성 분석의 핵심 단계를 강조합니다. 또한, 이 워크플로우는 실험 설계, 표준화된 준비 절차, 인라인 특성 분석을 통합하여 재현 가능하고 최적화 가능한 생체 NP 합성을 지원합니다.

프로토콜

연구는 에콰도르 고등고등학교(ESPOL, Ecuador)의 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 식물, 조류, 곰팡이 생체량은 접근 가능한 환경에서 수집되었으며, 보호종이나 제한 구역을 포함하지 않았습니다. 기관 및 국가 규정에 따르면, 이러한 조건에서 자유롭게 이용 가능한 바이오매스를 수집하는 데 별도의 허가가 필요하지 않았습니다. 식물, 조류, 곰팡이, 박테리아 생물학적 시스템을 이용한 AgNPs 및 AuNPs의 녹색 합성에 사용되는 통합 실험 워크플로우는 그림 1 을 참조하십시오.

그림 1: 생물학적 시스템을 이용한 은(Ag) 및 금(Au) 나노입자(NP)의 그린 합성을 위한 통합 워크플로우. 식물, 조류, 균류, 박테리아 시스템을 이용한 AgNPs 및 AuNPs의 녹색 합성 실험 워크플로우 개요. 작업 흐름은 생물학적 원천 선택, 추출물 또는 바이오매스 제제, 금속 전구체(AgNO₃ 또는 HAuCl₄)와의 반응, 반응 조건, NP 형성을 보여줍니다. 생물학적 시스템에는 Psidium guayaquilensis 잎 추출물, Acanthophora spicifera 조류 추출물, Earliella sp. 세포외 여과물, Shewanella oneidensis MR-1 박테리아 배양물이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

참고: 화학물질 및 생물학적 물질을 취급할 때는 모든 기관 실험실 안전 지침을 준수하십시오. 사용 전에 모든 시약에 대한 안전 데이터 시트를 반드시 확인하세요.

1. P. guayaquilensis 잎을 이용한 AgNPs 합성

1. 잎 컬렉션
   1. 에콰도르 과야스 주 과야킬(2°10′S, 80°0′W)에서 건기 동안 P. guayaquilensis 의 신선한 잎을 채집하세요.
      참고: 이 고유종의 표본은 에콰도르 과야킬 대학교 자연과학부 GUAY 표본관과 미국 뉴욕 뉴욕 식물원(NYBG) 스티어 표본관에 기탁되었습니다. 추가 정보는 다음 http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207 에서 확인할 수 있습니다:
2. 잎 추출물 제제
   1. 신선한 식물성 재료를 증류수로 깨끗이 씻으세요.
      참고: 표면 불순물을 완전히 제거하세요.
   2. 40°C의 강제 공기 흐름이 있는 트레이 건조기에 잎을 말리세요.
      참고: 낮은 건조 온도는 Ag⁺ 환원에 관여하는 열가약성 유기 화합물의 분해를 최소화합니다.
   3. 손으로 밀을 사용해 건조된 재료를 갈아 미세한 가루를 얻습니다.
   4. 분말 10g을 200mL 증류수에 부유합니다.
   5. 현탁액을 70°C에서 1시간 동안 계속 저어주며 가열하세요.
   6. 추출물을 실온(RT, ~28°C)까지 식힙니다.
   7. 진공에서 정성 필터 페이퍼(1등급, 기공 크기 11 μm, 직경 110 mm)를 사용하여 추출물을 여과합니다.
      참고: 식물 재료에서 모든 고체 잔여물을 제거하세요.
   8. 여과된 추출물을 4°C에서 호박색 병에 보관하다가 추가 사용하세요.
3. 잎 추출물을 이용한 식물성 AgNPs 제조
   참고: 최적화 실험 중에는 각 분석마다 한 가지 매개변수만 변화시키고 나머지 매개변수는 일정하게 유지하세요. 질산은 농도(AgNO₃) 농도(1–5 mM), 추출물 분율(10%–50% v/v), 반응 시간(0.5–1시간), 온도(25°C–80°C)를 평가합니다. 중앙 복합 DoE를 기반으로 한 응답면 방법론을 사용하여 합성 매개변수를 최적화합니다. 각 인자는 다섯 단계(-α, -1, 0, +1, +α)에서 공부합니다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 피크(λ SPR)의 파장(λ_SPR)을 응답 변수²⁴로 사용하는데, 이는 NP 크기와 상관관계가 있습니다. 실험 설계는 16개의 요인점, 8개의 축 지점, 5개의 중심점 복제로 구성되어 총 29건의 실험이 이루어졌습니다.
   1. AgNO₃ 용액은 적절한 질량을 증류_{수에 용} 해시켜 1에서 5 mM 사이의 농도를 얻습니다.
      주의: AgNO₃ 는 부식성이 강하고 강한 산화제로 피부와 눈 자극을 일으킬 수 있습니다. 장갑과 눈 보호구를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 빛 노출을 피하고 농산물 함유 폐기물은 기관 안전 지침에 따라 폐기하세요.
   2. AgNO₃ 용액과 식물 추출물을 혼합하여 추출물 분율 10%에서 50%(v/v) 사이를 얻으세요.
   3. 반응 혼합물을 선택한 온도(25°C–80°C)에서 원하는 반응 시간(0.5–1시간)으로 가열하고 저어줍니다.
   4. 반응 혼합물을 RT 온도에서 24시간 동안 두세요.
   5. 갈색 반응 혼합물을 1660 × g에서 15분간 RT에서 원심분리합니다. 상상액을 버리고 고형 분획을 수집합니다.
   6. 회수한 녹전은 60°C의 오븐에 건조하세요.

