대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사에 대해 계피피질을 탐색하기 위한 네트워크 약리학 및 실험적 검증

요약

본 연구는 네트워크 약리학, 분자 역학 시뮬레이션, 동물 실험을 통합하여 대퇴골두의 골괴사 치료에서 시나모미 피질의 잠재적 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 합니다.

초록

대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사(SONFH)는 심한 통증과 이동성 제한을 유발하여 환자의 삶의 질을 크게 저하시킵니다. 시나모미 피질(CC)은 이 상태를 효과적으로 완화하는 것으로 나타났지만, 그 작용 기전은 아직 명확하지 않습니다. 본 연구는 CC의 활성 화합물을 규명하고 SONFH에서 그 기전을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 활성 성분은 HERB 2.0, PubChem, SwissADME 데이터베이스를 사용하여 선별되었고, 해당 표적은 스위스 표적 예측 데이터베이스를 통해 예측되었습니다. SONFH의 표적은 GEO, DisGeNET, GeneCards, OMIM 데이터베이스의 표적과 화합물 관련 표적을 교차하여 식별되었습니다. STRING 데이터베이스를 이용해 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 구축하였고, DAVID 데이터베이스를 통해 GO 및 KEGG 농축 분석을 수행하였습니다. 가장 유망한 화합물-표적 상호작용은 분자 도킹(MD) 및 분자 역학 시뮬레이션을 통해 검증되었습니다. 연구진은 AKT1, HIF-1α, STAT3가 중심 결절 역할을 하는 61개의 SONFH 관련 표적을 포함해 563개의 잠재적 표적을 확인했습니다. KEGG 농축 분석은 HIF-1α 신호전달 경로가 핵심 메커니즘임을 강조했습니다. 더 나아가, 동물 실험에서는 SONFH를 이용한 마우스 모델에서 CC의 활성 비율이 대퇴골 두부 구조 손상을 효과적으로 완화한다는 것이 입증되었습니다. 연구 결과는 CC가 저산소 적응을 조정하고 혈관신생 및 골형성을 조절함으로써 SONFH를 개선할 수 있음을 시사합니다.

서론

대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사(SONFH)^{는 여러 가지} 요인으로 인해 대퇴골두로 가는 혈류가 교란되거나 감소하여 발생하는 심각한 골관절 질환입니다. 골세포와 골수 구성 요소의 사소는 대퇴골두의 구조적 손상과 고관절의 기능 장애를 초래합니다^. 임상적으로 환자들은 일반적으로 고관절 통증과 움직임 제한을 겪습니다^. 효과적인 치료가 없으면 SONFH 환자의 80%가 대퇴골두부 허탈로 진행되어 전고^{관절 치환}술이 필요하다. 이는^{환자들에게} 심각한 심리적 압박과 무거운 경제적 부담을 안겨줍니다. 임상 실무에서는 SONFH 치료를 위해 항응고제, 섬유소용해제, 혈관 확장제, 지질 저하 약물의 조합 사용을 권장하며, 이는 어느 정도 임상 잠재력이 입증되었으나 일반적으로 치료 효능이 제한적입니다.

전통 중의학(TCM)은 SONFH⁷ 치료에 긍정적인 영향을 점점 더 입증하고 있습니다. 중의학은 증상 완화, 질병 조절, 관절 가동성 향상 및 환자의 삶의 질 향상에 잠재력을 보여준다⁸. 임상적으로 CC와 그 성분들은 SONFH 개선에 광범위하게 사용되었으며, 주목할 만한 효과를 보였습니다^. CC에서 발견되는 수많은 생리활성 물질은 항염증, 항산화, 혈관신생 촉진, 미세 순환^{개선 등 다양한} 생물학적 작용을 가지고 있습니다. 골 조직 공학과 대사 분야의 이전 연구들은 CC의 주요 활성 성분인 시나말데히드가 뼈 재형성과 관련된 신호 전달 경로를 조절할 수 있음을 입증했습니다¹¹. 초기 연구는 유귀 알약(YGPs)이 혈관신생을 촉진하고 염증 반응을 증진함으로써 SONFH에 치료 잠재력을 가진다는 것을 시사했다¹². YGPs에서 주권 약물인 CC는 양을 따뜻하게 하고 기를 이롭게 하며 경락을 뚫어 SONFH¹³에 유익한 치료 효과를 냅니다. 그럼에도 불구하고, 그 효능의 정확한 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. CC가 SONFH를 개선하기 위해 사용하는 다중 표적 조절 네트워크를 명확히 하는 것은 그 약리학적 성격을 이해하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 합리적인 임상적 사용과 관련 완화 창출을 장려할 것입니다. 생물정보학과 네트워크 약리학을 통합하는 것은 작용 기전을 밝히는 효과적인 접근법을 제공합니다¹⁴.

네트워크 약리학은 허브 내 생리활성 성분을 식별하고 이러한 약물 성분과 유전자 표적 간의 연관성을 예측할 수 있습니다¹⁵. MD는 후보 활성 화합물과 주요 치료 표적 간의 결합 상호작용을 검증하는 데 사용됩니다. 분자 역학은 뉴턴 역학을 사용하여 이동 시뮬레이션¹⁶을 통해 리간드-수용체 결합의 안정성과 유연성을 평가합니다. 저자들은 네트워크 약리학, MD, 분자 역학 시뮬레이션을 통해 CC가 SONFH에 미치는 잠재적 영향을 포괄적으로 조사하였습니다. 이 연구 결과는 SONFH 개선을 위한 CC의 약역학적 재료 기초와 기전에 대한 향후 심층 연구에 참고 자료를 제공합니다. 연구 흐름도는 그림 1에 나와 있습니다.

프로토콜

모든 실험 프로토콜은 저장중의학대학교 동물실험윤리위원회(IACUC-20240708-22)의 승인을 받았으며, 국립보건원에서 발행한 실험동물 관리 및 사용 가이드를 준수하였습니다. 이 실험에서는 20에서 22g 사이의 10주 된 암컷 C57BL/6J 마우스 20마리가 사용되었습니다. 이 쥐들은 저장중화의과대학 동물센터에서 확보되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 시약, 장비 및 소프트웨어 목록은 재료 표를 참조하십시오.

CC의 활성 화합물 및 표적 스크리닝
CC의 화학 화합물은 Herb 2.0¹⁷ 을 사용하여 "CC"라는 키워드로 확인되었습니다. PubChem ID가 없거나 같은 ID를 가진 화학물질은 걸러졌습니다. 그 후 중복 부위를 병합하고 제거하여 CC에 해당하는 목표 부위를 얻습니다. PubChem 데이터베이스¹⁸ 을 사용하여 Lipinski의 5법칙(Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹에 따라 초기 선별을 수행합니다. 저자들은 PubChem 데이터베이스를 사용하여 각 화학 화합물의 SMILES 표현을 결정합니다. SwissADME 데이터베이스를 사용하여 저자들은 약물유사성²⁰에서 '높은' GI 흡수 제한과 ≥2개의 '예' 값을 가진 화합물을 선정했습니다. 스위스 타겟 예측 데이터베이스²¹ 을 활용하여 확률이 0보다 높은 타깃 단백질을 추출하세요. 그 후 중복 사이트를 병합하고 제거하여 CC에 해당하는 목표 사이트를 얻습니다.

