방법 논문

쥐의 신장 허혈-재관류 손상 중 레이저 반점 조영 영상으로 모니터링되는 미세혈관 관류

DOI:

10.3791/70762

⸱

2026년 2월 27일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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마우스에서 오른쪽 신장 절제 후 일측 신장 허혈-재관류 시 신장 미세혈관 혈류 변화를 모니터링하기 위해 레이저 스펙클 대조 영상 시스템을 사용하였습니다.

초록

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레이저 스펙클 조영 영상(LSCI)은 넓은 부위에 걸친 표재성 혈액 관류를 측정하는 비침습적 기법입니다. LSCI는 높은 시공간 해상도를 통해 영상 영역 내 다양한 영역 간 이질적인 혈류 변화를 반정량화합니다. 여기서는 LSCI가 마우스에서 일측성 신허혈-재관류 손상(IRI) 시 혈류를 기록하는 기법을 시연합니다. 오른쪽 신장 절제술 후에는 마우스의 위치와 LSCI 시스템 대물렌즈의 초점을 조정하여 왼쪽 신장이 시야에 들어오도록 했습니다. LSCI 스캔은 신장 허혈 전, 중, 후에 시행되었습니다. 더 나아가, 관심 영역(ROI)을 선택함으로써 해당 영역의 혈류를 동시에 모니터링했습니다. LSCI 방법은 신장의 미세혈관 관류를 시각화하고 혈류를 실시간으로 매핑할 수 있게 합니다. 이 방법은 미세혈관 혈류를 모니터링하고, 마우스, 신장 IRI 또는 유사한 동물 모델 중 재관류 속도론과 공간적 균질성에 대한 개입의 효과를 평가하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

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허혈-재관류 손상(IRI)은 급성 신장 손상(AKI)의 주요 원인 중 하나로, 환자들의 높은 이환율과 높은 사망률과 연관되어 있습니다 1,2. 신장 혈역학 변화는 IR 유발 AKI1의 핵심 요인 중 하나입니다. IR 유발 미세순환 기능 장애는 손상 발생의 주요 원인으로, 세포의 산소 결핍과 미토콘드리아 기능 장애를 초래합니다 3,4. 따라서 혈류 변화를 실시간으로 모니터링하는 것은 신장의 허혈 또는 재관류를 성공적으로 보장하고 이 질환의 동물 모델에서 IRI의 정도를 평가하는 효과적인 방법입니다.

조직의 미세혈관 관류를 측정하는 여러 기법이 있으며, 여기에는 레이저 도플러 플로우메트리(LDF)5, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오타이드 탈수소효소(NADH) 자가형광 영상 6,7,8, 적외선 영상9, 인도시아닌 그린(ICG) 혈관조영술10 등이 포함됩니다. 그중 적외선 영상과 NADH 자가형광 영상은 미세혈관 관류를 간접적으로 측정합니다. LDF는 광학 탐침을 사용하여 지역혈류만 모니터링하며, MRI 조건11에서 조직 미세혈관 관류의 실시간 변화를 모니터링하는 데 충분히 빠르지 않습니다. ICG 혈관조영술도 신장 혈관이 막힌 혈관을 식별할 수 있으나, 조영제 투여가 필요하며, 이는 제한된 측정 횟수로 사용이 제한됩니다12. 레이저 스펙클 대비 영상(LSCI)은 신장 미세관류를 실시간으로 모니터링하는 효율적인 비침습적방법입니다. 이는 혈류 역학과 관련된 공간적으로 분해된 정보를 생성하는 데 사용되어 왔습니다. 일관된 빔이 거친 표면에 비추면, 반사되거나 산란된 빛파는 미세한 경로 차이로 인해 서로 간섭하여 밝고 어두운 점 패턴의 무작위 분포를 형성하는데, 이를 '스펙클(speckle)'이라고 합니다. LSCI는 레이저 빛이 조직을 조사할 때 발생하는 '동적 스펙클'의 흐림 정도를 분석하여 표면 조직의 혈류 속도를 지도화합니다. 본 연구에서 LSCI 시스템은 785 nm 레이저 파장, 공간 해상도 3 μm, 시야각은 6.3 mm× 4.7 mm 및 42 mm × 31 mm 사이로 조절 가능하며, 최대 120 프레임/초의 영상 속도를 제공하여 피질 미세혈관 관류의 고해상도 실시간 매핑을 가능하게 했습니다. 이러한 장점을 바탕으로 LSCI는 화상상처 16, 망막관류17, 뇌혈류18, 식도19, 장20 등 다양한 실험 및 임상 혈류 모니터링 환경에서 적용되어 왔습니다.