2. A. spicifera 조류 추출물을 이용한 AgNPs 합성

1. 조류 컬렉션
   1. 에콰도르 산타 엘레나 주 발디비아(1°57′23.91′′S, 80°43′51.33′′W)에서 A . spicifera 조류를 채집하세요.
2. 조류 추출물 제제
   1. 1.2단계에서 설명한 절차를 따라 조르가 추출물을 준비합니다. 식물 잎을 A. spicifera 조류 바이오매스로 교체하세요.
3. 조류 추출물을 이용한 피코제인 AgNPs 제조
   참고: 나머지 매개변수는 일정하게 유지하면서 한 번에 한 매개변수씩 변화시키며 12개의 실험을 수행하세요. AgNO₃ 농도(1–5 mM), 추출물 분획(5%–25% v/v), 반응 시간(1–4시간), 온도(25°C–70°C)를 평가합니다.
   1. 1.3.1 및 2.2 단계에 설명된 대로 AgNO₃ 용액과 조류 추출물을 준비합니다.
   2. AgNO₃ 용액과 조류 추출물을 혼합하여 추출물 비율을 5%–25%(v/v)로 얻습니다. 반응 혼합물을 선택한 온도(25°C–70°C)에서 원하는 반응 시간(1–4시간)으로 가열하고 교반합니다.
   3. 용액을 RT로 24시간 식히세요. 원심분리 후 고체 분획을 수집하여 1.3.5 및 1.3.6 단계에 설명된 대로 오븐에서 건조합니다.