SONFH와 관련된 유전자 표적 편집
SONFH 관련 표적은 데이터베이스에서 얻었습니다: DisGeNET 데이터베이스²²; GeneCards 데이터베이스²³; OMIM 데이터베이스²⁴와 GEO 데이터베이스²⁵. 저자들은 OMIM과 DisGeNET 데이터베이스에서 SONFH 유전자를 다운로드하여 중복 제거했습니다. 중복 표적을 제거한 후 총 233개의 질병 관련 표적을 GeneCards 데이터베이스에서 얻었습니다. 회수된 모든 표적은 0 이상의 관련성 점수를 가지며 후속 분석에 포함되었습니다. 회수된 유전자들의 최소 관련성 점수는 6.48이었습니다. SONFH와 관련된 차별발현 유전자(DEG)는 GEO 데이터베이스의 GPL15207 플랫폼에서 GSE123568 시리즈에서 얻어졌습니다. 배치 효과는 R에서 limma 패키지를 사용하여 보정하였고, |logFC| 기준에 따라 차별발현 유전자(DEG)가 확인되었습니다. > 1과 P < 0.05²⁶. ggplot2 패키지를 활용해 DEG 분포를 시각화하기 위한 화산 플롯을 만들었고, 결과를 발표하기 위한 히트맵도 제작되었습니다. SONFH 질병 표적 라이브러리는 R의 Venn 패키지를 사용해 중복 표적을 제거하여 구축되었습니다.

PPI 네트워크 설립
CC 및 SONFH 관련 목표물의 활성 성분의 예상 목표물을 기반으로 Venny 2.1.0²⁷에 의해 벤 다이어그램이 생성되었습니다. PPI 데이터를 획득하기 위해 저자들은 이 표적들을 STRING 데이터베이스에 가져왔습니다²⁸. 이 생물의 선별 기준의 한계는 신뢰 지수가 ≥0.4인 '호모 사피엔스'였다. 저자들은 Cytoscape 3.7.2를 사용하여 PPI 네트워크 핵심 타겟을 확립했습니다. PPI 네트워크 핵심 목표를 조사하는 데 차도 중심성(DC)을 사용했습니다. 매개변수 필터는 중앙값의 두 배 이상입니다. 주요 목표를 추가로 지정하기 위해 Cytoscape의 추가 기능이 사용되었습니다.

유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 데이터베이스를 사용하여 풍부 분석을 수행했습니다
CC와 SONFH의 공통 표적은 DAVID 데이터베이스를 통해 GO 및 KEGG 농축 분석을 위해 분석되었습니다²⁹. 상위 10개의 GO 용어와 상위 20개의 KEGG 경로를 시각화하기 위해 Wei Sheng^{Xin 30} 을 사용해 enrichment dot bubble 차트를 그렸습니다.

네트워크 건설
SONFH 완화에 대한 CC의 분자 기전은 허브-화합물-표적(H-C-T) 및 화합물-표적-경로(C-T-P) 네트워크를 통해 밝혀졌습니다. Cytoscape 3.10.3 소프트웨어는 네트워크를 설명했습니다. H-C-T 네트워크는 CC의 활성 화합물과 그 공유 표적을 사용하여 개발되었습니다. 그 다음 네트워크 분석 도구를 사용하세요. 경로, 화합물, 표적 간의 관계를 이해하기 위해, 상위 20개 경로와 관련 표적 및 화합물을 Network Tools에 의해 C-T-P 네트워크로 조직되었습니다.

주력 검증
핵심 목표인 HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3, EGFR은 PPI 분석을 통해 얻었습니다. 목표물은 유니포트 데이터베이스³¹ 에서 인간 제한 하에 검색되었고, RCSB PDB 데이터베이스³²에서 검토되었습니다. 비교적 높은 해상도의 인간 단백질 구조가 선정되었습니다. 활성 성분은 C-T-P 네트워크에서 확인되었습니다. 이들의 대응하는 3D 구조는 PubChem 데이터베이스에서 mol2 형식으로 다운로드되었습니다. 각 파일은 Chem3D에서 열었고, 에너지는 최소화되었습니다. 그 후 저자들은 AutoDockTools³³ 소프트웨어를 사용해 수용체 단백질의 탈수, 수소화, 가스타이거 전하 계산을 수행했습니다. 리간드와 수용체 모두 PDBQT 형식으로 유지되었습니다. 공간적 위치와 결합 능력을 바탕으로 저자들은 도킹의 실현 가능성과 안정성을 평가합니다. AutoDock Vina를 통해 도킹 그리드 박스와 대분자가 예측되었습니다. 이 연구에서는 리간드의 모든 회전 가능한 결합이 자유롭게 회전하도록 허용되었고, 수용체는 강하게 설정되었다. 도킹 점수는 수용체와 리간드 간의 결합 친화도를 나타냅니다; 점수가 낮을수록 결속 친화도가 높아집니다. 이 원칙에 따라 저자들은 가장 유리한 결합 에너지를 가진 구조를 선택하여 리간드와 단백질의 결합 상호작용을 조사합니다. 이 시각적 결과는 PyMOL에서 발표되었습니다.

분자 역학 시뮬레이션
분자 역학 시뮬레이션은 CHARMM36 힘장을 이용한 GROMACS³⁴를 사용해 수행되었습니다. 단백질-리간드 복합체는 최소 용질 박스 거리 1.0 nm의 입방체 주기 시뮬레이션 박스 내에 배치되었고, 시스템은 SPC216 물 모델을 사용해 용해되었습니다. 이 시스템은 적절한 Na⁺ 및 Cl⁻ 카운터이온을 첨가하여 중화되었습니다. 에너지 최소화는 가장 가파른 하강 알고리즘과 이어서 불리한 원자 접촉을 제거하기 위해 켤레 기울기 방법을 순차적으로 수행했습니다. 장거리 정전기 상호작용은 입자 메쉬 에발트(PME) 방법으로 10 Å의 컷오프 거리를 사용하여 계산되었습니다. 수소 원자를 포함하는 모든 공유 결합은 LINCS 알고리즘을 사용하여 제약되었습니다. 온도는 V-재조정 온도조절기를 사용해 300 K로 유지되었고, 압력은 등방성 결합 방식으로 베렌센 기압기로 1바에서 조절되었습니다. 평형 단계에서 위치 제한이 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² 의 힘 상수로 리간드에 가해졌습니다. 에너지 최소화 후, 시스템은 2 ns NVT와 2 ns NPT 시뮬레이션으로 평형화되었고, 이어서 2 fs 시간 단계로 100 ns 생성 분자 역학 시뮬레이션이 진행되었습니다. 원자 좌표는 이후 궤적 분석을 위해 10 p마다 기록되었다.

SONFH 마우스 모델에서의 실험적 검증
동물과 SONFH 모델 설립
저장 중화의과대학 동물센터에서 10주 생후 20에서 22g 사이의 암컷 C57BL/6J 마우스 20마리를 확보하였습니다. 쥐들은 통제된 환경에서 7일간의 적응 기간을 거쳤고, 음식과 물을 제한 없이 섭취할 수 있었습니다. 모든 쥐는 무작위로 그룹별로 배정되었습니다(n=5마리): 대조군, SONFH 그룹, SONFH + CC 저용량(CC-저용량, 7.5 g/kg/d) 그룹, SONFH + CC 고용량(CC-고용량, 15 g/kg/d) 그룹입니다. SONFH 모델은 앞서 설명한 대로 확립되었습니다. 간단히 말해, SONFH, SONFH + CC-Low, SONFH + CC-High 그룹의 쥐들은 0일차에 지질다당류(LPS; 20 μg/kg) 정맥 주사를 두 차례 받았습니다. 이후 LPS 주사 24시간 후 24시간 간격으로 메틸프레드니솔론(MPS; 40 mg/kg)을 근육 주사 3회에 투여하였다. 치료군 쥐들은 마지막 MPS 주사 날부터 6주 동안 매일 경구 가비지를 통해 CC 추출물을 투여받았습니다. 대조군 쥐들은 해당 시점에 동등한 양의 식염수를 투여받았다.

