인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

요약

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

초록

골다공증과 같은 근골격계 질환을 모델링하려면 인간 뼈 생물학의 핵심 특징을 정확히 재현하는 시험관 내 플랫폼이 필요합니다. 기존 3D 배양 시스템은 세포 간 및 세포-기질 간 상호작용에 대한 귀중한 통찰을 제공하지만, 비용이 많이 드는 재료, 바이오프린터, 또는 특수 인프라에 의존하기 때문에 광범위한 채택이 제한됩니다. 여기서는 GelMA 하이드로겔에 내장된 인간 유래 골세포를 이용해 3D 골 구조물을 생성하는 견고하고 비용 효율적인 프로토콜을 설명하며, 기증된 대퇴골두에서 얻은 탈세포화된 세포외기질(dECM)을 보완합니다. 이 피펫팅 기반 방법은 표준 실험실 장비를 사용하여 생리학적 온도(37 °C)에서 재현 가능한 뼈와 유사한 구조물을 제작할 수 있게 합니다.

결과물은 높은 생존력과 구조적 완전성을 유지하여 면역형광 영상 및 분자 분석과 같은 후속 응용을 지원합니다. 환자 유도 dECM의 도입은 인간의 뼈 재형성과 질병 진행을 더 잘 반영하여 번역적 관련성을 높입니다. 이 접근법은 약물 검사, 재생 의학, 그리고 뼈 생물학의 기전적 연구를 위한 접근 가능하고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 고비용 바이오프린팅 기술에 대한 실용적인 대안을 제공하며, 다른 조직 특이적 dECM 소스에도 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

이 방법은 GelMA와 인간 골 조직에서 유래한 dECM을 결합하여 골다공증을 포함한 근골격계 질환을 모델링할 비용 효율적이고 재현 가능한 3D 세포 배양 플랫폼을 구축하는 것을 목표로 합니다. 이 전략은 기존 2차원 배양보다 생리적 미세환경을 더 가깝게 재현하는 뼈와 유사한 구조물을 생성할 수 있게 하여, 생물학적으로^{관련 있는 조건} 하에서 세포-세포 및 세포-기질 간 상호작용을 연구하는 데 지원한다. 환자 유래 골세포와 임상에서 대퇴골두에서 추출한 dECM의 사용은 번역 가치를 높이고 시험관 내 실험과 임상 연구 필요성 간의 실질적 연계를 제공합니다².

이 방법은 기존 3D 배양 및 생체제조 시스템의 주요 한계를 해결하기 위해 개발되었으며, 이들은 종종 바이오프린터, 독점 생체재료, 또는 비용이 많이 드는 소모품(예: Matrigel)을 필요로 하여 많은 ^3,4에서 접근성 접근성을 제한합니다. 더불어, 합성 하이드로겔은 광화화된 골세포외기질의 생화학적 복잡성이나 상주 골세포의 행동을 재현하지 못하는 경우가 많습니다. 반면, 이 프로토콜은 인간 뼈에서 유래한 dECM을 포함하여, 광물 성분, 천연 단백질, 신호 분자를 보존하면서 적층 제조 기술과 관련된 인프라 요구를 피합니다⁶.

GelMA와 dECM의 조합은 여러 가지 장점을 제공합니다. GelMA는 세포 접착, 생존 및 분화를 지원하며, 37°C에서 처리할 수 있어 특수 장비 없이도 세포 캡슐화가 가능합니다. 저비용 자외선(UV) 소스(365 nm)를 이용한 가교결합은 접근성을 더욱 높^{입니다. 7}. dECM 보충은 합성 대체물에는 없는 조직 특이적 단서를 통해 구조를 풍부하게 하여 골형성 적합성을 높이고 면역형광 및 분자 프로파일링과 같은 후속 분석법을 용이하게 합니다⁸.

이 방법은 동물 연구에 대한 의존도를 줄이기 위한 인간 관련 뼈 모델 개발 노력과 일치하는데, 동물 연구의 번역 정확도는 종간 차이로 인해 제한되는 경우가 많기 때문입니다 ^1,9,10. 이 프로토콜은 3Rs¹¹의 원칙과 일치하며, 다른 조직 특이적 dECM을 이용한 구조물을 생성하는 데 적응할 수 있어 연골, 피부, 심혈관 조직 공학 분야에 적용 가능성을 확장합니다¹².