3. Earliella sp.을 이용한 AgNPs 합성

1. 배양 수집 및 유지
   1. Earliella sp.의 활성 성장 균사체 조각을 감자 포도당 아가(potaeto Dextrose Agar) 플레이트에 옮깁니다.
      참고: 이 연구에 사용된 곰팡이 균주는 에콰도르 ESPOL 캠퍼스에서 채취된 환경 샘플에서 분리되었습니다. 이 분리주는 형태학적 특징을 기반으로 분류학적으로 식별되었으며, 에콰도르 생명공학연구센터(CIBE, ESPOL)의 배양 컬렉션에 내부 코드 E2로 보존되어 있습니다. 이 균주는 기관 소장품에 보관되어 있으며 국제 저장소에 기탁되지 않았기 때문에 RRID나 외부 등록 번호는 제공되지 않습니다.
   2. 플레이트를 28°C에서 48시간 부양하세요.
   3. 균사체 조각을 감자 포도당 육수에 옮기고, 150rpm에서 지속적으로 교반하여 5일간 배양합니다.
      참고: 이 단계는 바이오매스 생산과 세포외 대사산물의 분비를 촉진합니다.
   4. 균사 생체를 세포외 육수에서 분리하기 위해 멸균 필터 페이퍼로 균사 배양을 걸라. 여과액을 수집하여 이후 NP 합성을 수행합니다.
      참고: 세포외 육수에는 AgNP 합성 과정에서 환원 및 안정화 작용을 하는 생체분자가 포함되어 있습니다.
2. 마이코제닉 AgNP의 제조
   참고: 각 분석마다 한 가지 매개변수를 변경하여 곰팡이 육수와 AgNO₃ 용액 간의 부피 비율을 일정하게 유지하여 14가지 실험 조건을 생성합니다. AgNO₃ 농도(1–10 mM), pH(HCl 또는 NaOH를 사용해 조정한 4–10), 반응 시간(1–4시간), 온도(25°C–70°C)를 평가합니다.
   주의: 염산(HCl)과 수산화나트륨(NaOH)은 매우 부식성이 강합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 물보라와 국소적 과열을 방지하기 위해 지속적으로 저으며 pH를 천천히 조절하세요. pH 조절 시 1M 산성 또는 염기 용액을 사용하세요.
   1. 곰팡이 세포외 육수를 AgNO₃ 용액과 원하는 농도(1–10 mM)로 2.5%에서 10% (v/v) 사이의 부피 비율로 혼합하여 최종 반응량 50 mL를 얻습니다. 시험 대상 조건에 따라 최종 반응 부피를 조정하세요.
   2. 반응 혼합물을 선택한 온도(25°C–70°C)에서 원하는 반응 시간(1–4시간)으로 저어줍니다. 용액을 RT로 24시간 식히세요. 원심분리 후 고체 분획을 수집하여 1.3.5 및 1.3.6 단계에 설명된 대로 오븐에서 건조합니다.

