CD47 및 인테그린 α4/β1 변형 대식세포막 코팅 폴리(락틱-코-글리콜산) 나노입자의 분리, 합성 및 특성 분석

Summary

이 프로토콜은 표적 약물 전달 응용을 위해 CD47 및 인테그린 α4/β1 공동 변형 대식세포막 코팅 폴리(락틱-코-글리콜산) 나노입자의 제조 및 특성 분석을 가능하게 합니다.

Abstract

동맥경화증은 만성 염증성 질환이며 심혈관 이환율과 사망률에 크게 기여하는 질환입니다. 죽상동맥경화 부위에 항염증제를 표적으로 전달하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 여기서는 CD47 및 인테그린 α4/β1 대식세포막 코팅 콜히친 가중 폴리(젖산-코글리콜산) 나노입자(MMM/COL NP)의 제조 및 특성 분석을 위한 상세 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 플라스미드 형질전환과 엔도텔린-1 자극을 통한 대식세포 변형, 막 분리, NP 제조, 막 코팅이 포함됩니다. 결과적으로 생성된 MMM/COL NPs는 물리화학적 특성 분석, 단백질 발현 분석, 시험관 내 및 생체 내 분석법을 통해 평가됩니다. 기능적 검증에는 활성화된 내피세포와의 세포 연관성 평가, 대식세포 흡수, 폼 세포의 항염증 효과, 생체 분포 등이 포함됩니다. 또한, 실험실 간 재현성과 일관성을 보장하기 위해 주요 실험 매개변수와 품질 관리 단계가 강조됩니다. 이 프로토콜은 죽상동맥경화증 연구에서 표적 약물 전달 응용을 위한 생체 모방 NP를 생성하는 견고하고 확장 가능한 접근법을 제공합니다.

Introduction

동맥경화증은 동맥강 협착과 불안정한 플라크 파열을 통해 치명적인 심혈관 사건과 뇌졸중을 초래하는 만성 염증 질환으로, 이는 상당한 전 세계 건강 부담을 설명합니다 ^1,2,3. 죽상동맥경화부의 염증 반응 하향 조절은 주요^{치료 표적입니다}. 강력한 항염증제인 콜히친은 심혈관 부작용 감소에 유망한 것으로 보였으며^{, 6,7}. 그러나 임상적 효용은 제한된 치료 기간과 전신 부작용으로 제한되어, 독성을 최소화하면서 플라그 부위의 축적을 촉진하기 위해 표적 전달 시스템이 필요합니다.

세포막 코팅 나노입자(NP)는 원천 세포 ^9,10,11의 자연스러운 생물학적 기능을 활용하여 표적 약물 전달을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 죽상경화에 관여하는 세포 유형 중에서 대식세포는 중추적인 역할을 합니다 12,13,14. 대식세포에서 발현되는 인테그린 α4/β1은 활성화된 내피세포(ECs)에 발현된 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1)에 결합하여 죽상동맥경화성 플라크로의 모집을 매개합니다. CD47, 즉 '나를 먹지 마라'는 신호는 단핵 식세포 시스템이 식을 회피할 수 있게 한다^15,16. 대식세포막을 설계하여 이 단백질들을 자연 대식세포막보다 과발현하게 하면, 인테그린 α4/β1–VCAM-1 상호작용을 통해 표적화가 강화되고 CD47 매개 신호를 통한 식세포작용 감소를 가진 NP를 만들 수 있습니다^. 이중 변형 전략은 활성화된 ECS에 대한 표적화를 동시에 강화하고 식세포 제거율을 감소시키면서 천연 막 코팅 NP와 리간드 기반 표적 시스템을 개선합니다. 이러한 단백질의 기본 수준만 발현하는 천연 대식세포막과 달리, 저희 엔지니어링 막은 면역원성을 유발할 수 있는 합성 표적 리간드를 도입하지 않고도 향상된 기능을 제공합니다.

이 프로토콜은 CD47-및 인테린 α4/β1 공변형 대식세포막으로 코팅된 콜히친 가재 폴리(락틱-코-글리콜산) NP(COL NPs)의 제조 및 특성 분석을 상세히 설명하며, 변형된 대식세포막 코팅 NP(MMM/COL NPs)를 생성합니다. RAW 264.7 대식세포의 유전적·약리학적 변형 방법, 변형된 막의 분리, PLGA NP의 제제 및 코팅, 그리고 포괄적인 시험관 내 및 생체 내 기능 검사를 설명합니다. 이 방법은 죽상동맥경화증 연구에서 표적 약물 전달 응용을 위해 생체 모방 NP를 준비하고 평가하는 재현 가능한 틀을 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜에 기술된 모든 동물 시술은 난징 드럼타워 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH)이 정한 실험동물 관리 및 사용 지침을 따랐습니다.