전반적으로 이 기법은 생리학적으로 중요한 조건에서 뼈 생물학을 연구할 수 있는 접근성 있고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다. 일상적인 실험실 인프라와의 호환성과 인간 임상 샘플 통합 능력은 학계 및 병원 기반 연구 그룹에 특히 적합합니다. 이 방법은 뼈 과정에 대한 추가 연구를 위한 플랫폼을 제공할 뿐만 아니라, 재생 의학과 개인 맞춤형 치료 개발 분야에서 더 많은 중개 응용의 출발점이 될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 콘셉시온 보건 서비스의 과학 윤리 위원회에서 승인되었습니다. 인간 뼈 조직은 칠레 콘셉시온 외상병원에서 고관절 치환 수술을 받는 환자들이 서면 동의를 받은 후 기증한 대퇴골 두에서 채취되었습니다. 샘플은 사용 전까지 −80 °C에서 보관되었습니다. 모든 절차는 연구에서 인간 조직의 윤리적 사용을 위한 기관 지침을 준수했습니다. 모든 인간 골 조직은 칠레 콘셉시온 외상과 병원 환자들이 기증한 대퇴골두에서 채취하였으며, 이는 콘셉시온 보건국 과학윤리위원회의 사전 동의와 승인을 거친 후였습니다. 모든 절차는 인간 조직 사용에 관한 기관 지침을 준수합니다.

1. GelMA 합성

1. 10g의 A 젤라틴 A를 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.5) 100mL에 60°C에서 지속적으로 교반하여 용해합니다.
2. 온도를 50 °C로 낮추고 5mL의 메타크릴 무수물을 분당 0.5 mL의 속도로 부드럽게 1–3시간 저어줍니다.
3. 반응 혼합물을 40°C에서 예열한 PBS로 5× 희석하여 반응을 멈춥니다.
4. 12–14 kDa 막을 사용해 40°C의 증류수 3–5L에 대해 5–7일간 용액을 다스리레이시하며, 매일 물을 교체합니다.
   참고: (중요한 단계) 반응하지 않은 메타크릴 무수물을 제거하기 위해 매일 완전한 물 교체를 반드시 해야 합니다.
5. 투석 용액을 24시간 동안 리오필링하고, 동전 건조된 GelMA는 사용 전까지 4°C에서 보관합니다.

2. GelMA 하이드로겔 제제

1. 5, 10, 또는 15 w/v%의 GelMA 하이드로겔 10mL 배치를 준비하세요.
2. 0.5, 1.0, 또는 1.5g 동성 건조 GelMA를 50°C의 9.5mL 탈이온수에 녹입니다.
3. 용액을 37°C로 식힙니다.
4. Irgacure 2959 광시작제 용액 0.5mL(절대 에탄올 내 0.5 w/v%)를 추가합니다.
5. 부드럽게 혼합하여 0.22 μm 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 필터를 통해 멸균 여과할 때까지 37°C에서 용액을 유지합니다.

3. 뼈 탈세포화

1. 대퇴골 머리는 점차 25°C까지 녹아. 각 대퇴골 머리를 반으로 잘라서 더 작은 조각으로 나누세요.
2. 무균 증류수(60°C)에 작품을 담가 15분(40 kHz, 연속) 소닉 처리합니다.
3. 샘플을 60°C에서 예열한 증류수 300mL에 넣고 200rpm에서 5분간 흔들며 세척합니다.
4. 원심분리기는 1850g에서 15 분간 25°C×. 세척과 원심분리기 단계를 세 번 반복하세요.
5. 3% 과산화수소와 0.02% 과산소아세트산이 포함된 용액에서 60°C에서 10분간 초음파 검사(40 kHz, 연속)로 조직을 멸균합니다.
6. 조직을 70% 에탄올 300mL에 옮기고, 21°C에서 10분간 초음파 세척(40 kHz, 연속) 가열합니다.
7. 샘플을 300mL 증류수로 두 번 세척하고, 60°C에서 200rpm에서 10분간 흔들고, 1850 × g 에서 25°C에서 15분간 원심분리기를 사용하세요.
8. 먼저 -80 °C에서 4시간 동안 뼈를 미리 동결한 후, 폭넓은 바닥에서 탈세포화된 뼈를 24시간 동안 동성하여 고르게 건조하고 0.05 mbar에서 -40에서 -60 °C에서 과도한 샘플 높이를 방지합니다.
   참고: (중요한 단계) 용기 내부 높이가 2–3cm를 넘지 않도록 하여 불완전한 동전 건조를 방지하세요.