4. C. metallidurans와 S. oneidensis를 이용한 AuNPs 합성

1. 배양 수집 및 유지
   1. 호기성 조건 하에 C . metallidurans CH34 또는 S. oneidensis MR-1의 20% 글리세롤에 보존된 냉동 세포 주식을 트립틱 대두 한천 플레이트에 접종합니다. 판을 28°C에서 24시간 부양하세요.
   2. 각 플레이트에서 개별 군락을 선택하여 호기성 조건에서 250mL의 트립티스 대두 육수에 접종합니다. 배양물을 28°C에서 120rpm 회전 셰이커에서 배양하세요.
   3. 72시간 배양 후 정지 단계에서 세포를 수확하는데, 이 시점에서 610 nm(외₆₁₀)의 광학 밀도가 약 1에 도달합니다. 배양물을 10000 g × 10분 동안 ~20°C에서 원심분리합니다.
   4. 수집된 펠릿을 멸균 0.9% (w/v) NaCl 용액으로 두 번 세척하세요. 세척된 세포를 OD₆₁₀ 값 약 7로 농축합니다.
   5. 현탁을 탈기하고 헤드스페이스를_N2 가스로 채워 무산소 농축 셀 재고를 생성합니다.
2. 박테리오생성 AuNP의 제조
   참고: 환경 요인이 AuNP 합성에 미치는 영향을 평가하기 위해 분수-요인 행렬을 사용하세요²⁵. 이전 연구에서 선택한 2단계 7개의 요인을 사용하여 행렬을 구성합니다^26,27. 실험을 직교 행렬로 배열하고 실험 순서를 무작위로 지정하여 시험-조합 편향을 최소화합니다. 결과적인 실험 순서는 다음과 같이 제시된다. 표 1.
   1. 염화금(HAuCl₄)을 탈이온수에 녹여 5g L⁻¹의 정액을 제조합니다.
      주의: HAuCl₄ 는 독성이 있으며 강한 산화제입니다. 모든 용액은 인증된 화학 연기 후드 안에서 다루며, 실험실 가운, 장갑, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요. 유기물과의 접촉을 피하고 폐기물을 기관의 유해 폐기물 프로토콜에 따라 폐기물을 처리하세요.
   2. 실험용 반응기를 0.9% (w/v) NaCl 용액에 표적 농도로 희석한 후, 표 1에 명시된 실험 조건에 따라 pH를 조절하여 준비합니다.
   3. 준비된 금속 용액 50mL를 깨끗한 120mL 혈청 병에 분사합니다. 즉시 부틸 고무 마개로 병을 밀봉하세요.
   4. 스토퍼는 알루미늄 크림프 씰과 휴대용 크림퍼로 고정하세요. 밀봉된 혈청 병은 121°C에서 21분간 오토클레이빙으로 멸균하세요.
   5. 병을 식혀 RT에 넣은 후 각 병의 강수량을 육안으로 점검하세요.
      참고: 눈에 띄는 강수량이 보이는 병은 버리고 교체용 원자로를 준비하세요.
   6. 무산소 상태의 확립
      1. 각 멸균된 혈청 병을 고순도 질소(N₂) 소스와 진공 펌프가 장착된 가스 매니폴드 시스템에 연결합니다.
      2. 표 1에 따라 무산소 조건이 필요한 각 원자로에 대해 21회 연속 퍼지 사이클을 수행하여 무산소 헤드스페이스를 생성합니다. 각 사이클 동안 진공 상태를 가한 후 약 30초간 질소를 되채워 내부 압력이 대기압(~1기압)으로 돌아올 때까지 진행합니다.
         참고: 무산소 상태에 대한 직접 검증은 필요하지 않습니다; 하지만 필요 시 가스 크로마토그래피와 같은 헤드스페이스 가스 분석을 통해 산소 제거를 확인할 수 있습니다.
         주의: 질소 가스는 산소를 밀폐하여 밀폐된 공간에서 질식 위험을 초래할 수 있습니다. 사용 전에 충분한 실험실 환기를 확인하고 가스관 연결이 안전한지 확인하세요.
      3. 최종 퍼지 사이클 후에는 원자로를 약간 양의 N₂ 압력으로 유지하세요.
      4. 실험 순서에 따라 1번부터 8번까지 원자로를 라벨링하세요. 예를 들어, 다섯 번째 실험 조건을 R5로 표시하자.
   7. 전자 공여체 첨가 및 접종
      1. 표 1에 따라 멸균 주사기와 바늘을 사용해 지정된 반응기의 액상에 필요한 무균 무산소 액체 전자 공여액(예: 낙산나트륨)을 주입합니다.
      2. 가스 밀폐 주사기를 사용해 지정된 원자로 헤드스페이스에 필요한 양의 기체 전자 공여체(예: H2)를 주입합니다.
      3. 모든 바이오틱 반응기에 액체상에 필요한 농축된 무산소 미생물 스톡 배양물을 무균적으로 주입하여 접종합니다.
         참고: 세포 생존력을 유지하기 위해 접종 전 농축 육지 배양물을 4°C에 보관하십시오.
   8. 대조 실험 설정
      1. 4.2단계에서 설명한 모든 단계를 따르면서 미생물 접종체를 동등한 부피의 멸균 무산소 배양 배양체 또는 완충제로 대체하여 비생물적 방제를 준비합니다.
      2. 4.2단계에서 설명된 모든 단계를 따라 오토클레이빙으로 멸균된 접종체를 사용하여 죽은 세포 대조군을 준비합니다.
         참고: 대조군을 사용하여 비생물 금속 환원과 생흡수를 고려하세요. 활성 미생물 기전의 기여도를 평가하기 위해 121°C에서 생존 가능한 세포 재고를 21분간 오토클레이빙하여 죽은 세포 방제를 준비합니다.
   9. 부화 및 반응 시간
      1. 모든 세럼 병을 온도 조절 인큐베이터에 넣으세요.
      2. 표 1에 명시된 실험 조건에 따라 배양 온도를 조절합니다.
      3. 인큐베이터를 회전식 셰이커 플랫폼 위에 놓고 120rpm으로 인큐베이터를 인큐베이팅하세요.
      4. 반응이 72시간 동안 진행되도록 기다려 주세요.
         참고: 배양 후 실험을 일시정지하고 혈청 병을 샘플 처리가 완료될 때까지 4°C에서 보관하세요.
         참고: NP 생합성 후 유도 결합 플라즈마 광학 방출 분광법을 사용하여 금속 제거 효율을 평가하고 NP 형성과 잔류 용존 종을 구분하여 잔류 용존 금속을 선택적으로 정량화할 수 있습니다.
3. 최적 조건의 복제
   1. 1차 선별 및 데이터 분석 후 최대 금속 제거와 관련된 반응기 상태를 파악합니다.
   2. 선택된 최적 조건을 세 개의 독립적인 반응기 병에서 재현성을 확인하기 위해 복제합니다.
   3. 4.1 및 4.2 단계에 따라 삼중 검증 실험의 준비, 원자로 설치 및 인큐베이션 절차를 수행하세요.
      참고: 실험이 완료된 후에는 국가 유기농 환경법과 기관 기술 지침에 따라 인증된 폐기물 관리 회사가 처분할 때까지 모든 용해물을 수용성 폐기물로 임시로 저장하고 라벨을 붙여야 합니다.