1. RAW 264.7 대식세포의 변형

1. RAW 264.7 세포를 준비하고, 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신, CD47 과발현 플라스미드, 리포펙타민 3000 형질염색 시약, 엔도텔린-1(ET-1), 인산 완충 생리식염수(PBS), 멸균 조직 배양 용품을 완성합니다.
2. 37°C에서 5% CO₂와 함께 가습 인큐베이터에서 264.7 세포를 RAW로 배양하고, 6웰 플레이트에서 웰당 약 4–5× 10⁵ 셀까지 유지합니다.
3. CD47 수정 수행
   1. 플라스미드 DNA 용액 2.5 μg와 5 μL P3000 시약을 125 μL Opti-MEM 무혈청 배지에서 혼합하여 준비합니다.
   2. 3.75 μL 형질전환 시약을 125 μL 무혈청 배지에 희석하여 형질전환 시약 용액을 준비합니다.
   3. 이 볼륨들을 6웰 플레이트 포맷으로 활용하세요. 다른 포맷에 맞게 모든 성분을 비례적으로 스케일링하되, DNA:P3000 비율을 1:2(μg:μL)와 DNA:형질전환 시약 비율을 유지하세요.
      참고: 예를 들어, 10cm 접시에는 DNA 10 μg, P3000 20 μL, 형질전환 시약 15 μL 사용을 권장합니다.
   4. DNA 용액과 형질전환 시약 용액을 결합한 후 25°C에서 15분간 배양합니다.
   5. 형질전환 복합체를 항생제 없는 DMEM에 10% FBS를 보조하여 약 2–2.5 × 10⁶ 세포 10개씩 10cm 접시에 첨가합니다.
   6. 형질전환 6시간 후 항생제가 포함된 신선한 완전 배지로 배지를 교체하세요.
4. 인테그린 α4/β1 변형 수행
   1. 혈청 없는 배지에서 100 nM ET-1을 투여해 24시간 동안 형질전환 또는 비형질감염 세포를 자극하여 인테그린 α4/β1 발현을 상향 조절합니다.
      참고: CD47, 인테그린 α4, 인테그린 β1에 대한 정량적 중합효소 연쇄반응(qPCR) 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 변형 효율을 검증하십시오.

2. 변형된 대식세포막(MMM) 분리

1. 수정된 RAW 264.7 셀을 셀 스크레이퍼로 수확하세요.
2. 셀을 900 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리합니다.
3. 세포 펠릿을 차가운 1× PBS로 세 번 세척하세요.
4. 세포 펠릿을 2mL의 미리 냉각된 저토장 용해 완충제(트리스-HCl 10 mM, pH 8.0, KCl 1 mM, MgCl₂ 1.5 mM, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 1 m)에 재현탁하고, 얼음 위에 15분간 배양합니다.
5. 현탁액을 액체 질소에 2분간 얼린 후 37°C 수욕에서 5분간 해동하세요. 세포를 완전히 용해하기 위해 동결-해동 과정을 다섯 번 반복합니다.
   주의: 액체 질소는 심각한 극저온 화상을 일으킬 수 있습니다. 적절한 단열 장갑과 얼굴 보호구를 착용하세요.
6. 용해액을 850 × g에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 핵과 손상되지 않은 세포를 제거합니다.
7. 수집된 상청액을 15,000 × g에서 4°C에서 30분간 원심분리합니다. 더 높은 막 순도를 얻으려면, 15,000 × g 원심분리 후 얻은 상원액을 초원심분리관으로 옮기고, 100,000 × g 온도에서 4°C에서 1시간 동안 초원심분리기를 사용해 원심분리합니다.
   주의: 초원심분리관이 적절한 균형을 맞추고 고속 원심분리에 적합한지 확인하여 로터 불균형이나 고장을 방지하세요.
   참고: 초원심분리는 세포내 소기관 오염이 줄어든 정제된 원형질막을 생성합니다.
8. MMM 조각이 포함된 펠릿을 수집하여 1× PBS 또는 용해 완충제 300 μL 용량에 재현탁하여 약 1–2 mg/mL의 단백질 농도를 얻습니다.
9. BCA 단백질 정량 분석 키트를 사용하여 막 단백질 농도를 측정합니다.
   참고: 분리된 막은 나중에 사용하기 위해 −80°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 콜히친 가재 PLGA NP(COL NP) 제제

