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연구 논문

만성 치주염에서 P. gingivalis/F. 핵은 TLR4/MyD88/NF-κB 경로를 통해 임신 단축과 연관되어 있습니다

164 조회수

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DOI:

10.3791/70793

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2026년 5월 15일

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1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

이 논문에서

요약

만성 첨단 치주염 관련 구강 병원체(P. gingivalis, F. nucleatum)는 쥐 CAP 모델과 인간 영양층 감염 분석법을 사용하여 평가합니다. 임신 단축은 태반 염증 활성화와 함께 관찰되며, 이는 TLR4/MyD88/NF-κB 신호와 일치합니다. 박테리아 DNA는 태반/혈관 조직에서 검출되어 혈구성 연관성과 잠재적 중재 표적을 뒷받침합니다.

초록

자연 조산(sPTB; 37주 이전 분만)은 신생아 사망의 주요 원인이며, 자궁 내 감염이 상당수의 사례에서 연루되어 있습니다. 새로운 증거는 Porphyromonas gingivalis 와 Fusobacterium nucleatum 과 같은 구강 병원체가 임신 부작용과 연관되어 있음을 보여줍니다; 만성 심근치주염(CAP)과 임신 위험 사이의 기전적 경로는 아직 완전히 정의되지 않았습니다. 임신한 C57BL/6J 마우스에서는 근관 접종과 박테리아 현탁액(1 × 108 CFU/mL)을 이용한 꼬리정맥 도전 모델로 CAP가 확립되었습니다. qPCR로 임신 기간, 태반 조직병리, 염증 표지자, 박테리아 DNA 신호를 평가하였습니다. 동시에 인간 영양층을 P . gingivalis 또는 F. nucleatum (MOI = 50, 24시간)에 노출하여 TLR4/MyD88/NF-κB 축의 활성화와 일치하는 염증 신호를 조사하였다. 대조군과 비교했을 때, CAP 관련 그룹은 임신 단축(중앙값 19.5일 대 20.5일)을 보였으며, 태반 염증 수치(IL-1β 및 TNF-α 상승 포함)와 염증 손상과 일치하는 조직병리학적 특징을 동반했습니다. qPCR은 태반 및 혈관 조직에서 박테리아 DNA 신호의 존재를 추가로 확인했습니다. 영양모세포 검사에서 F. nucleatum 은 P. gingivalis보다 더 강한 염증 촉진 반응을 유발했으며, 이는 NF-κB 인산화 증가와 연관되어 있습니다. 종합적으로 이 결과들은 CAP와 관련된 구강 병원체가 TLR4/MyD88/NF-κB 신호를 통해 태반 염증을 유도함으로써 임신 단축에 기여할 수 있음을 시사하며, 감염 관련 임신 위험을 완화하는 잠재적 표적으로 구강-태반 미생물 축을 지지합니다.

서론

자연조산(sPTB)은 임신 20주에서 37주 사이에 의학적 개입 없이 출산이 이루어지는 것을 의미합니다. 중요한 글로벌 공중보건 문제로서, sPTB의 발생률은 선진국에서 약 5%–9%에서 자원이 제한된 지역에서 12%–18%까지 다양합니다. 조산과 그 합병증은 5세 미만 아동 사망의 주요 원인으로 남아 있으며, 매년 약 100만 명의 신생아 사망을 차지합니다. 생존자들은 호흡곤란 증후군과 같은 즉각적인 합병증과 뇌성마비, 발달 지연 등 장기적인 후유증을 모두 경험하는 경우가 많으며, 이로 인해 가족과 사회에 상당한 경제적 부담을 가합니다 7,8.