4. 골 미세입자 준비

1. 탈세포화된 골 조각을 250mL 에를렌마이어 플라스크에 멸균 용액에 넣고, 균질화기를 사용해 균질한 흰색 용액을 얻을 때까지 균질화합니다(보충 영상 1).
2. 1850 × g 에서 25 °C에서 15분간 원심분리하고, 상청액을 버린 후 펠릿을 200rpm 25°C에서 300 mL 증류수로 두 번 휘저으며 10분간 세척합니다. 1850 × g 에서 25°C에서 15분간 최종 원심분리를 수행합니다.
3. 생성된 물질을 48시간 동안 냉동(0.05 mbar, -40에서 -60 °C)로 보관한 후 -80 °C에서 보관하여 사용 후까지 보관합니다.
4. 멸균된 세라믹 모르타르를 사용해 동생된 피질 또는 연수골을 기계적으로 분쇄하여 미세한 분말을 얻습니다(그림 1).
5. 분말을 200 μm 메쉬나 체에 통과시키고, 최종 재료를 무게로 재고 -80 °C에서 보관합니다.
   참고: (중요한 단계) 체를 걸기 전에 분말이 완전히 건조되어 응집과 입자 크기 부정확성을 방지하세요.

보조 영상 1: 뼈 균질 절차. 균질화된 골 조각을 균질화하여 균일한 흰색 현탁물이 생성될 때까지 균질화합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 1: 골 미세입자 준비. (A) OV5 균질화를 통한 탈세포화 후 -80 °C에 보관된 탈세포화된 골 조각. (B,C) 멸균된 세라믹 모르타르가 탈세포화된 뼈를 미세 분말로 분쇄하는 데 사용됨. (D) 체로 체를 거른 후 최종 탈세포화된 골 미세입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

5. 본 젤 제작

1. 10 w/v% GelMA를 50 °C의 9.5 mL 탈이온수에 용해하여 준비합니다.
2. 용액을 37°C로 냉각한 후 Irgacure 2959 광시작기 용액을 추가하세요.
3. 용액을 37 °C로 유지하고 0.22 μm 필터를 사용해 멸균 여과를 수행합니다.
4. 1% w/v 단위로 탈세포화된 골 미세입자(DBMP)를 추가하세요.
5. 40 °C에서 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 위아래로 섞고 피펫을 사용해 균질한 현탁액이 만들어져 골 젤(BG)을 형성합니다.
6. BG는 최대 2주간 4°C에서 보관하세요.
   참고: (중요한 단계) 세포 삽입 전에 하이드로겔을 젤링 온도(≥37 °C) 이상으로 유지하여 조기 굳어지지 않도록 하십시오.

6. 골세포 1차 배양

1. 골수 추출 및 초기 세척
   1. 무균 수술 기구를 사용해 대퇴골두 내부에서 골수 조직을 추출하여 다지는 것입니다(그림 2).
   2. 다진 조직을 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.
   3. α-MEM 배양 배양지에 항생제-항균류 용액(100 μg/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.25 μg/mL 암포테리신)을 보충하여 조직을 세 번 세척합니다.
   4. 헹크의 밸런스 솔트 솔루션(HBSS)으로 한 번 씻어내세요.
      참고: (중요한 단계) 세포 생존력을 유지하기 위해 조직 채취와 처리 사이의 시간을 최소화하세요.
2. 효소 소화
   1. 조직을 콜라게나제 타입 I 용액에 37°C에서 25분간 부드럽게 저어주며 배양합니다.
   2. HBSS로 세척하세요.
   3. 6.2.1–6.2.2 단계를 두 번 더 반복합니다(총 콜라겐제 소화 3회).
   4. 조직을 37°C에서 0.5 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)에 25분간 배양합니다.
   5. HBSS로 세척한 후 EDTA 단계를 두 번 더 반복하세요.
   6. 마지막으로 콜라겐제 1형 소화(37°C에서 25분)를 한 번 수행한 후 HBSS 세척을 합니다.
      참고: (문제 해결) 소화가 불완전하면 세포 수율이 낮아질 수 있습니다; 필요하다면 효소 배양 시간을 5분에서 10분 연장할 수 있습니다.
3. 세포 회복 및 배양
   1. 콜라겐제 용액을 수집하고 최종 HBSS 세척액을 50mL 원심분리관에 옮깁니다.
   2. 실온에서 1,000 × g 에서 5분간 원심분리기.
   3. 상원액을 버리고 펠릿을 2mL의 완전한 α-MEM에 재현탁합니다.
   4. 세포 현탁액을 두 개의 T75 배양 플라스크에 씨앗 뿌리고 37°C에서 5% CO₂와 함께 배양합니다.
      참고: 적절한 수합이 이루어질 때까지 배양지를 2-3일마다 교체하세요(그림 3).