LSCI는 주로 표면 조직의 관류를 평가하며, 절대 유량이 아닌 상대적 유량을 제공하고, 조직의 광학적 특성과 운동 인공물에 의해 영향을 받을 수 있다는 점을 유의해야 합니다. 이러한 고유한 특성들은 영상 데이터를 해석할 때 고려됩니다.

이 연구는 반대쪽 신장 노출 및 영상 촬영을 용이하게 하기 위해 오른쪽 신장 절제술을 포함하는 모델을 사용하여, LSCI를 이용한 단측 신장 I/R 마우스 모델에서 허혈 전, 중, 후 미세혈관 관류 변화를 모니터링하고 신장 표면 혈류의 공간적 이질성을 입증했습니다.

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프로토콜

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모든 동물 시술은 NIH의 실험동물 관리 및 사용 가이드와 실험동물 관리 및 사용 가이드를 준수했으며, 산터우 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 성별 및 균주 기반 IRI 효과 차이를 제거하기 위해 연구에는 수컷 C57BL/6N 쥐만 사용되었다. 모든 쥐는 나이와 체중에서 일치하도록 하여 유사한 결과를 얻었습니다. n=5의 표본 크기가 사용되었으며, 이는 이전 LSCI를 이용한 기술적 검증 방법론 연구와 일치합니다21. 동물들은 인도적인 돌봄을 받았고, 실험 후CO2 흡입으로 안락사되었다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

수술 시작 전에 레이저 스펙클 대조 영상 시스템을 켜세요. 이 연구에 사용된 시스템은 785nm 레이저로 작동합니다. 수술 부위 약 15-20cm 위로 작업 거리를 설정하세요. 이 시스템은 공간 대비 알고리즘을 기반으로 레이저 스펙클 관류 유닛(LSPU)의 혈류를 계산합니다. 진행 전에 기기가 예열되고 안정적인지 확인하세요.

1. 동물 준비 및 개복술

  1. 각 수술 전에 수술대를 소독하세요. 필요한 모든 필요한 물품(멸균된 기구, 면봉, 거즈, 미리 희석된 마취제, 온열 패드, 혈관 클램프, 식염수, 제모 크림, 면봉, 봉합, 피부 소독제, 봉합사)을 수술 테이블 위에 준비하고 놓으세요.
  2. 통증 완화를 위해 30분 전에 마우스에게 멜록시캄(0.2 mg/kg 체중; 피하 주사)을 투여하세요.
  3. 깨끗한 용기에 일정량의 멸균된 식염수를 부으세요. 그다음 거즈 조각을 꺼내 가운데에 적당한 구멍을 내세요.
  4. 2.5% 트리브로모에탄올(체중 400 mg/kg 체중; 이전에 멸균 생리식염수에 희석됨) 복막 내 주사로 쥐를 마취합니다.
    참고: 트리브로모에탄올은 오른쪽 신장 절제술 과정에서 마취제로 사용되었습니다. 그리고 1% 이소플루란은 혈류 모니터링 장시간 마취에 사용되었습니다.
  5. 쥐를 온열 패드 위에 테이프로 올려놓고, 제모 크림을 사용해 복부 부위의 털을 제거하세요. 수술 중에는 온열 패드를 사용해 직장 온도를 37 °C ± 0.5 °C로 유지하세요.
  6. 수술 부위 피부를 먼저 알코올 75%로 소독한 후 면봉을 이용해 아이오도포르로 소독하세요.
  7. 집자를 사용해 쥐의 발가락을 꼬집으세요. 쥐가 통증 반응을 보이지 않으면 가위로 복부 중앙선을 따라 수직 절개를 합니다. 복막에서 피부를 부드럽게 떼어낸 후 복막을 절개하여 복강 안으로 들어가세요.
  8. 쥐에게 리트랙터를 대어 시야를 최적화하고, 수술 부위를 거즈로 덮은 뒤, 거즈의 틈을 복강과 맞추고 생리식염수로 적셔주세요.