샘플 채취 및 준비
6주간의 치료 기간이 끝날 무렵, 쥐들은 안락사되었습니다. 양측 대퇴골 머리는 신중하게 해부되어 채취되었다. 각 동물에 대해 왼쪽 대퇴골 머리는 4°C에서 48시간 동안 고정되어 이후 탈석화와 파라핀 박박을 시행했습니다. 오른쪽 대퇴골 두는 고정된 후 탈석화 없이 직접 마이크로 CT 스캔에 사용되었습니다.

조직학적 분석(ABH 염색)
탈석화 및 파라핀 삽입 후, 대퇴골 두부 절편은 Alcian Blue/Hematoxylin(ABH) 프로토콜을 사용하여 골괴사 변화를 평가하였습니다. 간략히 1% 알시안 블루(pH 2.5)로 30분간 염색한 후 세척한 후 해리스 헤마톡실린으로 교환 염색했습니다. 탈수 후 장착 후 슬라이드는 광학 현미경으로 촬영되었습니다. 골괴사의 정량화는 ImageJ 소프트웨어를 사용한 두 명의 맹인 관찰자가 수행했습니다. 빈 결석의 비율은 연골하부 영역 내 샘플당 세 개의 무작위 고배율 필드에서 (빈 결핍 수/총 결공 수)× 100%로 계산되었습니다. 피크노틱 핵의 비율도 유사하게 결정되었다.

마이크로 컴퓨터 단층촬영(Micro-CT) 분석
대퇴골두의 3차원 뼈 미세구조는 고해상도 마이크로 CT 스캐너를 사용해 분석되었습니다. 고정된 시료는 10 μm(70 kV, 114 μA) 해상도로 스캔되었습니다. 주요 체중 부하 부위를 포함하는 표준화된 구형 관심 부피(VOI)를 CTAn 소프트웨어를 사용해 재구성하고 분석하였다. 다음과 같은 형태계측 매개변수가 정량화되었습니다: 골수/총부피(BV/TV), 소모 두께(Tb.Th), 그리고 소모 분리(Tb.Sp).

면역형광(IF) 염색
골 미세환경을 평가하기 위해 파라핀 절편에 면역형광 염색이 시행되었습니다. 항원 추출 및 차단 후, 다음 1차 항체(토끼 항-HIF-1α(1:200), 토끼 항-ALP(1:300), 토끼 항-VEGF(1:150)와 함께 4°C에서 절편을 하룻밤 인큐베이팅하였다. 세척 후에는 형광포체 결합된 2차 항체(Alexa Fluor 488 표지된 염소 항토끼 IgG, Alexa Fluor 555 표지된 염소 항토끼 항 IgG)로 절편을 배양하였습니다. 핵은 DAPI로 염색되었습니다. 이미지는 일정한 노출 설정 하에서 형광 현미경을 사용해 촬영되었습니다. 각 마커의 상대적 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용해 샘플당 세 개의 필드에서 정량화하였습니다.

통계 분석
모든 정량적 데이터는 평균 표준편차(SD)± 제시됩니다. 분산의 일방향 분석(ANOVA)과 Tukey의 사후 검정을 GraphPad Prism 소프트웨어(버전 9.0)를 사용해 그룹 간 통계적 유의성을 판단하였습니다. P값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의미하다고 간주되었습니다.

결과

CC의 활성 구성 요소 및 예측 목표물 식별 및 "H-C-T" 네트워크 개발.
SONFH 개선에서 CC의 주요 성분과 표적의 기전을 탐구하기 위해, 저자들은 HERB 2.0 데이터베이스를 사용하여 스크리닝된 모든 CC 성분을 식별하였습니다. CC의 209개 활성 성분 중 85가지가 유력한 생물 활성 화합물이 발견되었습니다(보충표 1). 스위스 목표 예측 플랫폼을 사용해 중복 및 무효 항목을 제거한 결과, 이 CC 구성 요소에 해당하는 563개의 추정 목표가 얻어졌습니다(보충표 2). 저자들은 CC의 활성 성분과 표적을 확인했습니다.

SONFH의 발현 및 진행에 관여하는 분자 기전을 조사하고, 잠재적 바이오마커 표적을 규명하는 것. GEO 데이터베이스의 GSE123568 데이터셋 분석 결과, SONFH와 관련된 DEGs가 확인되었으며, 여기에는 207개의 상향 조절 유전자와 216개의 하향 조절 유전자가 포함되어 있습니다. 425개의 DEG의 화산 그래프는 그림 2A에 나타나 있으며, 상위 60개의 DEG의 표현 패턴은 표식 수준별로 순위별로 순위가 매겨진 히트맵으로 그림 2B에 표시되어 있으며, 색상 강도는 로그 변환된 표현 값을 반영합니다. DisGeNET, OMIM, GeneCards 데이터베이스는 SONFH와 연계된 711개의 표적을 제공했습니다. GEO 데이터베이스의 425개 DEG를 합산하면 총 1136개의 목표가 SONFH와 연결되어 있습니다. 중복 제거 후 1115개의 SONFH 관련 표적이 확인되었으며, 이는 그림 2C에 나타난 것입니다. 저 자들은 SONFH의 질병 표적 라이브러리를 예비적으로 구축했습니다.

표적과 주요 성분을 식별하기 위해, CC의 563개 표적과 1115개의 SONFH 관련 표적 간의 교차 분석을 통해 61개의 공통 표적(그림 3A 및 보충표 3)이 확인되었으며, 이들은 Cytoscape 3.10.3에 도입되어 "H-C-T" 네트워크를 구축했습니다(그림 3B). 이 네트워크는 147개의 노드와 413개의 엣지로 구성되어 있었습니다. 위상학적 분석 결과, (s)-4-노나노라이드(degree:16), 아이소호모게놀(degree:15), 네릴 아세테이트(degree:14), 멜릴로토카르판 A(degree:14), 3-메톡시시나말데히드(degree:13)가 단백질 표적과의 가장 높은 연결성을 보였다.

PPI 네트워크의 개발 및 위상 평가.
SONFH 개선을 위한 CC의 목표 사항을 더 깊이 탐구하기 위해. 61개의 동일한 표적이 STRING 데이터베이스에 입력된 후 PPI 네트워크를 보기 위해 Cytoscape 3.10.3이 사용되었습니다. 네트워크에는 463개의 엣지와 60개의 노드가 있었습니다. 그림 4A에서는 노드가 색상과 크기가 밝고 작다가 어둡고 커지면서 전환되며, 이는 낮은 곳에서 높은 곳으로 증가함을 나타냅니다. MCODE 플러그인은 이 목표들을 두 개의 기능 모듈로 클러스터링하는 것을 용이하게 했으며(그림 4A), 클러스터 1에는 23개의 노드와 216개의 엣지가 포함되어 점수는 19.636이었습니다. 네트워크 아키텍처를 더 자세히 특징짓기 위해 DC, BC, CC가 위상 지표로 사용되었습니다. 이 매개변수들의 중앙값을 컷오프 포인트로 설정하여, 저자들은 8개의 활성 표적을 확인했습니다(그림 4B). CytoHubba 플러그인은 MCC 알고리즘을 활용해 노드를 순위화하여 상위 10개의 유전자를 식별했습니다. (그림 4C).