sPTB의 병인은 다요인적이며, 자궁 수축 기능 장애, 자궁경부 기능 부전, 내분비 교란, 태반 장애, 자궁 내 감염 등 산모, 태아, 환경 요인 간의 상호작용을 반영합니다. 자궁 내 감염은 주요 원인으로 인식되며, 조산 사례의 약 30%에서 40%를 차지하는 것으로 추정됩니다10,11. 병원체는 상승(예: 자궁경부 질) 또는 혈액성 경로를 통해 양수강에 접근할 수 있으며, 숙주 면역 반응을 활성화하고 출산을 촉진하는 염증성 사이토카인(예: IL-6, TNF-α)과 프로스타글란딘의 분비를 촉진하여 분만을 촉진할 수 있습니다12. 영양층은 모체-태아 인터페이스의 핵심 세포 구성 요소로서 면역 내성과 항생제 방어에 기여합니다13.

Porphyromonas gingivalis와 Fusobacterium nucleatum을 포함한 구강 미생물은 sPTB 관련 염증 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 세균혈증 및/또는 염증 매개체의 전파를 통해 가능할 수 있습니다14. 이 종들은 확립된 치주 병원체이며, 치주염과 sPTB 간의 연관성이 역학 및 임상 연구에서 보고되었습니다15, 16, 17. 특히, P. gingivalis와 F. nucleatum도 만성 치주염(CAP)에서 자주 발견되지만, CAP와 부정성 임신 결과 간의 관계는 비교적 연구가 부족하며, 관련 생물학적 경로도 완전히 정의되지 않았습니다20. Harjunmaa 등은 2015년에 처음으로 치주염과 임신 기간 단축 및 저체중 출생 간의 연관성을보고했습니다. 같은 코호트에 대한 추적 연구에서는 태반으로의 직접적인 세균 이동을 지지하지 않아, 전신 염증이 첨단 치주염과 임신 결과 사이에 그럴듯한 연관성을 보일 수 있음을 시사했다22. 이 해석과 일치하여, 방사선에서 확인된 첨단 치주염은 조산아 저체중 분만 위험 증가와 연관되어 있습니다23. 지속적인 잠복 감염으로서 CAP는 만성적이고 저등급의 전신 염증 및/또는 미생물 성분에 대한 혈원성 노출을 통해 임신 위험에 기여할 수 있습니다24,25. 따라서 구강-태반 염증 경로에 대한 이해를 정밀히 하고 감염 관련 임신 위험에 대한 예방 전략을 수립하기 위해 CAP–임신 관계에 대한 추가 명확화가 필요합니다.

최근 연구들은 염증 관련 조산에서 TLR4/MyD88/NF-κB 신호 축의 중요성을 강조했습니다. Robertson 등은 TLR4를 염증 유발 조산에서 잠재적 치료 표적으로 확인했으며, 동물 모델에서 예방 효과를 보고했다26. Peng 등은 또한 miR-199a-3p가 HMGB1/TLR4/NF-κB 경로를 억제하여 경추 상피 염증을 완화한다는 것을 보여주었다27. 또한 Shen 등은 당뇨병 임신 쥐에서 시린진의 항산화 및 항염증 효과를 기술했으며, TLR4/MyD88/NF-κB 경로의 조절이 관찰된 개선에 관여한다고 밝혔다28. 이 발견들은 TLR4/MyD88/NF-κB 연관 염증 신호가 분만에 영향을 미치는 감염 관련 경로에 기여하는 기전적 틀을 지지하며, 병원체 상황에 따라 여러 선천 면역 수용체가 병행 작용할 수 있음을 인정합니다.