1. 10mg의 PLGA(50:50, MW 90,000)와 1mg의 콜히친을 1mL의 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹입니다.
   주의: DMSO는 피부를 침투하여 다른 물질의 흡수를 촉진할 수 있습니다. 다룰 때는 적절한 개인 보호 장비(니트릴 장갑, 실험복, 안전 고글)를 착용하세요. DMSO 함유 용액을 유기 용매 폐기물로 수집하여 허가된 유해 폐기물 처리 서비스를 통해 처리합니다. 콜히친은 독성이 있고 잠재적으로 기형유발 물질입니다. 모든 콜히친 오염 물질(용액, 장갑, 튜브)을 유해 의약품 폐기물로 수집하여 기관 및 지역 규정에 따라 허가된 유해 폐기물 처리 서비스를 통해 처리합니다.
2. 10mm 테플론 코팅 교반봉을 장착한 자기 교반기를 사용해 500rpm으로 25°C에서 용액을 저어줍니다.
3. 5mL 주사기와 26G 바늘이 장착된 주사기 펌프를 사용해 분당 약 1mL 정도의 속도로 초순수 물 4mL를 25°C에서 떨어뜨립니다.
4. NP 형성을 위해 혼합물을 3시간 동안 계속 저어주세요.
5. NP 현탁액을 투석 백(MWCO 3,500 Da)으로 옮기세요.
6. 200rpm에서 4°C의 증류수 2L에 부드럽게 저으며 투석합니다.
7. 투석을 24시간 동안 계속하고, 6시간, 12시간, 24시간에 투석 완충제를 완전히 교체하여 자유 콜히친과 DMSO를 제거합니다.
   주의: 투석에서 나온 것을 포함한 모든 유기 용매와 시약을 유기 화학 폐기물로 수집하세요. 배수구에 버리지 마세요. 기관의 유해 폐기물 처리 절차를 준수하세요.
8. 투석된 COL NP 현탁액을 수집하여 4°C에서 보관하세요.
   참고: COL NP는 단기(최대 3일) 4°C에서 보관할 수 있습니다. 형광 표지의 경우, 3.1단계에서 PLGA 용액에 1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸린도카보시아닌 퍼클로레이트(DiI) 염료를 0.1%(w/w)로 포함시킵니다.
9. DMSO와 자유 콜히친 제거 여부를 확인하세요
   1. 최종 이음액(24시간 후 마지막 변화 후 완충제)을 수집하여 자외선-가시광선(UV–가시) 분광광도법으로 분석합니다.
   2. 투석액을 200에서 400nm 사이에서 스캔한 후 대조군 샘플(신선한 투석 완충액)과 비교하세요.
   3. 약 210nm(DMSO의 특징)나 345nm(콜히친의 특징)에서 흡수 피크가 나타나지 않는지 확인하여 잔류 용매와 자유 약물이 성공적으로 제거되었음을 나타냅니다.
   4. 또는 제조사의 지침에 따라 DMSO 분석 키트를 사용해 잔류 DMSO 농도를 측정할 수 있습니다. 세포독성을 방지하기 위해 잔류 DMSO가 0.1% (v/v) 미만임을 확인해야 합니다.

4. 막 코팅 NP(MMM/COL NP) 제조

1. 2.7단계의 분리된 MMM 현탁액을 40kHz, 110W의 수조 소닉케이터로 20분간 소닉테이션합니다. 샘플 부피를 1.5mL 튜브에 유지하고, 필요에 따라 얼음 목욕을 사용해 온도를 25°C 이하로 유지합니다.
2. 소닉 막 현탁액을 400nm 구멍 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 통해 미니 익스트루더를 사용하여 막 소포를 형성합니다.
3. 3.5단계의 COL NPs와 MMM 소포를 막 단백질-PLGA 질량비 1:1로 혼합합니다.
   1. 단백질 정량 분석법으로 결정된 PLGA 10mg에 대해 10mg 단백질을 포함한 막 현탁액을 사용하세요.
   2. 1mL 피펫을 사용해 COL NP와 MMM 소포를 15회 부드럽게 위아래로 혼합합니다.
4. 혼합물을 200nm 구멍 크기의 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 통과시켜 15회 반복 압출합니다.
5. 생성된 현탁물을 MMM/COL NPs로 채취하여 즉시 사용할 수 있도록 4°C에 보관합니다.