원자로 / 박테리아	온도 (°C)	대기	전자 공여체	광학 밀도 (OD610)	pH	[골드] (mM)
1 / CMC	37	북2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	북2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / Som	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / 소닉	37	북2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / 섬	28	북2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

표 1: 박테리오인성 AuNP 합성에 사용되는 분별 요인 실험 설계. 이 표는 S. oneidensis MR-1(SOM) 또는 C. metallidurans CH34(CMC)를 이용한 AuNP 합성을 위한 실험 조건을 요약한 것입니다. 변수로는 배운 온도, 헤드스페이스 대기, 전자 공여자, 접종 광밀도(OD₆₁₀), 용액 pH, 초기 Au³⁺ 농도가 포함되었습니다.

5. AgNPs와 AuNPs의 특성화

참고: 표면 플라즈몬 공명을 통해 NP 형성을 확인하기 위해 자외선-가시광선(UV–Vis) 분광법을 활용하세요. 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 NP의 형태와 크기를 직접 평가합니다. 추가적인 물리화학적 특성 분석은 동적 광 산란(DLS), X선 회절(XRD), 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법, 에너지 분산 X선 분광법(EDS)과 같은 보완 기법을 사용하여 크기 분포, 결정성, 표면 화학 및 원소 조성을 평가할 수 있습니다. 보다 포괄적인 특성 분석이 필요할 때는^28,29.