GO 농축 분석
ONFH 완화에서 CC의 메커니즘을 더 깊이 탐구하기 위해, BP, CC, MF를 활용해 61개의 잠재적 표적에 대해 GO 농축 분석을 수행하였습니다. 총 435개의 고(GO) 용어가 풍부화되었으며, 이 중 293명은 BP 용어, 41명은 CC 용기, 101명은 MF 용어였습니다. 이 결과는 보충표 4, 5, 6에 나와 있습니다 . 그림 5A 는 버블 차트를 사용해 상위 10개의 강화 B, CC, MF 용어를 시각적으로 보여줍니다. 연구 결과는 BP 용어가 주로 신호 전달, RNA 중합효소 II에 의한 전사 양성 조절, 세포자멸 과정의 음성 조절, DNA 템플릿 전사의 긍정적 조절, RNA 중합효소 II에 의한 전사 음의 조절과 관련이 있음을 나타냈다. 분석 결과 MF 항들은 주로 단백질 결합, 금속 이온 결합, 동일 단백질 결합에 관여함을 밝혀냈습니다. CC 결과는 대부분의 표적이 주로 세포질, 막, 그리고 원형질에 위치함을 보여주었습니다.

KEGG 분석
CC가 SONFH를 개선할 수 있는 잠재적 생화학적 메커니즘에 대한 정보를 제공하기 위해, KEGG 경로 농축 분석을 수행하여 CC가 SONFH를 완화할 수 있는 생화학적 기전을 밝히려 하였습니다. P < 0.05, FDR < 0.05의 스크리닝 기준을 사용하여 48개의 KEGG 농축 항목을 확인하였습니다(보충표 7). 폴드 풍부도와 개체수로 결정된 상위 20개의 유의미하게 농축된 경로는 버블 플롯과 막대 플롯을 사용해 시각화되었습니다(표 1, 그림 5B 및 5C). Cytoscape 3.10.3을 사용하여 167개의 노드와 589개의 엣지로 구성된 C-T-P 네트워크가 구축되었습니다(그림 5D). CC의 SONFH에 미치는 영향은 주로 Kaposi 육종 관련 헤르페스바이러스 감염, HIF-1 신호 전달 경로, 지질 및 동맥경화와 연관되어 있으며, 이는 GO 기능 및 KEGG 경로 풍부화 분석에서 나타난다.

의학 검증
활성 화합물과 주요 표적 간의 잠재적 상호작용을 평가하기 위해, C-T-P 네트워크의 10개 화합물(아네톨, 멜릴로토카판 A, 네릴 아세테이트, 카프릴산, 아이소호모제놀, 3-메톡시시나알데히드, (s)-4-노나놀라이드, 마이리스티신, 보르네올, 시나밀 아세테이트를 주요 표적 AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC, EGFR와 결합하였다. 모든 화합물-표적 쌍의 결합 결과는 보충표 8에 요약되어 있으며, 화합물, 표적, 도킹 매개변수에 대한 자세한 정보는 보충표 9에 제공되어 있습니다. 그림 6 은 결합 에너지 분포의 열맵을 보여줍니다.

전반적으로 여러 화합물-표적 쌍은 비교적 유리한 결합 친화도를 보였으며, 결합 에너지 값이 낮을수록 예측 상호작용이 더 안정적임을 나타냈다. 특히, 도킹 결과는 화합물과 표적 간 결합 친화도에서 명확한 이질성을 보여주었다. 멜릴로토카르판 A와 같은 일부 화합물은 여러 표적에서 비교적 강한 결합 친화력을 일관되게 보인 반면, 다른 화합물들은 보다 중간 정도 또는 약한 상호작용을 보여, 서로 다른 화합물이 예측된 약리학적 효과에 불균등하게 기여할 수 있음을 시사한다.

또한 표적별로 변동성도 관찰되었습니다. 예를 들어, STAT3와 EGFR과 같은 특정 표적은 여러 화합물에 대해 비교적 중간 정도 또는 약한 결합 친화도를 보였으며, 일부 값은 AKT1이나 SRC와 같은 표적에 비해 -5.0 kcal/mol에 근접했습니다. 이 패턴은 모든 핵심 표적이 반드시 확인된 화합물의 직접적인 고친화력 결합 파트너로 기능하는 것은 아니며, 대신 상호작용 네트워크 내에서 간접적인 조절 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 이러한 차이는 리간드와 단백질 결합 부위 간의 구조적 적합성 변화, 그리고 표적의 고유한 특성과 관련이 있을 수 있습니다.

평가된 쌍 중 AKT1은 멜리로토카판 A와 결합 에너지가 가장 낮았으며(-9.6 kcal/mol), 이는 잠재적으로 유리한 상호작용을 시사합니다. 그림 7 은 이 복합체의 예측된 결합 방식을 보여줍니다. 특히 AKT1의 SER205는 멜릴로토카르판 A, 아네톨, 마이리스티신과 수소 결합을 형성합니다. 또한 멜릴로토카르판 A는 HIF-1α의 GLY309, STAT3의 LEU438과 THR440, ESR1의 SER433과 ARG412, SRC의 ARG500과 GLU510과 수소 결합을 형성할 것으로 예측되었습니다.

대표적인 후보 화합물을 식별하기 위해 각 표적에 대한 가장 낮은 결합 에너지를 사용했고, 결합 에너지 ≤임계값을 -5.0 kcal/mol로 설정하여 비교적 안정적인 상호작용을 나타냈습니다. 이 기준에 근거하여 멜리로토카르판 A, 아네톨, 마이리스티신이 잠재적 주요 화합물로 확인되었습니다. 전반적으로 CC의 활성 성분 대부분은 선택된 치료 표적과 잠재적 상호작용을 보였으며, 일부 화합물은 여러 표적에서 상대적으로 강한 결합 경향을 보였습니다. 하지만 MD는 잠재적 상호작용에 대한 예비 예측을 제공하는 단순화된 계산 접근법이며, 단백질의 유연성과 복잡한 생물학적 환경을 완전히 반영하지 못할 수 있다는 점을 유념해야 합니다. 따라서 이 결과들은 신중하게 해석되어야 하며, 관찰된 상호작용이 직접 결합의 결정적 증거가 되지는 않습니다.

분자 역학 시뮬레이션
복합체의 안정성을 추가로 평가하기 위해, 연구진은 분자 역학 시뮬레이션을 위해 AKT1-멜릴로토카르판 A, HIF-1α-멜릴로토카르판 A, STAT3-멜릴로토카르판 A 복합체를 선택하였습니다. 예측 대상 중 STAT3와 HIF-1α는 PPI 네트워크에서 중심적 역할과 SONFH 병리학과의 생물학적 관련성을 바탕으로 MD 시뮬레이션에 선정되었습니다. STAT3는 PPI 네트워크에서 가장 높은 연결 수준 중 하나를 보여주었으며, 이는 다중 신호 경로에서 잠재적 조절 역할을 시사합니다. HIF-1α는 KEGG 농축 분석 결과 HIF-1 신호 전달 경로가 골괴사에서 혈관 신생 및 저산소 적응과 가장 관련 있는 경로 중 하나임을 확인했기 때문에 선택되었습니다.