5. NP의 특성화

1. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 유체역학적 직경, 다분산 지수(PDI), 제타 퍼텐셜을 다음 조건에서 측정합니다: 온도, 25°C; 후방산란각, 173°; 평형 시간 2분; 샘플당 세 번의 반복 측정값이 있습니다.
2. 샘플을 탈이온수(최종 농도, 약 0.1 mg/mL)에 20배 희석합니다.
   참고: 희석은 여러 산란 효과를 최소화합니다.
3. 투과 전자현미경(TEM)을 사용하여 MMM/COL NP의 코어-쉘 구조를 시각화합니다.
   1. 5 μL NP 현탁액(약 0.1 mg/mL)을 발광 방전 탄소 코팅 구리 그리드(300 메쉬)에 배치합니다.
   2. 샘플을 25°C에서 2분간 흡착시킵니다.
   3. 과잉 액체를 제거하려면 필터 페이퍼로 격자 가장자리를 살짝 만져보세요.
   4. 1% 우라닐 아세테이트 용액 5 μL 액을 그리드에 바르고 25°C에서 1분간 배양합니다.
   5. 여과지로 과잉 얼룩을 제거하세요.
   6. 그리드를 최소 10분 이상 완전히 자연 건조시키고 영상을 찍으세요.
      주의: 우라닐 아세테이트는 독성이 있고 방사능이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(장갑, 실험복, 안구 보호구)를 착용하고, 기관의 유해물질 지침에 따라 폐기물을 처리하세요.
4. 2단계 또는 막 분리 전에 온전한 세포를 표지하여 막을 표지하고, PLGA 코어에는 DiI로 표지합니다.
5. 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM)을 사용하여 DiO(녹색)와 DiI(빨간색) 신호의 공동 위치 분석을 분석합니다.
   1. 여기/방출 매개변수를 다음과 같이 설정: DiO(녹색), 여기 488 nm, 방출 550 nm; DiI(적색), 여기 561 nm, 방출 620 nm.
   2. 60× 오일 침수 대물렌즈(수치 조리개 1.4)를 사용하세요.
   3. 핀홀을 1 에어리 단위로 설정하세요.
   4. 픽셀 채도를 피하도록 검출기 이득을 조정하세요.
   5. 1024 × 1024 픽셀 해상도로 2× 라인 평균으로 이미지를 획득할 수 있습니다.
   6. 광표백을 최소화하려면 레이저 출력을 5% 이하로 유지하세요.
6. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 MMM/COL NP 표면에서 CD47, 인테그린 α4, 인테그린 β1의 존재를 분석합니다.
7. 약물 적재 및 유출 결정
   1. DMSO에서 100 μL 부피의 NP를 용해시키고, 345nm에서 콜히친 흡수율을 측정하여 약물 적재 및 캡화 효율을 측정합니다.
   2. 약 100 μg 콜히친 함유 함유액 1mL를 투석 백(MWCO, 3,500 Da)에 넣습니다.
   3. 봉지를 밀봉하고 20% FBS가 포함된 PBS 50mL(pH 7.4)에 100mL 유리 비커에 담가세요.
   4. 방출 매체를 37°C에서 유지하고, 20mm 테플론 코팅 교반바가 장착된 자기 교반기를 사용해 100rpm의 지속적인 저어주면서 조절하세요.
   5. 실험 내내 싱크대 상태를 유지하세요.
      참고: 20% FBS를 가진 PBS에서 콜히친 용해도는 >1 mg/mL입니다; 방출액 내 콜히친 농도는 포화도의 <10%입니다.
   6. 정해진 시점(0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48, 62h)에 500 μL 방출 매체를 추출합니다.
   7. 추출한 부피를 20% FBS를 포함한 신선하게 예열된 PBS(37°C)를 같은 부피로 대체하세요.
   8. 추출한 샘플의 콜히친 농도를 345nm 거리에서 UV–Vis 분광광도법으로 측정합니다.
   9. 모든 측정을 3부로 수행하세요.

6. 시험관 내 기능 검사

1. 씨앗 인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVECs). 10 ng/mL 종양괴사 인자 알파(TNF-α)로 24시간 동안 VCAM-1을 상향 조절하기 위해 세포를 자극합니다.
2. MMM/DiI NPs와 HUVECs의 세포 연관
   1. 세포를 50 μg/mL(PLGA 코어 질량 기준) 농도로 37°C에서 5% CO₂ 대기 환경에서 4시간 동안 DiI 표지된 MMM/COL NP(MMM/DiI NPs)를 배양합니다.
   2. 세포를 미리 냉각된 PBS로 세 번 세척하세요. 세척 후 셀을 300 × g에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
   3. 세척된 세포를 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)이 포함된 PBS에 재현탁합니다. 최종 세포 농도를 1 ×^{10 6} 세포/mL로 조절합니다.
   4. 유세포측 또는 CLSM의 기기 매개변수를 설정하세요. 549 nm 여기와 565 nm 발광(PE 채널)을 이용해 DiI 형광을 검출합니다.
   5. 샘플에서 데이터를 수집하세요. 유세포검사를 위해 샘플당 최소 10,000건의 이벤트를 획득하거나 CLSM을 위한 대표 필드를 포착하세요.
   6. 60× 오일 침지 렌즈를 사용하여 가장자리를 제외한 뚜렷한 영역에서 샘플당 다섯 개의 대표 필드를 선택합니다. 셀이 온전하고 겹치지 않도록 하세요.
   7. 이미지 획득 전에 샘플을 블라인딩하세요. 특정 구역을 수동으로 선택하는 대신 무덤으로 필드를 선택하세요.
   8. 블라인드 조건에서 모든 샘플에 동일한 임계값과 분석 매개변수를 적용합니다.
   9. FSC-A/SSC-A 게이팅을 사용하여 셀 이물질을 배제합니다. FSC-A/FSC-H 게이팅을 사용하는 싱글렛 셀을 선택하세요.
   10. 생존 염료 염색을 이용해 생체 세포를 선택하세요. 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 1 μg/mL에 첨가하고, 어두운 환경에서 4°C에서 5분간 배양한 후 생세포 게이팅에 사용한다.
   11. 형광 강도를 분석하여 세포 연관성을 정량화합니다. 평균 형광 강도를 정량 측정 지표로 사용하세요. FlowJo(v10.8.1) 유세포분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
3. RAW 264.7 대식세포에 의한 MMM/DiI NP의 세포 흡수
   1. 변형되지 않은 RAW 264.7 대식세포를 50 μg/mL(PLGA 코어 질량 기준)의 농도로 57°C, 5% CO₂ 대기 환경에서 4시간 인큐베이팅합니다.
   2. 6.2.2–6.2.3 단계에 설명된 분석에 따라 셀을 준비합니다.
   3. 549nm 여기와 565nm(PE 채널) 방출을 이용해 DiI 검출 장비 매개변수를 설정합니다.
   4. 샘플에서 데이터를 수집하세요. 샘플당 최소 10,000건의 사건을 수집하세요.
   5. FSC-A/SSC-A 게이팅을 사용하여 셀 이물질을 배제합니다. FSC-A/FSC-H 게이팅을 사용하는 싱글렛 셀을 선택하세요.
   6. 생존 염료 염색을 이용해 생체 세포를 선택하세요. 7-AAD를 1 μg/mL에 첨가하고, 4°C에서 어두운 환경에서 5분간 배양한 후 라이브 셀 게이팅에 사용한다.
   7. 형광 강도를 분석하여 세포 흡수를 정량화합니다. 평균 형광 강도를 정량 측정 지표로 사용하세요. 유세포분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
4. 폼 셀 분석
   1. RAW 264.7 세포를 50 μg/mL에서 산화된 저밀도 지단백(oxLDL)과 함께 48시간 배양하여 거품 세포로 분화합니다. 세포 내 지질 축적으로 표시된 오일 레드 O 염색에 의한 폼 세포 형성을 확인하세요.
   2. 폼 세포를 1 μM의 동등한 콜히친 농도로 자유 콜히친, COL NP, 또는 MMM/COL NP로 처리합니다. 세포를 5% CO₂가 포함된 가습 대기에서 37°C에서 24시간 배양합니다.
      참고: 이 농도를 선택한 것은 세포 생존성과 항염증 효능을 평가하는 예비 용량-반응 실험을 바탕으로 합니다.
   3. 효소 결합 면역흡착 검사(ELISA)를 사용하여 염증성 사이토카인 수치를 측정합니다.
      1. 치료 직후(치료 후 24시간 후)에 세포 배양 상청액을 채취하세요.
      2. 플레이트를 300 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리하여 세포 이물질을 제거하세요.
      3. 정화된 상청액을 깨끗한 튜브로 옮겨 −80°C에서 보관하여 분석할 때까지 보관합니다.
      4. 제조사 지침에 따라 ELISA 키트를 사용해 TNF-α 및 인터루킨-6 수치를 측정하세요.
      5. 모든 측정을 삼중 우물에서 수행하고 실험을 독립적으로 세 번 반복합니다.
      6. 세포 씨앗 밀도와 처리 조건이 모든 그룹에서 일관되므로 추가 정규화 없이 절대값(pg/mL)으로 사이토카인 농도를 보고하십시오.