본 연구는 보완적 시험관 내 영양질 분석법과 생체 내 쥐 모델을 사용하여 CAP 관련 임신 효과를 평가합니다. 영양층 모델은 병원체에 의해 유발된 염증 신호를 제어된 검증을 가능하게 하는 반면, 임신 중 생리 생리 조건 하에서 세포 반응과 유기체 수준의 임신 표현형을 연결합니다. 꼬리정맥 도전 모델을 포함하여 보완적인 혈액성 노출 경로를 제공하고, 구강 감염 환경에서 관찰된 염증 활성화 패턴이 세균 성분이 모체 순환에 접근할 때 재현되는지 평가합니다. 구체적으로, P. gingivalis 와 F. nucleatum 에 대한 영양층 노출은 TLR4/MyD88/NF-κB 축의 사이토카인 반응과 활성화를 프로파일링하는 데 사용되며, 동물 실험에서는 임신 기간, 태반 염증, 경동맥 분기와 태반 조직에서 박테리아 DNA 신호의 qPCR 기반 검출을 평가합니다. qPCR은 생존성이나 세포 위치가 아닌 박테리아 DNA의 존재를 나타내기 때문에, 모체-태아 경계에서 미생물의 존재에 대한 해석은 신중하다. 또한 종 간 차이와 통제된 실험 노출이 직접적인 임상 번역을 제한할 수 있어, 인간 관련 환경에서 후속 검증이 필요함을 강조합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 신장 의과대학 제1부속병원 동물 연구 윤리 위원회(승인 번호: IACUC-20231121-13)가 정한 윤리 지침과 국립보건원(NIH) 실험동물 관리 및 사용 지침(2011년판)에 따라 엄격히 수행되었습니다. 더불어, 이 연구는 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 보급품(시약, 소모품, 장비 및 소프트웨어)과 해당 제조업체 정보 및 카탈로그 번호는 재현성을 높이기 위해 재료 표에 제공됩니다.

1. 박테리아 배양

포 르피로모나스 긴지발리스 와 푸소박테리움 핵(Fusobacterium nucleatum )의 기준 균주(균주 식별자는 재료표에 제공됨)는 혐기성 조건에서 다뤄졌습니다. 1차 배양은 미리 환원된 콜롬비아 한천 배지에 구축하고, 37°C에서 혐기(85% N₂, 10% H₂, 5% CO₂)에서 48시간 배양하였습니다. 실험적 제제를 위해 잘 분리된 단일 콜로니를 40mL 뇌심장 주입 육수에 접종하고, 동일한 혐기성 조건에서 중간 로그 단계 성장(OD660 = 0.6–0.8)까지 배양했습니다. 산소 노출을 최소화하기 위해, 예방접종 및 이송 단계는 사전 환원된 배지와 도구를 사용하여 혐기성 작업대 내에서 수행되었습니다. 박테리아 농도는 동물 노출에 대해 OD660 기반 정량을 사용하여 1 ×8 CFU/mL로 표준화되었으며, 동일한 배양 조건에서 균주별 OD–CFU 표준 곡선을 생성했습니다; 보정 곡선은 혐기성 한천 플레이트에서 최소 세 가지 독립적인 보정을 거쳐 연속 희석 및 콜로니 카운팅을 통해 설정되었습니다. 영양층 감염 연구에서는 검증된 열거법을 사용해 박테리아 현탁액을 정량화하고, 항생제 무첨가 완전배양 배양지에 희석하여 공동 배양 직전에 지정된 감염 다중도(MOI)를 달성하였습니다.

2. 동물 사육 및 그룹화

특정 무병원체 C57BL/6J 마우스(n = 90; 암컷 60마리, 수컷 30마리)는 6주에서 7주 사이의 통제된 조건(22 °C ± 2 °C, 습도 60% ± 10%, 12시간 광 주기 하에 음식과 물을 자유 롭 게 섭취할 수 있도록 방치되었습니다. 1주일 적응 후, 쥐들은 무작위로 6개의 실험군(n=15/그룹)으로 배정되었습니다: 정상 대조군(NC), P. gingivalis 함유 CAP(AP), F. nucleatum (AF) 포함 CAP, 정상 식염수 꼬리 정맥 주입(VN), P. gingivalis 꼬리 정맥 주입(VP), F. 핵 꼬리 정맥 주입(VF). 무작위화와 케이지 할당을 기록하여 할당 편향과 잠재적 케이지 효과를 최소화하였습니다.