동시에 저자들은 AKT1이 강한 도킹 점수와 SONFH의 병리학적 특징, 특히 저산소증 유발 혈관 신생 및 골 재생과 직접적인 관련성을 고려하여 대표 표적으로 주목했습니다. 계산 자원 제한으로 인해 세 가지 대표적인 복합체가 상세한 MD 시뮬레이션을 위해 선택되었으며, 이는 네트워크 약리학 기반 분자 시뮬레이션 연구에서 일반적으로 채택되는 전략입니다. 평균근 편차(RMSD)는 단백질-리간드 복합체의 구조적 안정성을 효과적으로 평가하며, 값이 낮을수록 구조적 안정성이 더 높음을 나타냅니다. 그림 8A에서 보듯, AKT1-멜릴로토카르판 A 복합체는 처음 12 ns 이내에 이완을 완료했고, 이후 50-55 ns 정도의 일시적 변동만 관찰된 후 빠르게 평형 상태로 돌아왔다. 시뮬레이션 전체 RMSD는 약 0.369 nm였습니다. 그림 8B는 HIF1A-멜릴로토카르판 A 복합체가 처음 16 ns 이내에 이완을 겪었고, 이후 안정적인 정체기를 유지했음을 보여줍니다. 38 ns 사이에서 42 ns 사이로 잠시 변동이 있었고, 이후 급격한 재안정화가 관찰되었습니다. 이 복합체의 전체 RMSD는 0.25 nm였습니다. 그림 8C에서 STAT3-멜릴로토카르판 A 복합체는 0.3 ns 이내에 이완을 겪었고, 이후 안정된 정체기에 도달했다. 짧은 변동은 5 ns 사이에서 80 ns 사이에서 발생했습니다. 전체 시뮬레이션 거리는 약 0.21 nm였습니다. AKT1-멜리로토카르판 A, HIF-1α-멜릴로토카르판 A, STAT3-멜릴로토카르판 복합체는 눈에 띄는 변화 없이 안정성을 유지하여 비교적 안정적인 조합임을 시사합니다.

단백질 내 아미노산 잔기의 유연성은 평균평균근 변동(RMSF)을 사용하여 평가하였다. 그림 9A에서 볼 수 있는 평균 전 잔류 변동은 약 0.17 nm로, 안정성이 주로 구조 코어와 결합 주머니에 의해 유지되었음을 시사합니다. 더 높은 유연성은 주로 포켓 코어보다는 터미널 세그먼트나 루프 영역과 같은 본질적으로 이동성 있는 영역에 국한되었습니다. 이 지역들이 본질적으로 유연하다는 것은 잘 알려져 있습니다. 그림 9B 는 약 94%의 잔기에서 0.20 nm 미만의 RMSF 값을 보였고, 0.30 nm를 초과하는 비율은 약 6%에 불과함을 보여주며, 이는 전체 단백질 골격과 내부 잔기가 안정적인 범위 내에서 변동했음을 나타냅니다. 그림 9C는 평균 전 지구 잔기량이 약 0.17 nm임을 보여줍니다. 데이터에서 0.15 nm를 초과하는 변동은 확인되지 않아, 결합 주머니가 시뮬레이션 내내 안정적인 구조를 유지했음을 나타냈다. AKT1-멜리로토카르판 A와 HIF-1α-멜리로토카르판 A 복합체 모두 강하고 안정적으로 상호작용하는 것으로 입증되었습니다.

수소 결합은 단백질-리간드 상호작용을 촉진하는 데 매우 중요합니다. 그림 10A 는 AKT1-멜릴로토카르판 A 복합체가 일반적으로 하나의 수소 결합을 형성하며, 수소 결합의 수는 0에서 2 사이로 변함임을 보여줍니다. 멜릴로토카르판 A와 HIF-1α 사이에서는 0.35 nm 미만의 간격이 있습니다. AKT1은 멜리로토카르판 A와 자주 인접해 상호작용합니다. HIF-1α-멜리로토카르판 A 복합체는 주로 하나의 수소 결합을 형성하는 0에서 2개의 수소 결합을 형성하며, 이는 그림 10B에 나타난 것입니다. 그림 10 C에서 STAT3-멜릴로토카판 A 복합체의 수소 결합 수는 0에서 4까지 다양합니다. 대부분의 경우, 멜릴로토카르판 A와 HIF-1α 사이의 A 원자는 0.35 nm 미만의 간격으로 분리됩니다. HIF-1α-멜릴로토카르판 A 복합체는 1-3쌍의 밀접 접촉을 형성하며, 때로는 7-9쌍의 밀접 접촉을 형성하기도 합니다. 이는 소분자와 표적 단백질 간의 효과적인 수소 결합 상호작용을 시사합니다. 요약하자면, AKT1-멜릴로토카르판 A와 HIF-1α-멜릴로토카르판 A 복합체 모두 안정성과 강도를 보입니다.

CC는 SONFH 마우스의 염증 반응과 세포자멸사를 억제합니다
ABH 염색을 이용한 조직학적 분석 결과, SONFH 그룹에서 빈 공실, 피크노트 핵, 소상 구조 파괴가 특징인 뚜렷한 골괴사 변화가 나타났으나, CC 치료 후에는 이러한 병리적 특징이 눈에 띄게 완화되었습니다(그림 11A). 정량적 분석 결과, CC 처리군에서 빈 결공과 피크노틱 핵의 비율이 SONFH 그룹에 비해 유의하게 감소한 것으로 확인되었습니다(그림 11B–C). 마이크로 CT 분석 결과 SONFH 그룹에서 심각한 척추골 손실이 확인되었으며, CC 투여로 부분적으로 역전되었습니다(그림 11D). 일관되게 CC 치료는 BV/TV와 결핵을 유의미하게 증가시켰습니다. 반면 Tb.Sp는 SONFH 그룹에 비해 감소합니다(그림 11E–G). 면역형광 염색 결과, SONFH 그룹에서 HIF-1α 발현 상승과 ALP 수치 감소, VEGF 발현 변화가 함께 나타났습니다. CC 처리는 HIF-1α와 VEGF 발현을 조절하고 ALP 신호를 증진시켜 뼈 미세환경과 골 생성 활성의 개선을 나타냈습니다(그림 11H).

데이터 가용성:
현재 연구에서 사용되거나 분석된 데이터셋은 링크에서 확인할 수 있습니다: https://zenodo.org/records/19730455.

그림 1: SONFH CC 개선을 위한 네트워크 약리학 연구 전략의 흐름도. 그림 1은 연구가 데이터베이스에서 CC에서 활성 성분의 잠재적 표적을 확인했으며, SONFH가 핵심 질병임을 보여줍니다. 이들을 질병 관련 표적과 교차시킨 후, "구성 요소-표적-경로" 네트워크와 GO, KEGG 항이 구축되었습니다. 분자 도킹과 분자 역학 시뮬레이션을 통해 핵심 성분과 핵심 표적 간의 결합 친화도를 평가하고, 최종 확인은 실험적 검증을 통해 이루어집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: SONFH와 관련된 교차 표적 스크리닝. (A) 질병 샘플 내 차등 발현 유전자 분포를 나타내는 화산 플롯. 빨간색 점은 상향 조절된 유전자를, 파란색 점은 하향 유전자를, 회색 점은 유의미한 차등 발현이 없는 유전자를 나타냅니다. (B) 60개의 차등 발현 유전자의 발현 패턴을 보여주는 열(열은 샘플, 행은 유전자에 해당). (C) 다양한 데이터베이스에서 얻은 질병 관련 표적의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: CC와 SONFH 간 교차 표적 스크리닝. (A) CC(노란색)와 SONFH 관련 질병 표적(보라색)에서 활성 화합물의 예측 표적 간 공유된 61개의 공통 표적 분포를 보여주는 벤 다이어그램. (B) 허브-화합물-표적(H-C-T) 네트워크는 화합물과 그 대응하는 표적 간의 상호작용을 보여줍니다. 파란색 정사각형 노드는 질병을 나타내고, 초록색 정사각형 노드는 활성 화합물을, 주황색 정사각형 노드는 공통 표적을 나타냅니다. 간선은 화합물과 그 표적 간의 상호작용을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: PPI 분석을 통한 후보 표적 식별. (A) MCODE 플러그인으로 클러스터링된 PPI 네트워크. (B) PPI 네트워크 내 위상 스크리닝의 회로식 워크플로우. (C) CytoHubba 플러그인을 통해 PPI 네트워크에서 추출한 주요 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 61개의 공통 타깃에 대한 GO 농축 분석 결과 및 KEGG 경로 농축 분석.(A) B, CC, MF의 상위 10개 GO 농축 분석 용어를 보여주는 버블 차트. (B) 상위 20개의 KEGG 경로가 크게 풍부해진 버블 플롯. (C) KEGG 기능 분류에 기반한 상위 20개의 농축 경로 분포. (D) 대퇴골두의 골괴사를 개선할 수 있는 잠재적 메커니즘을 설명하는 설명적 C-T-P 네트워크. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: CC의 활성 화합물과 주요 표적(kcal/mol) 간 상호작용의 결합 에너지 열맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

