CD47 및 인테그린 α4/β1 변형 대식세포막 코팅 폴리(락틱-코-글리콜산) 나노입자의 분리, 합성 및 특성 분석

Summary

이 프로토콜은 표적 약물 전달 응용을 위해 CD47 및 인테그린 α4/β1 공동 변형 대식세포막 코팅 폴리(락틱-코-글리콜산) 나노입자의 제조 및 특성 분석을 가능하게 합니다.

Abstract

동맥경화증은 만성 염증성 질환이며 심혈관 이환율과 사망률에 크게 기여하는 질환입니다. 죽상동맥경화 부위에 항염증제를 표적으로 전달하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 여기서는 CD47 및 인테그린 α4/β1 대식세포막 코팅 콜히친 가중 폴리(젖산-코글리콜산) 나노입자(MMM/COL NP)의 제조 및 특성 분석을 위한 상세 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜에는 플라스미드 형질전환과 엔도텔린-1 자극을 통한 대식세포 변형, 막 분리, NP 제조, 막 코팅이 포함됩니다. 결과적으로 생성된 MMM/COL NPs는 물리화학적 특성 분석, 단백질 발현 분석, 시험관 내 및 생체 내 분석법을 통해 평가됩니다. 기능적 검증에는 활성화된 내피세포와의 세포 연관성 평가, 대식세포 흡수, 폼 세포의 항염증 효과, 생체 분포 등이 포함됩니다. 또한, 실험실 간 재현성과 일관성을 보장하기 위해 주요 실험 매개변수와 품질 관리 단계가 강조됩니다. 이 프로토콜은 죽상동맥경화증 연구에서 표적 약물 전달 응용을 위한 생체 모방 NP를 생성하는 견고하고 확장 가능한 접근법을 제공합니다.

Introduction

동맥경화증은 동맥강 협착과 불안정한 플라크 파열을 통해 치명적인 심혈관 사건과 뇌졸중을 초래하는 만성 염증 질환으로, 이는 상당한 전 세계 건강 부담을 설명합니다 ^1,2,3. 죽상동맥경화부의 염증 반응 하향 조절은 주요^{치료 표적입니다}. 강력한 항염증제인 콜히친은 심혈관 부작용 감소에 유망한 것으로 보였으며^{, 6,7}. 그러나 임상적 효용은 제한된 치료 기간과 전신 부작용으로 제한되어, 독성을 최소화하면서 플라그 부위의 축적을 촉진하기 위해 표적 전달 시스템이 필요합니다.

세포막 코팅 나노입자(NP)는 원천 세포 ^9,10,11

Protocol

이 프로토콜에 기술된 모든 동물 시술은 난징 드럼타워 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH)이 정한 실험동물 관리 및 사용 지침을 따랐습니다.

1. RAW 264.7 대식세포의 변형

1. RAW 264.7 세포를 준비하고, 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신, CD47 과발현 플라스미드, 리포펙타민 3000 형질염색 시약, 엔도텔린-1(ET-1), 인산 완충 생리식염수(PBS), 멸균 조직 배양 용품을 완성합니다.
2. 37°C에서 5% CO₂와 함께 가습 인큐베이터에서 264.7 세포를 RAW로 배양하고, 6웰 플레이트에서 웰당 약 4–5× 10⁵ 셀까지 유지합니다.
3. CD47 수정 수행
   1. 플라스미드 DNA 용액 2.5 μg와 5 μL P3000 시약을 125 μL Opti-MEM 무혈청 배지에서 혼합하여 준비합니다.
   2. 3.75 μL 형질전환 시약을 125 μL 무혈청 배지에 희석하여 형질전환 시약 용액을 준비합니다.
   3. 이 볼륨들을 6웰 플레이트 포맷으로 활용하세요. 다른 ....