3. CAP 모델 설립

모든 수술은 무균 조건에서 진행되었습니다. 마취는 펜토바르비탈 나트륨(1.62 mg/30 g 체중)과 아트로핀 황산염(12.5 μg/30 g 체중)을 복강내 투여하여 유도되었으며, 발달 철회 반사가 없어 적절한 마취 깊이가 확인되었다. 쥐들은 체온을 유지하기 위해 온열 패드 위에 누워 눕혔고, 입을 부드럽게 벌려 양측 상악 제1어금니를 안정적으로 관찰할 수 있게 했습니다. 확대 검사 하에서 양측 상악 제1어금니의 치수 방을 멸균 원형 버로 열고, 멸균 미세기구로 관상 치수 조직을 제거했습니다. 근관 구멍은 작은 근관 파일 크기(06–10)를 사용해 확인하였고, 관은 천공 위험을 최소화하기 위해 과도한 힘을 피하면서 개완을 위해 부드럽게 조정되었습니다. 방은 멸균 식염수(또는 무균 PBS)로 헹구고 멸균 종이 포인트로 건조한 후 접종 전이었습니다.

박테리아 접종은 표준화된 현탁액을 사용하여 1 × 108 CFU/mL로 시행되었습니다. 투여 재현성을 높이기 위해 전달된 부피는 치아당 2 μL(치아당 약 2 ×10 5 CFU)로 고정되었으며, 챔버 입구에 위치한 보정된 마이크로피펫 팁을 사용해 전달했습니다. 같은 현탁액으로 미리 적셔둔 멸균 흡수성 종이 포인트를 펄프 챔버에 넣어 국소 노출을 유지했습니다. 성공적인 분만은 종이 끝이 눈에 띄게 적셔지고 구강 내 누출이 없음으로 확인되었습니다. 주사 후, 챔버는 눈에 띄는 액체가 남지 않을 때까지 공기 건조된 후 경화 치과 접착제로 밀봉(20초), 빛 경화된 유동성 수지 복합재로 복원했습니다(20초). 밀봉 무결성은 육안 검사와 부드러운 탐색으로 확인되었으며; 틈새나 초기 손실이 발견된 복원물은 즉시 다시 봉인되었습니다. 사후 진통과 모니터링은 기관 동물 관리 지침에 따라 제공되었습니다.

2주 후, CAP 설치를 확인하기 위해 근근 방사선 촬영을 받았습니다. 성공적인 정착은 만성 말끝 염증과 골 파괴와 일치하는 주변 골 변화가 명확한 심근 방사선투과로 정의되었습니다. 교미는 감염/모델 형성 후 2주 후에 시작되었습니다.

4. 꼬리정맥 주입 모델 확립

박테리아 현탁액은 멸균 식염수에서 1 × 108 CFU/mL 농도로 준비되었습니다. 쥐는 제압되었고, 꼬리는 1–2분간 따뜻하게 가열되어 측 꼬리 정맥을 확장시켰습니다. 주입은 미세 게이지 바늘(보통 29–30 G)을 측면 꼬리정맥에 경사면으로 얕은 각도(약 10–15°)로 삽입하여 시행되었습니다. 정맥 주사 위치는 허브에서 혈액이 번쩍이는 것으로 확인되었고, 저항이 낮은 부드러운 주입으로 확인되었습니다; 삽입에 실패한 경우, 저항 증가 및/또는 피하 방울이 형성되어 있었으며, 이 경우 주입을 중단하고 짧은 재가열 후 더 근위 부위에서 반복하였습니다. 쥐들은 3일 연속으로 매일 주사를 맞았으며(한 번에 쥐당 100 μL씩 투여), 3일 후, 여성들은 남성과 함께 수용되었고, 다음 날 아침 질 플러그를 점검했다. 질 플러그 확인(GD 0.5) 후, 임신 15일째까지 3일마다 주사(마우스당 100 μL)를 투여했습니다.