그림 7: 특정 활성 화합물과 주요 표적의 결합 방식. AKT1-멜릴로토카판 A (A1), HIF-1α-멜릴로토카판 A (B1), STAT3-멜릴로토카판 A (C1), ESR1-멜릴로토카판 A (D1), CASP3-멜릴로토카판 A (E1), SRC-멜릴로토카판 A (F1), EGFR-멜릴로토카판 A (G1), AKT1-아네톨 (H1), AKT1-마이리스티신 (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2), (H2)와 (H2)는 각각 2차원 결합 모드를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 8: MD의 RMSD. (A) AKT1-멜릴로토카판 A 복합체의 RMSD 값. (B) HIF-1α-멜릴로토카판 A 복합체의 RMSD 값. (C) STAT3-멜리로토카르판 A 복합체의 RMSD 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 9: MD의 RMSF (A) AKT1-멜릴로토카판 A 복합체의 RMSF 값. (B) HIF-1α-멜릴로토카판 A 복합체의 RMSF 값. (C) STAT3-멜리로토카르판 A 복합체의 RMSF 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 10: MD의 H-결합. (A) AKT1-멜릴로토카르판 A 복합체의 H-결합 값. (B) HIF1A-멜릴로토카판 A 복합체의 H-결합 값. (C) AKT1-멜릴로토카르판 A 복합체의 H-결합 값. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 11: CC는 대퇴골두의 염증 반응과 세포자멸사를 억제하여 SONFH를 개선합니다. (A) 대표적인 대퇴골 두부 부위에 ABH 염색이 있습니다. 빈 결핍은 검은 화살촉으로 표시하며, 피크노틱 핵은 화살표로 표시됩니다. (B–C) 빈 결공(B)과 피크노틱 핵(C)의 비율에 대한 정량적 분석. n = 5. (D) 대퇴골두의 대표적인 3차원 마이크로 CT 재구성. (E–G) 골량 분율(BV/TV), 소엽 분리(Tb.Sp), 소상 두께(Tb.Th)를 포함한 미세 CT 매개변수의 정량화. (H) 대퇴골 두부 절편에서 HIF-1α, VEGF, ALP의 대표적 면역형광 염색; 핵은 DAPI로 카운터 염색되었다. 데이터는 평균 ± SD(n = 5)로 제시됩니다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

용어		접힘 풍부화	P-값	백작	사용자 ID
방광암		28.44	1.23E-07	7	크레브, CXCL8, NOS2, MMP2, STAT3, F2, PTGS2, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, EP300, PPARG, NFE2L2, BCL2L1
HIF-1 신호 전달 경로		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
EGFR 티로신 키나제 억제제 내성		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3 ,EP300, TYK2, PTGS2, HIF1A, MTOR, VEGFA
애드헤렌스 교차로		12.54	1.64E-05	7	크레브, ABCB1, CASP3, 에르브2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
내분비 내성		11.78	2.35E-05	7	크레브, NOS2, NOS3, ERBB2, STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
당뇨병 합병증에서의 연령-분노 신호 전달 경로		11.55	2.63E-05	7	CCR1, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, CXCR2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
암에서의 프로테오글리칸		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
릴랙신 신호전달 경로		10.25	1.02E-05	8	옥스트르, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
카포시 육종 관련 헤르페스바이러스 감염		10.20	1.45E-08	12	SRC, ERBB2, STAT3, KDR, EGFR, MTOR, BCL2L1, VEGFA
갑상선 호르몬 신호 전달 경로		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
유체 전단 스트레스와 동맥경화증		8.21	0.000177	7	크레브, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, EP300, TYK2, MMP9
B형 간염		8.18	4.41E-05	8	크레브, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
JAK-STAT 신호 경로		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
인간 거대세포바이러스 감염		7.34	6.2E-06	10	크레브, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
지질과 죽상동맥경화증		6.94	0.000035	9	CXCL8, SRC, MMP2, ERBB2, MMP9, EGFR, VEGFA
암에서의 미세RNA		6.25	2.06E-06	12	크레브, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
화학적 발암 - 수용체 활성화		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
암에서의 경로		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NOS3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
칼슘 신호 전달 경로		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
인간 유두종바이러스 감염		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

표 1: 상위 20개 강화 경로의 KEGG 농축 결과.

보충표 1: CC 내 활성 화합물의 기본 정보.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 2: CC 내 85개의 활성 성분 목표이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 3: 61개의 CC-SONFH 공통 목표에 대한 정보.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 4: GO 농축 분석에서 나온 생물학적 과정 범주 용어의 결과.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 5: GO 농축 분석에서 세포 구성 요소 분류 항의 결과.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 6: GO 농축 분석에서 나온 분자 기능 범주 항의 결과.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 7: KEGG 농축 분석 경로 결과.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 8: 화합물-표적 쌍의 분자 결합 결합 에너지(kcal/mol).이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 9: 분자 도킹을 위한 표적 및 구성 요소의 세부 사항.이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구에서 저자들은 여러 데이터베이스를 통해 CC에서 85개의 생리활성 화합물을 얻어 스크리닝을 수행했으며, 주요 화학 성분으로는 아네톨, 멜릴로토카르판 A, 마이리스티신이 포함됩니다. 표적을 확인하기 위해 저자들은 563개의 약물 CC 표적과 1116개의 SONFH 관련 표적을 교차시켜 최종적으로 61개의 표적을 얻었습니다. 저자들은 61개의 공통 표적을 STRING과 DAVID 데이터베이스에 도입하여 PPI 네트워크를 구축하고 가능한 약리학적 경로를 조사했습니다. 결과는 HIF-1α와 STAT3를 포함한 PPI 네트워크 내 10개의 주요 표적을 밝혀냈습니다. 허혈과 저산소증은 초기 연구에 따르면 SONFH의 주요 병원성 특성 중 두 가지입니다³⁵. CC는 혈관신생과 전사 조절 등 여러 생물학적 과정을 통해 SONFH에서 긍정적인 효과를 발휘할 수 있습니다. 이는 KEGG 농축 분석에 따르면 HIF-1α 신호 전달 경로, 체액 전단 스트레스 및 죽상동맥경화, 지질과 동맥경화증, 당뇨병 합병증에서의 AGE-RAGE 신호 경로 및 기타 신호 전달 경로를 통해 달성될 수 있습니다. 이는 CC가 이러한 주요 표적과 관련 경로를 통해 SONFH에 작용할 수 있음을 시사합니다. CC의 구성 요소가 표적과 밀접하게 결합되어 있는지 명확히 하기 위해, 위 네트워크 약리학 연구 결과, 즉 조제 처방의 활성 성분 스크리닝 결과와 PPI 네트워크 내 표적의 스크리닝 결과를 바탕으로, 저자들은 멜릴로토카르판 A-AKT1, 멜릴로토카르판 A-HIF-1α에 대한 분자 역학 시뮬레이션을 수행했습니다. 그리고 STAT3-멜리로토카르판 복합체가 있습니다. 이 결과는 멜릴로토카판 A가 AKT1, HIF-1α, STAT3에 꾸준히 결합함을 보여주므로, CC가 이 주요 표적에 작용하여 긍정적인 효과를 낼 수 있음을 보여준다. 전반적으로, 다성분, 다중 표적, 다중 경로 메커니즘을 통해 CC는 SONFH 환자의 삶의 질에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.