그림 2: 골수 조직 채취. (A) 고관절 치환술로 얻은 대퇴골 두, 세포 분리에 사용되는 수질 부위를 보여줍니다. (B) 효소 소화 전에 멸균된 페트리 접시에 다진 연수 골 조각을 넣는 것. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 1차 골세포 배양. 골세포는 인간 수질골에서 분리된 후 T75 내에서 단일층으로 부착되어 증식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

7. 3D 세포 배양

1. BG 하이드로겔 양을 37°C에서 예열하세요.
   참고: (중요한 단계) 작업 공간에 외부 외풍이 없도록 하세요; 냉각은 조기 젤링을 가속화합니다.
2. 배양된 골세포를 분리하고 500 × g에서 15mL 튜브에서 5 분간 원 심분리합니다.
3. 펠릿을 200 μL 배양지에 재현탁한 후 BG 하이드로겔과 혼합하여 최소 1000 세포/μL(이하 바이오잉크)의 최종 세포 밀도를 얻습니다.
4. 1000 μL 피펫을 사용해 바이오잉크 50 μL을 흡입하고 증착할 때까지 37 °C에서 유지합니다.
5. 각 구성체당 50 μL의 바이오잉크를 배양판의 각 웰에 피펫팅합니다 (보조 영상 2); 실온에서 물리적 겔화를 위해 약 5분을 허용합니다(그림 4).
6. 각 웰을 365nm 자외선에 1분간 노출시켜 가역적 가교(0.30 J/cm²)를 달성합니다.
7. 배양지를 추가하고 37°C, 5%_CO2 에서 필요한 시간 동안 배양합니다. 각 시점마다 별도의 플레이트를 사용하세요.

그림 4: 3D 세포 배양 구성 물질 준비. 피펫팅 직후 UV(365nm) 가교 후 세포가 포함된 GelMA 구성물. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 영상 2: 3D 셀 구성 요소 준비. UV 가교 전에 간단한 피펫팅 기법을 사용해 하이드로겔-셀 혼합물을 12웰 플레이트에 증착합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

8. 생체적합성 검사

1. 생체/죽음 염색
   1. 원하는 시간 간격으로 세포가 포함된 비계를 배양합니다.
   2. 살짝 멸균된 PBS로 부드럽게 세척하세요.
   3. 0.2% 에티듐 호모디머-1(EthD-1)과 0.05% 칼세인 AM이 포함된 생/죽은 용액을 PBS에 넣어 어두운 상태에서 30분간 배양합니다.
   4. 칼세인 AM(~495/515 nm)과 EthD-1(~495/635 nm) 필터가 장착된 형광 현미경을 사용해 즉시 영상을 찍을 수 있습니다. 표준 형광세인 이소티오시아네이트(FITC)와 텍사스 레드 필터 세트는 각각 칼세인 AM과 EthD-1 검출과 호환됩니다.
   5. 녹색 세포질 형광으로 살아있는 세포를, 붉은 핵 형광으로 죽은 세포를 식별합니다.
      참고: 평면 이미지는 ImageJ(피지)를 사용해 처리할 수 있습니다. 대물렌즈, 노출 시간, 게인, 조명 강도는 비교된 모든 샘플에서 일정하게 유지되었으며, 신호 포화를 피하기 위해서만 조정되었습니다. 자가형광으로 인한 오해를 최소화하기 위해, 각 실험 내 모든 샘플에 동일한 획득 설정을 유지했으며, 세포가 없는 비계/뼈 미세입자 구조물의 대조 관찰을 사용하여 생체물질과 연관된 배경 형광 패턴을 인식하였다. 이러한 대조군 덕분에 이미지 해석 시 입자 유도 신호와 진짜 둥근 세포 염색을 구분할 수 있었습니다.
2. 알라마블루 양량화
   1. 5% 알라마블루 작업 용액을 완전한 배지에 준비하세요.
   2. 37°C, 5% CO₂에서 빛으로부터 보호된 채 alamarBlue 용액에 2.5시간 동안 배양합니다.
   3. 상청액 100 μL을 96웰 플레이트에 3회로 전달하며, 조절 부위도 포함합니다.
   4. 360/40 nm 여기와 460/40 nm 방출에서 형광을 측정합니다.
   5. 형광 값을 대조군에 정규화하여 상대적인 대사 활도를 결정합니다.