5. 임신한 쥐 모델 확립

암컷과 수컷 쥐는 매일 20:00부터 밤새 2:1 비율(암컷:수컷)으로 함께 키웠습니다. 다음 날 아침 8시에 질 플러그 또는 정자 양성 질 도말 검사가 있었던 경우는 임신일(GD) 0.5로 지정되었습니다. 각 마우스에 대해 초기 체중, 산전 체중, 산후 체중, 임신 길이, 신생아 출생 체중, 새끼 배 수, 사산 수를 기록하였습니다. 이전 연구29.30에 따르면, GD 18.5 이전에 발생한 분만은 쥐에서 조산으로 운영적으로 정의되었습니다. 임신 단축이 만삭 범위 내에서 발생할 수 있기 때문에, 임신 결과는 진짜 조산과 임신 단축 표현형의 구분을 고려하여 해석하였다.

6. 샘플 채취 및 처리

임신 15일째에 각 그룹당 임신 쥐 3마리를 무작위로 선정하여 태반 및 혈관 샘플링(NC/AP/AF 및 VN/VP/VF)을 수행하였다. 펜토바르비탈 나트륨(체중 30g당 1.62mg)과 아트로핀 황산염(12.5μg/30g)의 복막내 주사로 마취가 이루어진 후, 후안과 출혈 을 통해 혈액 샘플을 채취하였습니다. 쥐들은 호흡, 심장 박동, 각막 반사가 없어 사망이 확인될 때까지 이산화탄소 챔버에서 안락사되었다; 이산화탄소 전달은 기관 동물 복지 지침에 부합하는 점진적 충전 방식을 따랐습니다. 경동맥 분기와 태반 조직은 멸균 기기를 사용하여 신속히 채취하여 교차 샘플 오염을 줄였습니다. 태반 조직은 두 부분으로 나뉘었는데, 한 부분은 −80 °C에 저장되었고, 다른 부분은 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 고정되었으며, 이후 단계별 에탄올 탈수 및 파라핀 삽입이 이루어졌다. 나머지 쥐들은 일일 체중, 임신 기간, 새끼 수, 신생아 출생 체중 등을 모니터링하였다.

7. 세포 배양 및 처리

인간 영양층 세포주 HTR-8/SVneo는 RPMI 1640 배양지에 10% 열 비활성화된 태아 소 혈청을 37°C에서 5% CO₂로 보충하였다. 감염 실험을 위해 로그 성장 단계의 HTR-8/SVneo 세포(1 × 106 세포)를 6웰 플레이트에 시딩하여 하룻밤 동안 부착하도록 했습니다. 박테리아 도전 이전에는 항생제 없는 완전 배지로 대체하여 공동 배양 중 항균 이승 효과를 방지하였습니다. P . gingivalis 또는 F. nucleatum 의 박테리아 현탁액을 MOI = 50에 추가하고, 각 웰은 완전 배양지를 사용해 최종 부피 2.5mL로 조정하였다. 판은 24시간 동안 배양되었다. 상청액은 24시간에 채취되었고, 사이토카인 측정 전에 짧은 원심분리로 정제하여 이물질을 제거했습니다. 부착 세포는 무균 PBS로 두 번 세척하여 비부착 박테리아를 제거한 후, 아래에 설명된 워크플로우에 따라 즉시 RNA 또는 단백질 추출을 위해 처리되었습니다.

8. 생쥐 태반의 조직학적 분석

태반 조직은 10% 중성 완충 포르말린에 24시간 고정하고, 파라핀을 삽입한 후 두께 4.5 μm 절개하였습니다. 태반 형태를 조사하기 위해 정기적인 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색이 시행되었습니다. 면역조직화학적 염색을 위해서는 양성 부위에 갈색 침착물을 생성하는 염색성 과산화효소 기질을 사용하여 항원 위치를 시각화한 후 헤마톡실린으로 교환 염색을 하였습니다. 음성 대조군은 1차 항체를 비면역 혈청으로 대체하여 수행하였습니다.