연구팀은 YGP가 뼈 관련 질환에서 치료 효과를 발휘하는 메커니즘을 밝히는 데 집중해 왔습니다. 이전 연구들은 YGP가 토끼 SONFH³⁶ 내에서 β-카테닌을 활성화하여 골세포형성을 억제하고 골형성을 촉진함으로써 대퇴골두의 뼈 형성을 촉진하고 대퇴골두의 미세구조를 개선한다는 것을 보여주었습니다. 더 나아가, 연구진은 YGPs가 주로 염증 완화와 혈관신생 촉진을 통해 SONFH에 치료 효과를 발휘한다는 것을 발견^{했습니다.} YGP는 SONFH를 개선할 뿐만 아니라 골다공증도 개선할 수 있습니다. IL-17/NF-κB 신호 경로를 억제하고 Th17 면역 반응을 감소시킴으로써, YGPs는 난소 절제술로 인한 골 손실을 성공적으로 멈춥니다³⁷. 동물 실험을 통해 연구진은 YGPs의 구성 요소 중 하나인 Cornus officinalis가 염증 매개체 분비와 골세포 세포 박사작용을 억제함으로써 SONFH에 영향을 미친다는 것을 확인^했다. 양을 따뜻하게 하고 기를 이롭게 하며 경락을 뚫는 CC는 YGPs의 주된 약초로, SONFH 개선과 환자 통증 완화에 중요한 역할을 합니다. 요약하자면, 이 연구들은 골괴사에서 YGPs의 기전 규명과 SONFH에서 CC를 주요 기전 연구로 정확히 밝히는 데 오랜 초점을 맞춰온 결과를 반영합니다.

예측되는 활성 성분 중에는 아네톨, 마이리스티신 등 다양한 성분이 뼈 관련 질환에 대해 생물학적 활성을 보였습니다. 아네톨은 골 흡수 마커의 상승을 억제하는 것으로 입증되었습니다. 아네톨은 궁극적으로 하류 경로와 주요 조절 인자를 억제하여 파반 분화와 흡수 기능을 감소시킵니다³⁹. 연구에 따르면 아네톨은 항염증 특성을 보이고 인간 골수 간엽 줄기세포(hBMSC)에서 지방 생성 분화를 억제합니다⁴⁰. 마이리스신은 PI3K/Akt와 NF-κB 경로를 억제하여 염증을 억제하고 혈관 평활근 세포를 보호합니다⁴¹. 철렙토시스는 SONFH 병인기전의 주요 기전 중 하나입니다. 철분 증후군은 철에 의존하는 지질 과산화로 인해 발생하는 프로그램된 세포 사사의 한 종류입니다. 마이리스티신은 철학 세포막의 산화환원 항상성을 보호하여 페로토토시스를 방지합니다⁴². 보르네올의 또 다른 성분은 세포 분극을 반영하는 세포 흡수의 특징인 액틴 고리 형성을 30분⁴³분 이내에 억제하는 것으로 확인되었습니다. 이 결과들은 이 성분들이 SONFH에서 CC의 보호 효과에 매우 중요할 수 있음을 시사하며, 추가 연구가 가치가 있습니다. 이 모든 성분 중에서 멜릴로토카르판 A가 MD 분석에서 다중 핵심 표적과 가장 안정적인 결합 친화성을 보였기 때문에 대표 리간드로 선정되었습니다. 상위 화합물 중 멜릴로토카르판 A는 PPI 네트워크의 여러 핵심 단백질과 지속적으로 강한 결합 상호작용을 보였으며, 이는 CC의 주요 생리활성 성분일 가능성을 시사합니다.

또한 PPI 네트워크 결과는 특히 HIF-1α와 STAT3가 핵심 표적일 수 있음을 보여주었습니다. HIF-1α는 저산소증에 대한 세포 반응의 중심 매개체입니다. SONFH 실험에서 HIF-1α 활성화는 혈관신생과 골 수리를 촉진하여 대퇴골두괴사를 완화합니다⁴⁴. 또한, 연구에서는 HIF-1α가 저산소 상태에서 연골 조직에 보호 효과를 발휘할 수 있음이 밝혀졌습니다⁴⁵. HIF-1α를 상향 조절하면 철세포진증을 억제하고 STAT3를 활성화하여 골수 단핵구의 분화를 가속화합니다⁴⁶. STAT3는 신호 전달 및 전사 활성화제입니다. HBMSCS는 STAT3를 p-STAT3로 전환하여 연골세포 증식, 이동, 저산소 상태에서의 항세포자멸 효과를 증진시킵니다⁴⁷. STAT3는 hBMSCS의 골형성 분화 및 항세포자사 효과를 강화하고, 혈관 내피 성장인자(VEGF) 분비를 증가시켜 뼈 미세혈관 재생을 촉진합니다⁴⁸. AKT1은 혈관신생 신호전달의 핵심 매개체 역할을 하는 단백질 키나아제입니다. AKT1은 골 혈관형성-골형성 연계와 소뇌골 형성에 관여합니다⁴⁹. 전반적으로 이 허브 표적들은 혈관신생, 저산소 적응, 염증, 뼈 재형성에 수렴하며, CC가 이러한 표적과 관련 신호 경로를 조절함으로써 SONFH에 대해 보호 효과를 발휘할 수 있음을 시사합니다.

SONFH 개선에 대한 CC 메커니즘을 탐구하기 위해 연구진은 GO 분석과 KEGG 농축 분석을 수행했습니다. GO 결과는 표적 유전자가 주로 저산소 반응, 지지방다당에 대한 세포 반응, 혈관신생의 긍정적 조절과 같은 생물학적 기능에 풍부함을 보여준다. KEGG 농축 분석은 SONFH에서 CC의 약리학적 효과가 주로 당뇨병 합병증에서 AGE-RAGE 신호 전달 경로, HIF-1α 신호 전달 경로, 지질 및 동맥경화증 및 기타 신호 전달 경로와 연관되어 있음을 시사했습니다. SONFH는 대퇴골두로 가는 혈류가 끊겨 대퇴골두에 영양 지원이 부족해지고 세포 세포 세포 사멸을 유발하는⁵⁰번의 경우에 발생합니다. HIF-1은 HIF-1α와 HIF-1β로 구성되며, HIF-1α는 저산소 및 허혈 환경에 대한 전사 반응에서 핵심적인 역할을 합니다⁴⁷. 이전 연구들은 VEGF/AKT/mTOR 신호 전달 연쇄 반응을 통해 HIF-1α가 골형성과 혈관형성을 조율하여 지방 유래 줄기세포의 골형성 분화를 결정적으로 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 허혈이 발생한 후 조직 저산소증이 발생하여 세포 내 HIF-1α 수치가 현저히 상승합니다. 이는 VEGF 발현 수준을 높이고 혈관 회복과 재생을 촉진합니다⁵¹. 저산소는 미토콘드리아 에너지 생산을 방해하고 활성산소종(ROS)의 생성을 증가시킵니다. 이러한 변화는 골세포 형성을 촉진하고, 골세포 활동을 억제하며, 궁극적으로 골세포 세포자멸사를 유도합니다. 높은 HIF-1α 발현은 세포 에너지 대사를 산화적 인산화에서 당화로 전환시키고, ROS 생성을 감소시켜 골세포와 골세포의 세포자멸사를 완화시킵니다^52,53. 칸셀러스 골은 골수의 조혈 기능을 지원하며 칼슘과 같은 미네랄을 저장합니다. HIF-1α의 활성 증가는 직접적으로 상쇄골 형성을 증가시킬 수^{있습니다.} 또한 HIF-1α는 저산소 상태에서 연골세포의 생존과 항상성을 유지합니다⁴⁵. 따라서 HIF-1α 신호 전달 경로는 ONFH의 치료 표적이 되었으며, ONFH의 치료 응용 가능성도 갖추게 되었습니다.