Results

DLS 측정은 25°C에서 173° 후방산란각의 Zetasizer Nano ZS 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 샘플은 탈이온수에서 20배 희석되어 최종 농도는 약 0.1 mg/mL로 희석되어 2분간 평형 상태로 측정했습니다. 각 샘플은 3배로 측정되었으며, 결과는 평균 ± SD로 제시됩니다. DLS와 TEM은 막 코팅 후 NP 크기가 증가함을 보여주며, 코어-쉘 구조의 형성을 확인했습니다(그림 1). COL NP는 유체역학적 직경 180.8 ± 5.2 nm, PDI는 0.12 ± 0.03, 제타 전위는 −17.2 ± 0.67 mV(n = 3)입니다. 막 코팅 후 MMM/COL NP는 6.1 nm 크기± 202.0, PDI는 0.15 ± 0.04, 제타 전위는 −27.4 ± 1.84 mV(n = 3)를 보입니다. 일반적인 질량 회수는 10mg PLGA에서 8.7 ± 0.4 mg(87% 수율)입니다. 최

Discussion

이 프로토콜은 표적 죽상동맥경화 치료를 위해 CD47 및 인테그린 α4/β1 공동 변형 대식세포막 코팅 NP를 구성하고 적용하는 포괄적인 방법을 제공합니다. 이 시스템의 주요 장점은 인테그린 α4/β1–VCAM-1 상호작용을 통한 능동적 표적화와 CD47 매개 신호 전달과 관련된 대식세포 흡수 감소로, 이는 시험관 내 흡수 분석(그림 3)과 생체 내 생체 분포 결과(그림 4)로 뒷받침됩니다. 단순한 천연 막 대신 변형된 막을 사용하면 특정하고 치료적으로 중요한 특성을 향상시킵니다. 이중 변형 전략은 면역원성을 유발할 수 있는 합성 표적 리간드를 도입하지 않고 NP 약물 전달의 두 가지 주요 장벽을 동시에 해결한다는 점에서 독특합니다.