재현성과 투명성을 높이기 위해 면역조직화학적 평가는 사전에 지정된 반정량적 점수 측정 방식을 사용했습니다. 염색 강도는 0(무), 1(약), 2(중등도), 3(강함)로 평가되었으며, 양성 세포의 비율은 0(<5%), 1(5–25%), 2(26–50%), 3(51–75%), 4(>75%)로 평가되었습니다. 면역반응성 점수는 각 분야별로 강도와 백분율 점수를 곱하여 계산하였습니다. 각 태반에 대해 비교 가능한 해부학적 영역에서 겹치지 않는 최소 다섯 개의 고출력 필드가 채점되었습니다. 채점은 그룹 배정에 눈이 먼 두 명의 관찰자가 독립적으로 수행했으며, 이견은 공동 검토로 해결되었습니다.

9. 마우스 경동맥 분기와 태반에서 박테리아 DNA 신호의 정량적 실시간 PCR 검출

조직 DNA는 실리카 컬럼 기반 조직 DNA 추출 워크플로우를 사용하여 추출되었습니다. 조직 용해액은 12,000 × g 에서 20–25 °C에서 5분간 원심분리하여 정제되었고, 상청액은 실리카 컬럼에 도포되어 20–25 °C에서 1분간 원심분리하여 DNA 결합을 ×했습니다. 세척 단계는 작업 흐름에 따라 수행되었으며, 각 세척 후 12,000 × g 에서 20–25 °C에서 1분간 원심분리했습니다. 최종 건식 회전은 12,000 × g에서 20–25 °C에서 2분간 진행되어 잔류 에탄올을 제거했습니다. DNA는 20–25 °C에서 2분간 배양한 후 50 μL 용출 버퍼에서 용출되었고, 12,000 × g 에서 20–25 °C에서 1분간 원심분리하여 채취했습니다. 박테리아 유전체 DNA는 별도의 요구가 없는 한 동일한 결합/세척/건조 스핀/용출 원심분리 매개변수를 사용하여 규소 컬럼 기반 박테리아 DNA 추출 워크플로우를 사용하여 추출했습니다.

DNA 농도와 순도는 미세부피 핵산 정량기를 사용해 측정했으며, 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였습니다. 적격 DNA 샘플은 후속 분석을 위해 –20 °C에 보관되었습니다. 표적 박테리아 유전자는 보충표 1에 나열된 프라이머를 사용하여 증폭 및 클로링되었으며, PCR 조건 은 보충표 2 와 보충표 3에 상세히 설명되어 있습니다. 증폭된 표적 밴드는 정제되어 보 충표 4 규격에 따라 클론화되어 건강한 대장균 DH5α 세포로 변환되었습니다. 정확한 삽입 서열을 보장하기 위해 재조합 플라스미드 균주가 검증되었고, 표준 준비를 위해 플라스미드 DNA가 추출되었습니다. 표준 곡선은 표적 박테리아 유전자 조각을 포함한 희석된 플라스미드 표준에 qPCR을 수행하여 생성되었습니다. 경동맥 분기와 태반 샘플에서 P . gingivalis 16S와 F. nucleatum 16S 박테리아 DNA 신호는 실시간 PCR로 정량적으로 검출되었으며, 표준 곡선을 사용해 Ct 값에서 DNA 복사본 수를 산출했습니다. 반응 시스템과 프로그램은 각각 보충표 5 와 보충표 6에 자세히 나와 있습니다. qPCR은 생존성이나 세포 위치가 아닌 박테리아 DNA 신호를 나타내기 때문에, 모체-태아 경계면에서의 미생물 존재에 대한 해석은 신중하다.