AGE-RAGE 신호전달 경로에서 고급 당화 종산물(AGE)은 탄수화물과 단백질, 지방 또는 기타 생물학적 고분자가 비효소적 공유 공유 가교결합을 통해 발생합니다⁵⁵. AGE는 염증 및 산화 손상을 통해 세포와 조직을 손상시킬 수 있습니다. 네 가지 경로를 통해 신호는 AGE-RAGE 상호작용에 의해 변환됩니다. 이들은 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK, (4) NADPH 산화효소-ROS⁵⁶입니다. 결국 인산화된 NF-κB는 핵 내 염증성 사이토카인, 성장 인자, 섬유화 세포카인, 산화 스트레스 발현을 전사합니다. 연구는 AGE-RAGE가 MAPK 신호 전달 경로를 통해 골세포 세포자멸사와 산화 스트레스 활성화를 촉진하며, 소포체 스트레스 센서 수준을 억제하고 DNA 메틸화/Wnt 경로⁵⁷을 통해 골형성적 분화를 억제한다는 것을 보여주었다. 또한 연구에 따르면 AGEs와 RAGEs가 혈관 석회화에 관여한다는 결과가^{있습니다.}

지질과 동맥경화증 신호 전달 경로에서 산화된 지질은 PPARγ를 활성화합니다. 이 약물은 지방 생성의 주요 조절자로서 골형성 분화를 억제합니다⁵⁹. 또한 여러 연구에서 지질이 파골세포와 조골세포의 분화와 성숙에 영향을 미쳐 뼈 항상성을 방해한다는 결과가^나타났습니다. 여러 기초 연구들은 세포자멸사가 SONFH의 생리적·병리학적 기전에 유의미하게 관여함을 입증했습니다. 이후 생체 내 동물 실험에서는 CC의 활성 분획이 SONFH에서 세포자사멸사와 염증을 효과적으로 억제하여 질병 진행을 완화한다는 사실이 확인되었습니다.

이러한 결과와 일치하여, 네트워크 약리학 및 실험 분석은 CC가 저산소 적응 조정, 혈관 신생 조절, 대사 과정을 조절함으로써 SONFH를 개선할 수 있음을 시사합니다. 정량적 미세 CT 분석 결과, CC 개입은 골 부피 분율(BV/TV)을 유의미하게 회복시키고, 트라베클 분리(Tb.Sp, Tb.Th)를 감소시키며, 뼈 미세구조 회복을 촉진했습니다. KEGG 농축 분석은 이러한 효과의 핵심 메커니즘으로 HIF-1α 신호전달 경로를 더욱 강조했습니다. 이 동물 실험들은 CC가 저산소증 관련 및 염증 관련 생물학적 과정을 조절하고, HIF-1α 신호 전달 경로와 같은 주요 경로를 통해 혈관 신생과 뼈 재형성을 촉진함으로써 SONFH를 완화할 수 있음을 시사합니다.

중요한 예비 발견이 일부 있었음에도 불구하고, 이 연구는 여전히 한계가 있습니다. 저자들은 네트워크 약리학과 MD를 포함한 현대 생물정보학 방법과 일부 동물 실험에 의존하여 SONFH에서 CC의 역할을 탐구했습니다. 따라서 예측의 신뢰성과 정확성은 생체 및 시험관 내 실험에서 추가로 검증되어야 합니다. 이 연구는 CC가 SONFH를 완화하는 메커니즘에 대한 예비적 단서를 제공하며, 추가 실험적 검증이 필요합니다. 네트워크 약리학과 의학을 통합함으로써, 저자들은 SONFH에서 CC의 후보 생리활성 성분, 주요 표적 및 농축된 경로를 체계적으로 지도화하였습니다. 결론적으로, 본 연구는 통합 네트워크 약리학과 생체 내 검증을 통해 SONFH에서 CC의 잠재적 보호 효과를 조사하였습니다. 결과는 이 메커니즘이 주로 HIF-1 신호 전달 경로의 조절과 골 생성 재생 촉진과 관련이 있음을 시사합니다. 해당 그림에서 볼 수 있듯이, CC 완화는 HIF-1α, VEGF, ALP 등 주요 단백질의 발현을 용량 의존적으로 유의미하게 조절하여 저산소 적응, 혈관신생, 골형성 활성의 조정 역할을 더욱 뒷받침합니다. 이 결과는 미세 CT 분석으로 확인되었으며, CC 중재가 골량 분율을 효과적으로 회복하고 소관절 미세구조를 개선한다는 것이 입증되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4% PFA	바이오샤프	BL539A
절대 에테놀	시노팜 그룹 Co.Ltd	10009218
알시안 블루 스테인 키트	솔라비오	G1563
노동당	아리고	ARG57422
오토독 비나	스크립스 리서치		버전 1.2.7
오토독툴	스크립스 리서치		버전 1.5.7
생물정보학 온라인 플랫폼			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 힘장			MD 파라미터화에 사용됩니다
CTD			https://ctdbase.org
사이토스케이프	사이토스케이프 컨소시엄		버전 3.10.3; 플러그인: CytoHubba, CytoNCA
DAPI 염색 솔루션	비요타임 바이오텍 주식회사	C1006-50mL
데이비드	NCI		https://david.ncifcrf.gov
디스커버리 스튜디오 시각화 장치	바이오비아		BIOVIA 디스커버리 스튜디오 2020; 도킹 시각화
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA 탈석화	비요타임 바이오텍 주식회사	C0167-3L
내인성 과산화효소 차단 용액	비요타임 바이오텍 주식회사	P0100A
유전자 카드			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
염소 안티-래빗 IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
염소 혈청	비요타임 바이오텍 주식회사	C0265
그래프패드 프리즘	그래프패드 (닷매틱스)		버전 10; 통계 분석 및 그래프 작성
그로맥스	그로맥스		2022년 버전; CHARMM36 힘장
허브 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1&알파;	항저우 화안	HA721997
고해상도 마이크로 CT 장비	브루커	스카이스캔
리핀스키 규칙 필터			Mw & le; 500; miLogP ≤ 5; HBD ≤ 5; HBA & 10
지다당류	시그마-올드리치	L4516
메틸프레드니솔론	시노팜 그룹 Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
중성 발삼	바이오샤프	BL704A
오맘			https://www.omim.org
파라핀	시노팜 그룹 Co.Ltd	C416770020
입자 메시 에발트 (PME)			장거리 정전기학
퍼블켐	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
파이몰	슈르둸름; 딩거		단백질 시각화 및 준비
R	크랜		버전 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
스트링			https://string-db.org
스위스 ADME	스위스 연구소		http://www.swissadme.ch
스위스타겟 예측	스위스 연구소		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P 수질 모델			용암 생성에 사용됨
유니프로트			https://www.uniprot.org
VEGF	항저우 화안	ET1604-28
위성신			https://www.bioinformatics.com.cn
윈도우 11	마이크로소프트		데이터 처리, 분자 도킹, MD 시뮬레이션에 사용됩니다
자일렌	시노팜 그룹 Co.Ltd	10023418