결과

일차 골세포는 인간 대퇴골두에서 성공적으로 분리되었으며, 추출 후 약 5일 후에 배양에서 검출되었습니다. 이 세포들은 별형 형태를 보였고, 골세포 형태학의 특징인 상호 연결된 네트워크를 형성하여 성공적인 분리, 부착 및 생존 가능성을 확인했습니다(그림 5).

그림 5: 3D 골세포 배양의 대사 활동. 각 시간 간격에서 골세포 함유 구조에 대한 Alamarblue 대사 분석법. 모든 복제에서 대조군에 비해 유의미한 차이가 관찰된다(ANOVA, P = 0.05).

토론

제시된 프로토콜은 3D 뼈와 유사한 구조물을 생성하는 접근 가능하고 번역적인 방법을 제공하며, 고가의 바이오프린터나 독점 행렬 의존과 같은 현재 접근법의 주요 한계를 해결합니다¹³. GelMA와 인간 탈세포화된 골세포외기질⁸을 결합함으로써, 표준 실험실 장비만으로도 생리학적으로 적합한 구조물을 제작할 수 있습니다. 이러한 단순함은 자원이 제한된 환경에서 채택을 가능하게 하면서도 근골격계 질환 메커니즘을 연구하는 데 필수적인 단서를 보존할 수 있게 합니다. 1차 인간 골세포¹⁴와 임상 골 조직의 사용은 환자 관련 뼈 질환 모델링과 생체물질 반응 평가를 지원함으로써 번역 적용성을 더욱 강화합니다 ^6,15. 이 플랫폼을 기반으로 골다공증 유래 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure 2959)	Sigma-Aldrich	410896-10G	하이드로겔 중합 광개시제
AlamarBlue 세포 생존율 시약	Invitrogen	DAL1100	정량적 생존율 분석용
Antibiotic-Antymycotic (100´)	Gibco	15240-062	배양 배지 성분
세포 배양 플라스크 (T75)	SPL Life Sciences	70075	골세포 배양용
Collagenase Type 1	Gibco	17100-017	골 샘플의 효소 분해용
원추형 튜브, 15 mL	SPL Life Sciences	50015	하이드로겔 준비용
DarkDawn D15-365 nm	DarkDawn	-	하이드로겔의 UV 교차 연결용
DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음	gibco	21600069	하이드로겔 용매, LIVE/DEAD 키트 용매
EDTA 디나트륨 염 2-HID	Winkler	ED-0760	골 샘플의 효소 분해용
Eppendorf 원심 분리기 5702	Eppendorf	5702000010	뼈 미세 입자 준비용
순도 분석용 절대 에탄올	Supelco	1,00,98,32,511	뼈 탈세포화용 (70%로 희석), 광개시제 용매
산화 방지제 혈청	Gibco	A52567-01	배양 배지 성분
돼지 피부 젤라틴	Sigma-Aldrich	G1890-500G	하이드로겔 성분
HBSS (10´)	Gibco	14185-052	골수 샘플 세척용
L-아스코르브산 2-인산염	Sigma-Aldrich	A8960-5G	배양 배지 성분
LIVE/DEAD 생존율/세포 독성 키트	Invitrogen	L3224	정량적 생존율/세포 독성 분석용
MEM Alpha (1´)	Gibco	12571-063	배양 배지 성분
메타크릴산 무수물	Sigma-Aldrich	276685-500G	하이드로겔 성분
마이크로 원심 분리기 튜브	Citotest	4610-1844	알라마르블루 및 LIVE/DEAD 염료 준비용
NuncIon delta surface	Thermoscientific	150628	시약 접종용 12웰 플레이트
OLYMPUS BX43 형광등 소스 Olympus U- LH100HG	Evident	U- LH100HG	형광 분석 광원
RC-6 Plus 원심 분리기	Thermo Scientific Sorvall	46910	뼈 탈세포화 및 뼈 미세 입자 준비용
Synergy HTX 멀티모드 리더	BioTek Instruments	-	분광 광도계
바늘이 달린 주사기	NIPRO	SY3-WN-R-03	하이드로겔 필터링용
조직 배양 플레이트 96웰	Jet Biofil	TCP001096	알라마르블루 생존율 분석용 96웰.
초음파 세척기	VWE	97043-958	뼈 샘플의 초음파 처리용