10. ELISA 마우스 혈청 샘플과 세포 배양 상액에서 염증 인자 검출

모든 시약과 샘플은 시험 전에 실온에 평형으로 맞춰졌습니다. 생쥐 ELISA 워크플로우를 통해 TNF-α와 IL-1β의 혈청 농도를 측정했으며, 키트 절차 후 인간 ELISA 워크플로우를 통해 세포 배양 상액의 TNF-α 및 IL-1β 수치를 측정하였습니다. 표준과 시료는 중복 우물에서 측정되었고, 각 판마다 표준 곡선이 생성되었습니다. 기술적 복제본은 생물학적 복제 하나당 하나의 값을 산출하도록 평균화되었다.

11. 기타 분자생물학 분석

qRT-PCR의 경우, 페놀-클로로포름 기반 RNA 추출 워크플로우를 사용하여 배양된 세포에서 총 RNA를 추출했습니다. 상 분리 후, 12,000 × g 에서 4°C에서 10분간 원심분리하여 수상을 정화하고, RNA를 침전, 세척, 재현탁 작업 흐름에 따라 진행했습니다. RNA 농도는 핵산 분석기를 사용해 측정되었고, RNA 무결성은 아가로스 겔 전기영동으로 평가하였습니다. 역전사를 통해 cDNA를 생성했고, 실시간 정량적 PCR을 사용해 TNF-α 및 IL-1β mRNA 수치를 정량하였습니다. 프라이머 서열은 보충표 7에, 반응 혼합물은 보충표 8에, 반응 프로그램은 보충표 9에 기재되어 있습니다.

웨스턴 블롯팅에서는 마우스 태반 조직이나 영양모세포에서 추출한 단백질 용해액을 12,000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 정제하고, 정량화한 후 SDS-PAGE에 적용한 후 막 전달 및 형광 영상 워크플로우를 이용한 항체 기반 검출을 거쳤습니다. 단백질 부하량은 레인당 30 μg로 동일하게 설정되었습니다. 분자량 마커를 포함한 원본 자르지 않은 막 이미지는 그림에 제시된 모든 블롯에 대해 보존되었으며, DOI: 10.57760/sciencedb.28254에서 확인할 수 있습니다. 별도 명시가 없는 한, "n"은 생물학적 복제(개별 동물 또는 독립 세포 배양)를 의미하며, 기술 반복은 품질 관리를 위해 사용되며 생물학적 복제를 대체하지 않습니다.

12. 통계 분석

통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용해 수행되었고, 그래프 소프트웨어(재료표에 나열 됨)를 사용해 수치를 생성했습니다. 정규분포 연속 데이터는 평균 ± 표준편차로 제시되어 적절한 사후 검정과 함께 일원 ANOVA로 분석되었고, 비정규분포 데이터는 중앙값(4분위 범위)으로 표현되어 적절한 쌍별 비교와 함께 Kruskal–Wallis 검정으로 분석되었습니다. 통계적 유의성 임계값은 P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001로 설정되었습니다. 별도 명시가 없는 한, "n"은 생물학적 복제를 나타내며, 기술적 복제(예: 중복된 ELISA 우물)는 생물학적 복제당 단일 값을 얻도록 평균화되었습니다.

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결과

P. gingivalis 또는 F. nucleatum에 감염되면 생쥐에서 임신 단축과 혈청 촉진염증 사이토카인 증가와 관련이 있습니다
모체 체중 변화, 신생아 결과, 임신 기간에 대한 기본 통계는 표 1 과 그림 1에 요약되어 있습니다. 모체 체중 경로와 신생아 상태는 그룹 간 유의미한 차이가 없었다(일방향 ANOVA, P > 0.05; 그림 1A–F). NC 그룹의 임신 기간은 각각 20.50(20.13, 20.50)이었고, AP 그룹과 AF 그룹의 임신 기간은 각각 19.50(19.38, 20.00)과 19.50(19.38, 20.13)이었습니다. NC에 비해 AP와 AF 모두 임신 기간이 짧았으며, NC와 AP 간 통계적으로 유의미...