7. 죽상동맥경화증 모델에서의 생체 내 치료 적용

참고: 모든 동물 시술은 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아야 합니다.

1. 동물 모델 구축
   1. 8주 된 수컷 아포포단백질 E 녹아웃(ApoE⁻/⁻) 마우스(C57BL/6 배경)에서 취약한 죽상동맥경화성 플라크 모델을 구축합니다.
   2. 수술 1주일 전부터 15% 지방과 0.25% 콜레스테롤을 포함한 고지방 식단을 자발적으로 먹이고, 수술 후 4주간 계속 먹입니다.
   3. 마우스에 이소플루란(유도 시 2%–3%, 유지 시 1.5%–2%)으로 마취하고, 경동맥 협착 수술 중 진통을 위해 부프레노르핀(0.1 mg/kg, 피하 투여)을 투여합니다.
   4. 직경 0.3mm 바늘을 동맥 옆에 놓아 좌측 총경동맥을 수축시킵니다. 동맥과 바늘 모두에 6-0 실크 결찰을 묶고, 바늘을 빼서 부분적으로 수축을 만듭니다.
   5. 수술 후 4주에 조직학적 평가를 통해 취약한 플라크 형성을 확인하세요.
   6. 헤마톡실린과 이오신(H&E), 오일 레드 O, 마손의 삼색 염색을 사용하여 플라크 형태, 지질 침착, 콜라겐 함량을 평가합니다.
   7. 혈관 단면적> 40%, 섬유성 캡 두께 < 120 μm, 지질 핵심 면적> 전체 플라크 면적의 40%, 그리고 상당한 CD68 양성 대식세포 침윤으로 취약한 플라크를 정의합니다.
2. 100 μL DiI 표지 MMM/COL NP를 꼬리 정맥을 정맥을 주사하여 2 mg/kg(PLGA 코어 질량 기준)으로 투여합니다.
   1. 주사 후 1일째 생체 내 영상 시스템을 사용하여 전신 생물 분포를 평가하는 생 체 영상 촬영.
      1. 쥐에게는 이소플루란으로 마취합니다(유도 시 3%, 유지 시 1.5%–2%, 산소 유량은 각각 1 L/min). 호흡 수와 발가락 집는 반사로 마취 깊이를 모니터링하세요.
      2. 영상 촬영 시 체온을 유지하기 위해 37°C의 가열 스테이지에 쥐를 누워 눕히세요.
      3. DII 설정(여기 549 nm, 방출 565 nm)을 사용하여 CY3 또는 TRITC 필터 세트를 사용하여 형광 이미지를 획득할 수 있습니다. 자동 노출 모드(보통 50–200ms)와 후사형광 획득을 사용하세요.
      4. 해부학적 참조를 위해 1024 × 1024 픽셀 해상도로 해당 밝은 필드 이미지를 동시에 캡처합니다.
   2. 주요 장기와 경동맥을 채취하여 체외 형광 영상을 촬영하세요.
      1. 아이소플루란으로 쥐를 마취하는데(유도 시 3%, 유지 시 2.5–3%).
      2. 마우스에게 좌심실 천자를 통해 20mL의 얼음 냉각 PBS(pH 7.4)를 분당 5 mL의 유량으로 투여하여 잔류 혈액과 결합되지 않은 NP를 제거합니다.
      3. 주사 후 24시간 이내에 관류 직후 심장, 대동맥, 간, 비장, 신장, 폐 등 장기를 채취합니다.
      4. 적취한 장기를 얼음처럼 차가운 PBS에 씻어 표면 혈액을 제거하세요.
      5. 대동맥을 세로 열어 스테인리스 핀으로 검은색 실리콘 판에 평평하게 (내피 쪽이 위로) 고정하세요.
      6. 조직은 얼음처럼 차가운 PBS에 보관하고, 수확 후 30분 이내에 체외 형광 영상을 수행하세요. 영상 촬영 직전에 조직 표면의 과도한 PBS를 제거하세요.
3. 투여 및 치료
   1. 예비 용량-반응 연구(0.01–0.45 mg/kg, n = 7/그룹)에서 콜히친 용량을 결정합니다. 치료 용량으로 콜히친 0.05 mg/kg을 선택하세요.
   2. 꼬리 정맥 주사로 100 μL을 투여하며, 이는 NP 용량 2 mg/kg(PLGA 코어 질량)과 콜히친 용량 0.05 mg/kg에 해당합니다. 14일 연속으로 하루에 한 번 주사하세요.
   3. 쥐를 난수 생성기를 사용해 치료 그룹(PBS, 자유 콜히친, MMM/COL NP)으로 무작위화합니다. 처리 그룹에 대해 눈을 가린 두 명의 관찰자가 모든 양량을 수행한다.
   4. >20% 체중 감소, 이동성 저하, 고통 징후 등 인도적인 결과를 적용하세요.
4. 종점 분석 수행
   1. 마지막 주사 후 24시간 후에 쥐를 안락사시키세요. 경동맥과 대동맥을 채취하세요. 대동맥의 오일 레드 O 염색을 통해 플라크 부담을 평가합니다.