1. UV–Vis 분광법
   1. 기기 설치
      1. UV–Vis 분광광도계를 켜고 기기를 최소 15분 이상 예열하여 신호 안정성을 확보하세요.
      2. 스펙트럼 스캐닝 모드를 선택하고 1 nm의 데이터 간격을 사용해 300 nm에서 800 nm 사이 파장 범위를 설정하세요.
2. 샘플 준비
   1. 신선하게 합성된 AgNP 또는 AuNP 현탁액을 추출하세요. 필요 시 샘플을 증류수로 희석하여 선형 검출 범위 내에서 흡수도를 유지하세요.
3. NP의 UV–Vis 측정
   1. 빈 용액으로 증류수를 사용하여 기준선 보정을 수행합니다.
   2. 준비된 샘플을 큐벳에 옮기고, 큐벳을 샘플 홀더에 넣은 후 300–800 nm 범위의 자외-가시성 스펙트럼을 기록합니다.
   3. NP 형성에 대응하는 SPR 밴드를 식별합니다.
      참고: AgNP는 일반적으로 405에서 425nm 사이의 SPR 밴드를 보이는 반면, AuNP는 일반적으로 520에서 550nm 사이의 SPR 밴드를 보입니다.
4. 투과 전자현미경
   참고: 80 kV에서 고해상도 디지털 카메라가 장착된 TEM을 사용하여 NP의 형태와 크기를 분석하십시오.
   1. 1.5mL의 NP 현탁액을 원심분리기와 원심분리기에 5000 × g으로 5분간 RT 상태로 옮깁니다.
   2. 상정액은 버리고 펠릿은 남겨두세요.
   3. 0.1 M 카코딜레이트 완충제에 4% 파라포름알데히드와 5% 글루타알데히드가 포함된 고정액 1mL를 펠릿에 첨가합니다. 샘플을 RT에서 25시간 배양하세요. 그 후 0.1M 카코딜레이트 나트륨 버퍼로 펠릿을 하룻밤 세척합니다.
   4. 샘플을 5000 × g에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   5. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충제에 1% (w/v) 오스뮴 테트록사이드(OsO₄) 1mL를 첨가하여 3시간 고정합니다.
      주의: OsO₄ 는 매우 독성이 강하고 불안정합니다. 모든 용액은 인증된 화학 연기 후드 안에서만 다루고, 실험복, 장갑, 안전 고글 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
   6. 샘플을 5000 × g에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.
   7. 등급 등급 에탄올 시리즈를 사용해 샘플을 탈수합니다. 에탄올 50%를 추가하고 15분간 배양합니다. 70%와 90%를 사용해 순서대로 반복하세요. 완전 탈수로 절대 에탄올에서 30분간 연속 3회 배양.
   8. 제조사 지침에 따라 RT에서 펠릿을 에폭시 수지에 삽입하세요.
   9. 반얇은 조각(~1 μm)을 준비하고, 예비 관찰을 위해 톨루이딘 블루로 염색합니다.
   10. 다이아몬드 나이프로 초박형 단면(~60 nm)을 자르고, 우라닐 아세테이트로 착색한 뒤 시트레이트 납을 덧입힙니다.
   11. 이 부분들을 TEM 그리드에 장착하고 투과 전자현미경에 넣으세요.
   12. NP의 형태와 크기를 평가하기 위해 TEM 이미지를 획득합니다.

결과

AgNPs는 다양한 생물학적 환원제를 이용한 녹색 및 생합성 경로를 통해 성공적으로 합성되었으며, 각 방법에 대한 이상적인 합성 조건이 확인되었습니다. P. guayaquilensis 잎 추출물이 매개한 녹색 합성에서는 최적의 조건이 5 mM의 AgNO₃ 농도, 추출물과 금속 용액 비율 25%(v/v), 반응 온도 80°C, 교반 시간 60분 후 24시간 휴식 시간으로 구성되었습니다. 이러한 조건에서 UV–Vis 분광법은 416에서 425 nm 사이에 중심을 둔 명확한 SPR 밴드를 보여주었으며, 이는 성공적인 NP 형성과 안정적인 콜로이드 분산을 나타냅니다(그림 2A). TEM은 평균 크기가 24± 7.5nm이고 비교적 좁은 크기 분포를 가진 주로 준구형 AgNP의 형성을 확인했으며(그림 3A), 식물 추출물 내 식물화학물질에...