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토론

최근 몇 년간 구강 건강과 임신 결과 간의 밀접한 연관성이 입증되어, 만성 심근 치주염(CAP)과 임신 부작용, 특히 조산 관련표현형 간의 잠재적 연관성에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 체계적 문헌고찰은 현재 임상 근거가 제한적이고 이질적이지만, 전반적으로 산모 첨단 치주염과 임신 부작용 간의 긍정적 연관성을 지지하며, 더 높은 품질의 전향적 연구의 필요성을 강조합니다. 이 맥락과 일치하여, 방사선 검사로 검출된 CAP는 산후 코호트32에서 저체중 조산과 연관되어 있습니다. 또한, 기전적 임상 연구는 전신 염증이 반반으로의 직접적인 박테리아 전달보다는 첨단 감염-출생 결과 관계의 그럴듯한 매개체일 수 있음을 시사했다33.

이러한 배경 하에서, 본 연구는 상보적 생체 내 쥐 모...

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공개 사항

저자들은 서로 상반되는 이해관계를 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 쓰촨성 여성 및 아동 발달 및 관련 질병 재단 핵심 연구소(보조금 번호)의 지원을 받았습니다. FYYFEJB2025002).

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
크로모제닉 과산화물 기질Agilent DakoK3468면역조직화학용 크로모제닉 과산화물 기질
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012혈액 아가(5%)용 첨가제
치과용 X-레이 장치 / 방사선 검사 시스템PlanmecaIntra (모델)CAP 확인을 위한 치근단 방사선 사진
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504조직/박테리아에서의 실리카-컬럼 DNA 추출
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057플라스미드 표준 구성을 위한 형질전환
Eosin Y 용액, 알코올성Sigma-Aldrich (Merck)HT110132H&E 염색
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141완전한 배지에 보충제
유동성 수지 복합체3MFiltek Supreme Flowable 6010밀봉 후 복원; 광경화
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum 참고 균주ATCC25586혐기성 배양; CAP 및 꼬리 정맥 노출
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (버전)통계 분석 및 그림 생성
헤마톡실린 용액Sigma-Aldrich (Merck)HHS32H&E 역염색
HTR-8/SVneo 인간 영양막 세포주ATCCCRL-3271인체 감염 실험
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50세포 상청액 IL-1β 측정
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00D세포 상청액 TNF-α 측정
Immobilon-FL PVDF 멤브레인, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010형광 Western blot 전달
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071형광 이차 항체
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211형광 이차 항체
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology48121차 항체 (WB)
K-File (엔도던틱 파일)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015운하 기구화(예: 크기 15)
LED 치과 경화 광3MElipar DeepCure-S (모델)20초 경화(프로토콜 기준)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00C혈청 IL-1β 측정
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00B혈청 TNF-α 측정
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology42831차 항체 (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광광도계Thermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA/RNA 정량화
근적외선 이미징 시스템LI-COROdyssey CLx (모델)형광 Western blot 이미징
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology82421차 항체 (WB)
PBS, pH 7.4, Ca2+/Mg2+ 미포함Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023세포 세척 및 시약 준비
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122항생제
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761마취 유도(프로토콜 용량)
과산화물 차단 용액Agilent DakoS2023면역조직화학용 내인성 과산화물 차단
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology30331차 항체 (WB)
Porphyromonas gingivalis 참고 균주ATCC33277혐기성 배양; CAP 및 꼬리 정맥 노출
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AcDNA 합성
실시간 PCR 시스템Applied BiosystemsQuantStudio 5 (모델)16S 표적의 qPCR 정량화
Round bur (무균)Dentsply SironaH1-010상악 제1 대구치 치수실 접근 개설
RPMI 1640 배지Gibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093HTR-8/SVneo 배양 배지 기본
SYBR-safe DNA 겔 염색InvitrogenS33102DNA 시각화
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760표준용 플라스미드 미니프렙
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH

참고문헌

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

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