   2. 플라크 면적을 정량화하세요
      1. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 플라크 면적을 오일 레드 O-양성 면적의 대동맥 내강 전체 면적 비율(마우스당 5개 단면)으로 정량화합니다.
      2. 이미지를 ImageJ 이미지 분석 소프트웨어에서 열어보세요.
      3. 이미지를 → 클릭하여 → 8비트 입력을 클릭하여 이미지를 그레이스케일로 변환하세요.
      4. 이미지를 클릭→ 임계값을 조정→. 오츠 방식을 선택하고 임계값을 적용하여 오일 레드 O-양성 영역을 식별합니다.
      5. 모든 샘플 이미지에 동일한 임계값 매개변수를 적용하고 검증을 위해 임계값 설정을 기록하세요.
      6. 분석 → 측정값을 설정하고 영역을 선택하세요.
      7. 선택한 영역을 정량화하려면 분석 → 측정을 클릭하세요.
      8. 정량화된 데이터를 내보내세요.
   3. 플라크 안정성 평가
      1. H&E, Oil Red O, Masson's Trichrome 염색을 사용하여 경동맥 단면의 조직학적 염색을 통해 플라크 안정성을 평가합니다. 콜라겐을 마손의 삼색 양성 블루 영역 비율로 정량화하세요.
      2. 파라핀 내장된 절면은 두께 5μm, 최적 절단 온도로 임베일링된 동결 절면은 두께 8μm로 준비합니다.
      3. H&E 염색을 통해 탈파라핀 및 재수화 절간을 수행한 후, 상온(RT; 23°C ± 2°C)에서 헤마톡실린 염색 5분, 에오신 염색 2분간 수행.
      4. 얼린 부위에 오일 레드 O 염색을 할 때는 오일 레드 O 작업 용액과 함께 RT에서 15분간 배양합니다. 60% 이소프로판올에 2초간 분별한 후 증류수로 헹군습니다.
      5. 키트 설명서에 따라 Weigert의 철 헤마톡실린을 10분, 폰소산 푸신 5분, 인산성 푸크신 5분, 아닐린 블루를 5분 RT에서 배양하여 마송 트리크롬 염색을 수행합니다.
      6. 이미지 분석 소프트웨어에서 조직학 이미지를 엽니다.
      7. 콜라겐 양성 영역을 식별하기 위해 색상 임계값 분석을 적용합니다. 자동 임계값을 수행하고 모든 샘플 이미지에 동일한 매개변수를 적용합니다.
      8. 검증을 위해 임계값 설정을 기록하세요.
      9. 총 플라크 면적을 혈관 막막 내 모든 플라크 면적의 합으로 정의합니다.
      10. 플라크 면적을 수작업으로 플라크 경계를 따라 그리거나 자동 임계값 분할을 사용하여 모든 플라크 영역을 식별합니다.
      11. 콜라겐 양성 부위를 측정하세요.
      12. 콜라겐 함량을 콜라겐 양성 면적으로 전체 플라크 면적으로 나눈 값으로 100%× 계산하세요.
   4. 대식세포 함량 평가
      1. 대식세포 함량을 평가하기 위해 CD68 면역형광 염색을 수행합니다. 대식세포 함량을 플라크 면적의 CD68 양성 면적 비율로 정량화하세요.
      2. 조직 절편을 준비합니다(파라핀 함침 절편은 5 μm 두께). 항원 추출을 고압 하에서 시트레이트 버퍼(pH 6.0)로 2분간 수행합니다.
      3. RT에서 5% BSA를 사용하는 30분 동안 구간을 블록하세요.
      4. 토끼 항생쥐 CD68 단클론 1차 항체(클론 D4B9C, 1% BSA에 희석 1:200)를 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이팅합니다.
      5. Alexa Fluor 488 결합된 염소 항-토끼 항-토끼 IgG 2차 항체(희석 1:500)를 RT 1시간 동안 인큐베이트합니다.
      6. 4′6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)으로 핵을 5분간 역염색합니다.
      7. 이미지 분석 소프트웨어에서 형광 이미지를 엽니다.
      8. 임계값 측정을 사용하여 CD68 양성 영역을 식별합니다. 자동 임계값을 수행하고 모든 샘플 이미지에 동일한 매개변수를 적용합니다.
      9. 검증을 위해 임계값 설정을 기록하세요.
      10. CD68 양성 면적을 측정하세요.
      11. 대식세포 함량을 CD68 양성 면적과 전체 플라크 면적으로 나눈 값으로 100%× 계산하세요.