토론

평가된 합성 경로를 타당성, NP 크기 제어, 운영 비용, 재현성, 전체 공정 효율성 측면에서 비교했을 때, P. guayaquilensis 잎 추출물을 이용한 식물 매개 합성이 조사된 AgNP 합성 방법 중 가장 유리한 균형을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 온화한 조건에서 장기간 생물학적 배양 없이 운영하면서 체계적인 최적화와 직접 현미경 특성 분석을 통해 NP 크기를 개선할 수 있게 했습니다. 또한, 이 방법은 재현 가능한 실험 조건에서 비교적 균일한 AgNP를 형성할 수 있게 했습니다. A. spicifera를 이용한 조류 매개 합성은 비용 효율적이고 확장 가능한 대안으로 제시되었습니다; 그러나 이용 가능한 특성화 데이터에 따르면, 이 경로는 NP 크기 분포에 대한 제어가 상대적으로 낮아 매우 균일한 나노구조가 요구되는 응용을 제한할 수 있습니다. 반면, Earliella 속을 이용한 곰팡이 매개 합성은 강한 환원 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	For serum bottles
Amber glass bottles	Duran	2180154	Light-protected storage
ATR-FTIR spectrometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Sterilization at 121 °C
Butyl rubber stoppers	Dwk Kimble	73827-21	Gas-tight sealing
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Bench-top centrifuge
Chloroauric acid trihydrate (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Gold precursor
Diamond knife	Aurion	Dyatom 45	Ultrathin TEM sectioning
Distilled or deionized water	Methrom	N/A	Solution preparation
Epoxy resin (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM embedding medium
Filter paper, qualitative Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Pore size: 11 µm; diameter: 110 mm
Fourier transform infrared spectrometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Gas manifold system	Custom-built	N/A	For purge cycles
Gas-tight syringe	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	20% stock preservation
Handheld crimper	Biomed	USYGQ-20Z	Crimp sealing of serum bottles
Hand mill/grinder	Corona	L10000	Plant biomass grinding
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	320331	pH adjustment
Hydrogen (H2) gas	Linde	Industrial grade	Electron donor gas
ICP-OES system	Varian	Vista-MPX	Metal quantification
Incubator	Memmert	SM 400	Temperature-controlled incubation
Laboratory oven	Barnstead	M100	Drying nanoparticles
Lead citrate	Merck	7398	TEM staining
Nitric acid (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Acid reagent
Nitrogen (N2) gas	Linde	Industrial grade	Anoxic conditions
Osmium tetroxide (OsO4)	Merck	201030	TEM fixation
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Potato Dextrose Agar (PDA)	Merck	110130	Fungal cultivation
Potato Dextrose Broth (PDB)	Merck	P6685	Microbiological medium
Rotary shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubation at controlled agitation
Serum bottles (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilicate glass
Silver nitrate (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS reagent, ≥99.0%
Sodium cacodylate buffer	VWR	11650	5% Glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0.1 M Sodium Cacodylate Buffer
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0.9% washing solution
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH adjustment
Sodium lactate	Sigma-Aldrich	L7022	Electron donor/carbon source
Sterile syringes and needles	BD	Various	Sterile liquid handling
Stirring hot plate	Biologix	01-310X	Heating and agitation
Toluidine blue	EMS	DcU-10	Semi-thin section staining
Transmission electron microscope (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Equipped with high-resolution digital camera
Tray dryer with forced airflow	Handmade	N/A	Biomass drying at 40 °C
Tryptic Soy Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Microbiological medium
Tryptic Soy Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Microbiological medium
Uranyl acetate	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM staining
UV–Vis spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis spectral analysis
Vacuum pump	KNF or equivalent	N 820 G	For anoxic conditions
Biological Materials
Biological Material	Source	Identifier	Comments/Description
Acanthophora spicifera	Local collection	N/A	Marine algal biomass
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Bacterial strain
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Institutional fungal collection
Psidium guayaquilensis	Local collection	N/A	Wild plant biomass
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Culture collection strain