2. 오른쪽 신장 절제술

  1. 면봉을 사용해 장을 부드럽게 거즈 한쪽으로 밀어 오른쪽 신장과 주변 조직을 노출시킵니다. 거즈를 접어 장을 덮고 생리식염수로 적셔 장이 건조해지는 것을 방지하세요.
  2. 각진 겸자를 사용해 오른쪽 요관을 들어 올립니다. 요관을 통과하는 6-0 봉합사 두 가닥을 통과시키고 두 군데에서 결찰을 시행합니다.
  3. 두 결선 사이의 요관을 미세가위로 절단하세요.
  4. 생리식염수로 솜뭉치를 적신 후, 가는 겸자로 솜뭉치를 집어 들고 간을 부드럽게 위로 밀어 올린 뒤, 솜뭉치로 고정시켜 신장과 오른쪽 혈관을 노출시킵니다.
  5. 각진 겸자를 사용해 오른쪽 신장 옆면의 주후신장 지방 패드를 둔하게 분리하여 신장동맥과 정맥이 완전히 노출되도록 하세요.
    참고: 신장 위에 위치한 부신 조직 덩어리를 동시에 분리하세요.
  6. 신장 동맥과 정맥 아래에 각도가 있는 겸자를 조심스럽게 밀어 넣어 통로를 만듭니다. 그 다음 6-0 실크 꼬인 봉합선을 혈관에 감아 결찰합니다.
  7. 신장 근처에 위치한 막힌 신장 동맥과 정맥을 절단하세요. 신장과 남아 있는 부착 조직을 제거하세요.
  8. 간을 담는 솜뭉치를 제거하세요.

3. 허혈-재관류 중 레이저 스펙클 조영 영상(LSCI)을 이용한 신장 혈류 모니터링

  1. LSCI 시스템과 기기 전용 소프트웨어를 켜세요.
  2. 원본 이미지와 미리보기를 클릭하여 수술 부위의 원본 처리되지 않은 이미지를 볼 수 있습니다.
  3. 마우스의 위치를 바꾸고, 1% 이소플루란을 분당 600mL로 코 콘을 통해 투여하여 마취를 유지하며, 원본 이미지를 관찰하면서 카메라 배율을 조정하여 목표 신장을 선명하게 볼 수 있습니다.
  4. 실시간 혈류 이미지를 보려면 동시 디스플레이 를 클릭하세요. 배율을 2.5×로 설정하고 자동 혈류 조정 을 선택하여 이미지를 최적화하세요. 그 다음, 혈류 매개변수를 고정하세요. 게다가 5000ms마다 한 프레임씩 사진을 녹화하도록 설정하세요.
    참고: 젖은 솜뭉치는 신장의 안정된 위치를 유지하고 주변 장기와 조직이 신장과 조직을 멀리하도록 하여 신장 부위와 배경의 구분을 강화하는 데 사용됩니다.
  5. 정사각형 면적 매개변수의 크기를 112로 설정하고, 신장 뷰에서 5개의 정사각형 영역을 일정한 방향으로 균일하게 배열합니다. 실시간 영상 등록 및 기록 을 클릭하여 혈류 데이터 기록을 시작하세요.
    참고: 이 기계는 ROI에서 실시간 혈류 단위를 나타내는 레이저 스펙클 관류 단위(LSPU)를 자동으로 기록하여 분석에 사용할 수 있습니다. 탐지 과정에서 호흡 관련 움직임이나 환경 변화로 인해 시야가 이동할 수 있습니다. 시스템이 감지 영역에서 이를 표시하면 전류 기록을 중단해야 합니다. 그 후 실시간 이미지 등록 을 클릭하고 다시 녹화하세요 .
  6. 30분 기준 기록 후 왼쪽 신장 혈관 주변 지방 조직을 분리합니다. 정혈 겸자를 사용해 마이크로클램프를 잡아 왼쪽 신동맥과 폐문(hilum) 근처 정맥 위에 대세요. 실시간 모니터링을 30분 더 계속하세요.
  7. 마이크로 클램프를 풀어 재관류를 시작하세요. 신장 미세혈관 혈류의 실시간 회복을 모니터링하고 기록합니다.
  8. 혈류 재관류가 최소 60분 이상 모니터링된 후에는 모니터링을 중단하고 복부 절개 부위를 7-0 실크 브레이드 봉합사로 봉합하세요.