Results

DLS 측정은 25°C에서 173° 후방산란각의 Zetasizer Nano ZS 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 샘플은 탈이온수에서 20배 희석되어 최종 농도는 약 0.1 mg/mL로 희석되어 2분간 평형 상태로 측정했습니다. 각 샘플은 3배로 측정되었으며, 결과는 평균 ± SD로 제시됩니다. DLS와 TEM은 막 코팅 후 NP 크기가 증가함을 보여주며, 코어-쉘 구조의 형성을 확인했습니다(그림 1). COL NP는 유체역학적 직경 180.8 ± 5.2 nm, PDI는 0.12 ± 0.03, 제타 전위는 −17.2 ± 0.67 mV(n = 3)입니다. 막 코팅 후 MMM/COL NP는 6.1 nm 크기± 202.0, PDI는 0.15 ± 0.04, 제타 전위는 −27.4 ± 1.84 mV(n = 3)를 보입니다. 일반적인 질량 회수는 10mg PLGA에서 8.7 ± 0.4 mg(87% 수율)입니다. 최

Discussion

이 프로토콜은 표적 죽상동맥경화 치료를 위해 CD47 및 인테그린 α4/β1 공동 변형 대식세포막 코팅 NP를 구성하고 적용하는 포괄적인 방법을 제공합니다. 이 시스템의 주요 장점은 인테그린 α4/β1–VCAM-1 상호작용을 통한 능동적 표적화와 CD47 매개 신호 전달과 관련된 대식세포 흡수 감소로, 이는 시험관 내 흡수 분석(그림 3)과 생체 내 생체 분포 결과(그림 4)로 뒷받침됩니다. 단순한 천연 막 대신 변형된 막을 사용하면 특정하고 치료적으로 중요한 특성을 향상시킵니다. 이중 변형 전략은 면역원성을 유발할 수 있는 합성 표적 리간드를 도입하지 않고 NP 약물 전달의 두 가지 주요 장벽을 동시에 해결한다는 점에서 독특합니다.