프로토콜 내 핵심 단계에는 대식세포 변형의 효율성, 막 분리의 무.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	A1310	유세포 분석의 생사/사망 구별을 위한 생존 염료
Alexa Fluor 488 접합 염소 항토끼 IgG	서모 피셔 사이언티브 (미국)	A-11008	CD68 면역형광 염색을 위한 2차 항체
항생쥐 CD47 항체	애브캠 (미국)	AB214453	CD47 발현을 검증하기 위한 서부 블롯 분석에 사용됨
항마우스 인테그린 및 알파; 4항체 (B-2)	산타크루즈 바이오테크놀로지 (미국)	SC-376334	웨스턴 블롯 분석에 사용되어 인테그킨과 알파를 검증하는 데 사용되었습니다; 4 표현식
항마우스 인테그린 & 베타; 항체 1개 (A-4)	산타크루즈 바이오테크놀로지 (미국)	SC-374429	인테그린과 베타를 검증하기 위한 웨스턴 블롯 분석에 사용; 1 표현식
ApoE-/- 쥐들	잭슨 연구소 (미국)	해당 없음	생체 내 죽상동맥경화증 모델에 사용
BCA 분석 키트	서모 피셔 사이언티브 (미국)	23225	단백질 농도를 측정하는 데 사용됩니다
검은색 실리콘 플레이트	해당 없음	해당 없음	대동맥을 체외 영상 촬영을 위해 장착하는 데 사용되었습니다
CD47 플라스미드 (pcDNA3.1(+))	제네레이 바이오텍 (중국)	G0177361-1	마우스 Cd47 유전자를 과발현 포함
콜히친	시그마-올드리치 (미국)	C9754	나노입자 내 치료 페이로드
공초점 레이저 주사 현미경	라이카 마이크로시스템즈	TCS SP8	형광 영상 및 공동 위치 분석에 사용됩니다
시트레이트 버퍼 (pH 6.0)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	해당 없음	면역형광 염색에서 항원 회출에 사용됩니다
투석관 (MWCO 3,500 Da)	시그마-올드리치 (미국)	PURD35030	나노입자 정제에 사용
디메틸 설폭사이드 (DMSO)	시그마-올드리치 (미국)	D2447	나노입자 준비용 용매
DiI (1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸린도카보시아닌 퍼클로레이트)	비요타임 (중국)	C1036	나노입자 코어의 형광 표지
DiO (3,3′-디옥타데실록사카보시아닌 퍼클로레이트)	비요타임 (중국)	C1038	대식세포막의 형광 표지
감독	비요타임 (중국)	Y239280	생체 내 형광 영상에 사용
다피	서모 피셔 사이언티브 (미국)	D3571	형광 이미징을 위한 핵 카운터 스테인
둘벡코 s 개조 이글 미디엄 (DMEM)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	11965092	세포 배양 배지
동적 광산란 분석기 (Zetasizer Nano ZS)	말번 파날리티컬 (영국)	해당 없음	나노입자 크기, PDI, 제타 퍼텐셜의 동적 광 산란(DLS) 측정에 사용됩니다
ELISA 키트	R& D 시스템즈 (미국)	표적 사이토카인에 따라 다릅니다	염증성 사이토카인 정량화에 사용됨
엔도텔린-1 (ET-1)	시그마-올드리치 (미국)	E7764	인테그린과 알파를 자극하는 데 사용; 4/&베타; 1 표현식
태아 소 혈청(FBS)	깁코 (서모피셔 사이언티픽, 미국)	10091148	세포 배양 배지 보충제
유세포계	BD 생명과학 (미국)	FACSCalibur	형광 신호 획득에 사용
유동 세포분석 소프트웨어 (FlowJo v10.8.1)	BD 생명과학 (미국)	해당 없음	유동 세포검사 데이터 분석에 사용
인간 탯줄 정맥 내피세포(HUVECs)	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH1122	시험관 내 표적 분석 분석에 사용됨
이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ)	미국 국립보건원(NIH)	해당 없음	정량적 이미지 분석에 사용됩니다
생체 내 영상 시스템	퍼킨엘머 (미국)	IVIS 루미나 III	전신 형광 영상에 사용
이소프로판올 (60%)	시그마-올드리치 (미국)	34863	오일 레드 O 염색 시 구분에 사용됩니다
리포펙타민 3000	서모 피셔 사이언티브 (미국)	L3000001	트랜스펙션 시약
자기 교반기와 교반	해당 없음	해당 없음	나노입자 준비에 사용
마손 s 트리크롬 스테인 키트	애브캠 (미국)	ab150686	콜라겐 염색에 사용
미니 익스트루더	아반티 폴라 리피드 (미국)	610000	막 압출에 사용
마우스 RAW 264.7 세포주	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH0328	대식세포의 출처
쥐 평활근 세포주	푸헝 바이오테크놀로지스 (중국)	FH-Y063	안전성 평가에 사용됨
오일 레드 O	시그마-올드리치 (미국)	O0625	지질 염색에 사용됨
옵티-MEM	서모 피셔 사이언티브 (미국)	31985062	형질전환을 위한 환원 혈청 배지
산화된 저밀도 지단백(Ox-LDL)	이위안 바이오테크놀로지스 (중국)	YB-002	폼 셀 형성을 유도하는 데 사용됨
페니실린&대시; 스트렙토마이신	서모 피셔 사이언티브 (미국)	15140122	세포 배양을 위한 항생제 보충제
페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)	시그마-올드리치 (미국)	78830	프로테아제 억제제
인산염 완충 식염수(PBS)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	10010023	세척 및 희석 버퍼
폴리(젖산-코-글리콜산) (PLGA, 50:50; MW 90,000)	다롄 메이룬 바이오테크놀로지 (중국)	MB5649-1	나노입자 제조용 폴리머
폴리카보네이트 막 필터 (200 nm, 400 nm)	왓트맨 (영국)	800282	압출에 사용
염화칼륨(KCl)	시그마-올드리치 (미국)	P9333	용해 완충제의 구성 요소
P3000 시약	서모 피셔 사이언티브 (미국)	L3000001	형질전환 강화제
회전 미세절기	라이카 바이오시스템즈 (독일)	RM2235	파라핀 단면 절단에 사용됨
주사기 펌프	하버드 어퍼먼트 (미국)	70-3007	제어된 나노입자 형성에 사용됩니다
투과 전자현미경(TEM)	서모 피셔 사이언티브 (미국)	탈로스 F200S	나노입자 이미징에 사용
트리스-HCl	시그마-올드리치 (미국)	T2663	버퍼 성분
종양 괴사 인자 알파 (TNF-&α;)	R& D 시스템즈 (미국)	410MT	내피세포 활성화에 사용됩니다
초순수	밀리-Q (머크, 미국)	ZMQSV0T01	나노입자 준비 및 투석에 사용