4. 수술 후 회복 및 관리

  1. 수술 후 탈수를 방지하기 위해 복막 내 1mL 식염수 주사로 수액을 투여하세요.
  2. 쥐들은 온열 패드 위에 두세요. 쥐가 의식을 회복하고 깨어 있으며 스스로 자세를 바로잡을 수 있을 때까지 주의 깊게 관찰하세요.

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결과

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이 논문은 IR 유발 AKI 시 신혈류 변화를 탐지하는 것을 목표로 했습니다. 따라서 우리는 오른쪽 신장 절제술(그림 1A)과 반대쪽 신장에 대한 IR 수술(그림 1B)을 포함하는 일반적인 마우스 모델을 사용했습니다. IRI 중 혈류 모니터링이 실시간으로 필요했기 때문에, 쥐에 대한 모든 조작은 전체 과정 내내 기기 영역에서 수행되었습니다(그림 1C).

기기 매개변수를 설정하고 시야각을 조정한 후, 먼저 30분간 혈류 측정을 실시하여 신장 미세혈관 관류의 기초 수준을 모니터링했습니다. 초기 30분 동안 쥐의 신장 미세혈관 내 혈류는 점차 안정되었습니다(그림 2A-C...

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토론

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이 연구는 LSCI 시스템을 활용해 쥐에서 IRI 중 신장 미세혈관 혈류 역학을 실시간으로 고해상도로 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 LDF와 같은 공간 해상도가 제한된 기존 종말 측정이나 방법보다 신장 미세순환 내 지역적 이질성을 포착하는 2차원 관류 지도를 제공함으로써 상당한 이점을 제공합니다. 수술 중 실시간 모니터링을 위한 LSCI의 효율성과 사용성은 이 방법의 주요 강점입니다.

수컷 마우스의 허혈 전, 중, 후 혈류 변화를 모니터링한 결과, 허혈 30분 후 재관류 시 신장 미세혈관 혈류가 기본 수준으로 돌아가지 못하며, 신장 폐문과 근위 또는 원위 부위에 이질성이 존재함을 발견했습니다. 결과는 쥐11번에서 얻은 결과와 일치합니다. 초기 고혈증 후 지속되는 저관류 패턴은 대뇌 모델21에서 관찰된 미세혈관 반응과 유사...

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공개 사항

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저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 광둥성 대학 혁신 팀 연구 프로그램(2022KCXTD009)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수기 캐니스터 (마취용)선전 라이월 바이오텍 유한회사, 중국10-0210
알코올, 의료 (75%)헝글리야, 신장, 중국해당 없음피부 소독제
마취용 증기미드마크https://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
면봉칭다오 하이누오 생물공학 유한회사, 중국https://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
제모 크림비트https://www.veet.com.cn/jingchun/whx
거즈 붕대위너 메디컬 유한회사, 선전, 중국https://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
온열 패드런추 딩셩 난방기기 유한회사, 중국HD-1902체온 유지를 위해
아이오도포르 용액중국 진셴 타이신캉https://www.11467.com/nanchang/co/120661.htm피부 소독제
이소플루란RWD 생명과학 유한회사, 중국R510-22-10흡입 마취제
레이저 스펙클 대비 영상(LSCI) 시스템후베이 순웨이광전자기술유한회사, 중국심 BFI HR 프로무어FLPI-2 동등한 시스템
멜록시캄칠루 동물건강제품유한회사, 중국.https://en.qiludb.com/companion_animal/500.html체중 kg당 0.2 mg; 진통제
마이크로 클램프상하이 의료기기(그룹) 유한회사, 중국W40140혈관 클램프
생리식염수 (염화나트륨 0.9%)시센 제약유한회사, 중국https://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
실크 브레이드 스튜어 (6-0)양저우 푸다 의료기기 유한회사, 중국http://www.fdma.com.cn/products_detail/12.html혈관 연결에 대해
실크 브레이드 스튜어 (7-0)위고 테루모(웨이하이) 의료제품 유한회사, 중국https://www.weigaoholding.com/상처 봉합을 위해서는 곡선 바늘을 사용하는 흡수성 없는 수술용 봉합사를 사용합니다
주사기 (1 mL)산둥 안데헬스케어 어퍼러터스 유한회사, 중국https://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.html26G 바늘로
트리브로모에탄올시그마-올드리치T48402-100G2.5% 용액; 주입 마취제

참고문헌

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