프로토콜 내 핵심 단계에는 대식세포 변형의 효율성, 막 분리의 무...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	A1310	유세포 분석의 생사/사망 구별을 위한 생존 염료
Alexa Fluor 488 접합 염소 항토끼 IgG	서모 피셔 사이언티브 (미국)	A-11008	CD68 면역형광 염색을 위한 2차 항체
항생쥐 CD47 항체	애브캠 (미국)	AB214453	CD47 발현을 검증하기 위한 서부 블롯 분석에 사용됨
항마우스 인테그린 및 알파; 4항체 (B-2)	산타크루즈 바이오테크놀로지 (미국)	SC-376334	웨스턴 블롯 분석에 사용되어 인테그킨과 알파를 검증하는 데 사용되었습니다; 4 표현식
항마우스 인테그린 & 베타; 항체 1개 (A-4)	산타크루즈 바이오테크놀로지 (미국)	SC-374429	인테그린과 베타를 검증하기 위한 웨스턴 블롯 분석에 사용; 1 표현식
ApoE-/- 쥐들	잭슨 연구소 (미국)	해당 없음	생체 내 죽상동맥경화증 모델에 사용
BCA 분석 키트	서모 피셔 사이언티브 (미국)	23225	단백질 농도를 측정하는 데 사용됩니다
검은색 실리콘 플레이트	해당 없음	해당 없음	대동맥을 체외 영상 촬영을 위해 장착하는 데 사용되었습니다
CD47 플라스미드 (pcDNA3.1(+))	제네레이 바이오텍 (중국)	G0177361-1	마우스 Cd47 유전자를 과발현 포함
콜히친	시그마-올드리치 (미국)	C9754	나노입자 내 치료 페이로드
공초점 레이저 주사 현미경	라이카 마이크로시스템즈	TCS SP8	형광 영상 및 공동 위치 분석에 사용됩니다
시트레이트 버퍼 (pH 6.0)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	해당 없음	면역형광 염색에서 항원 회출에 사용됩니다
투석관 (MWCO 3,500 Da)	시그마-올드리치 (미국)	PURD35030	나노입자 정제에 사용
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마-올드리치 (미국)	D2447	나노입자 준비용 용매
DiI (1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸린도카보시아닌 퍼클로레이트)	비요타임 (중국)	C1036	나노입자 코어의 형광 표지
DiO (3,3′-디옥타데실록사카보시아닌 퍼클로레이트)	비요타임 (중국)	C1038	대식세포막의 형광 표지
감독	비요타임 (중국)	Y239280	생체 내 형광 영상에 사용
다피	서모 피셔 사이언티브 (미국)	D3571	형광 이미징을 위한 핵 카운터 스테인
둘벡코 s 개조 이글 미디엄 (DMEM)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	11965092	세포 배양 배지
동적 광산란 분석기 (Zetasizer Nano ZS)	말번 파날리티컬 (영국)	해당 없음	나노입자 크기, PDI, 제타 퍼텐셜의 동적 광 산란(DLS) 측정에 사용됩니다
ELISA 키트	R& D 시스템즈 (미국)	표적 사이토카인에 따라 다릅니다	염증성 사이토카인 정량화에 사용됨
엔도텔린-1 (ET-1)	시그마-올드리치 (미국)	E7764	인테그린과 알파를 자극하는 데 사용; 4/&베타; 1 표현식
태아 소 혈청(FBS)	깁코 (서모피셔 사이언티픽, 미국)	10091148	세포 배양 배지 보충제
유세포계	BD 생명과학 (미국)	FACSCalibur	형광 신호 획득에 사용
유동 세포분석 소프트웨어 (FlowJo v10.8.1)	BD 생명과학 (미국)	해당 없음	유동 세포검사 데이터 분석에 사용
인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVECs)	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH1122	시험관 내 표적 분석 분석에 사용됨
이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)	미국 국립보건원(NIH)	해당 없음	정량적 이미지 분석에 사용됩니다
생체 내 영상 시스템	퍼킨엘머 (미국)	IVIS 루미나 III	전신 형광 영상에 사용
이소프로판올 (60%)	시그마-올드리치 (미국)	34863	오일 레드 O 염색 시 구분에 사용됩니다
리포펙타민 3000	서모 피셔 사이언티브 (미국)	L3000001	트랜스펙션 시약
자기 교반기와 교반	해당 없음	해당 없음	나노입자 준비에 사용
마손 s 트리크롬 스테인 키트	애브캠 (미국)	ab150686	콜라겐 염색에 사용
미니 익스트루더	아반티 폴라 리피드 (미국)	610000	막 압출에 사용
마우스 RAW 264.7 세포주	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH0328	대식세포의 출처
쥐 평활근 세포주	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH-Y063	안전성 평가에 사용됨
오일 레드 O	시그마-올드리치 (미국)	O0625	지질 염색에 사용됨
옵티-MEM	서모 피셔 사이언티브 (미국)	31985062	형질전환을 위한 환원 혈청 배지
산화된 저밀도 지단백(Ox-LDL)	이위안 바이오테크놀로지스 (중국)	YB-002	폼 셀 형성을 유도하는 데 사용됨
페니실린&대시; 스트렙토마이신	서모 피셔 사이언티브 (미국)	15140122	세포 배양을 위한 항생제 보충제
페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)	시그마-올드리치 (미국)	78830	프로테아제 억제제
인산염 완충 식염수(PBS)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	10010023	세척 및 희석 버퍼
폴리(젖산-코-글리콜산) (PLGA, 50:50; MW 90,000)	다롄 메이룬 바이오테크놀로지 (중국)	MB5649-1	나노입자 제조용 폴리머
폴리카보네이트 막 필터 (200 nm, 400 nm)	왓트맨 (영국)	800282	압출에 사용
염화칼륨(KCl)	시그마-올드리치 (미국)	P9333	용해 완충제의 구성 요소
P3000 시약	서모 피셔 사이언티브 (미국)	L3000001	형질전환 강화제
회전 미세절기	라이카 바이오시스템즈 (독일)	RM2235	파라핀 단면 절단에 사용됨
주사기 펌프	하버드 어퍼먼트 (미국)	70-3007	제어된 나노입자 형성에 사용됩니다
투과 전자현미경(TEM)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	탈로스 F200S	나노입자 이미징에 사용
트리스-HCl	시그마-올드리치 (미국)	T2663	버퍼 성분
종양 괴사 인자 알파 (TNF-&α;)	R& D 시스템즈 (미국)	410MT	내피세포 활성화에 사용됩니다
초순수	밀리-Q (머크, 미국)	ZMQSV0T01	나노입자 준비 및 투석에 사용