환경 연구를 위한 효율적인 줄기세포 유래 마우스 배반포 모델 구축

Summary

이 프로토콜은 iGATA4-배반세포의 생성 및 분석을 설명하는데, 이는 생쥐 배아포의 주요 특징인 계통 조직과 공동화 등을 재현하고, 초기 배아 발달에 영향을 미치는 환경 및 분자 교란을 재현 가능하고 고처리량으로 평가할 수 있게 합니다.

Abstract

줄기세포 기반 배아 모델은 초기 포유류 발달과 환경 교란에 대한 민감성을 조사하는 강력한 플랫폼을 제공합니다. 여기서는 배아 줄기세포(ESC), 영양층 줄기세포(TSC), 유도성 GATA4 발현을 위해 설계된 배아 줄기세포(iGATA4-ESC)를 사용하여 고충실도 마우스 배아세포를 생성하는 견고하고 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 자연 E4.5 배아포의 형태, 계통 비율, 전사 서명을 정확히 재현하는 iGATA4-배반세포를 생성하여, 원시 내배엽(PE), 에피블라스트(EPI), 영양대배엽(TE) 구획의 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 먼저 배반체 형성에 필요한 세 가지 줄기세포 집단을 유지하고 준비하는 방법을 보여줍니다. 착상 전 배양 조건에서 iGATA4-블라스토이드의 단계별 조립 과정을 개략적으로 설명하며 중요한 실험 매개변수를 강조합니다. 엄격한 특성 분석을 가능하게 하기 위해, 배아체 고정, 염색 및 영상 검사를 위한 검증된 워크플로우가 제공됩니다. 마지막으로, iGATA4-블라스토이드가 고처리량 분석에 어떻게 활용될 수 있는지 보여주는 예시가 제시됩니다. 대규모 블라스토이드 집단을 특정 환경 요인에 노출함으로써 형태, 계통 배분, 발달 진행의 변화를 빠르고 재현 가능하게 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 착상 전 발달 모델링, 초기 계통 결정 해부, 다중 매개변수 스크리닝을 수행하여 환경적 또는 분자가 배반포 형성에 미치는 영향을 평가할 수 있는 확장 가능한 플랫폼을 구축합니다.

Introduction

초기 포유류 배아가 어떻게 자기 조립되는지, 그리고 일반적인 환경 요인이 그 형성에 어떤 부정적 영향을 미칠 수 있는지 이해하려면 재현 가능하고, 실험적으로 접근 가능하며, 확장 가능한 모델 시스템이 필요합니다. 배아와 배아외 줄기세포를 결합하여 생성된 통합 배아 유사 모델이 이러한 플랫폼을 제공합니다 ^1,2. 이 프로토콜은 배아 줄기세포(ESC), 영양층 줄기세포(TSC), 유도성 GATA4 발현을 위해 설계된 ESC(iGATA4-ESC)가 착상 전 조건에서 조립되어 원시 내배엽(PE), 에피블라스트(EPI), 영양대배엽(TE) 계통을 가진 배아체를 생성하는 방법을 설명합니다. 최근 연구는 iGATA4-블라스토이드³이라 불리는 이 구조들이 계통 비율, 전사 서명, 기능 마커 발현 면에서 E4.5 배반포와 유사함을 보여주었습니다. 시험관 배양 시 이 구조물의 12.5%가 착상 후 형태로 전환됩니다. 중요한 점은, 이들은 독성학 및 환경 검사를 받을 수 있다는 것입니다.

이 기법의 개발은 기존의 블라스토이드 시스템 ^2,4,5의 한계에 의해 동기부여되었습니다. 많은 프로토콜 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 초기 배반포와 유사한 공동화된 구조를 생성하지만, 대부분 효율이 낮거나 PE 형성이 불완전하거나 세포 동일성이 불분명하거나 계통 비율이 잘못된 구조를 만듭니다. 이러한 불일치는 기전적 연구와 고처리량 교란 스크리닝에 적합성을 떨어뜨립니다. 생체 내 PE 명세는 GATA6, SOX17, GATA4, SOX7²²의 활성화와 PE 또는 그 유도체인 내장 내배엽(VE)의 결함에 따라 이루어지며, 이식 전 발달 23,24,25,26,27을 저해하여 시험관 내 전사 프로그램을 강제합니다 블라스토이드 충실도를 향상시킵니다. 조건부 GATA4 전형유전자를 가진 ESC는 VE로 강하게 전분화하며, 착상 후 ESC 및 TSC와 결합하면 개기생성과 기관형성을 시작하는 통합 배아 모델을 생성합니다.^{28, 29, 30, 31}. 이 원리는 착상 전 조건에 적용되어, iGATA4-ESC가 안정적으로 PE를 생성하고 자연 배아포시스트와 매우 유사한 배아체를 생성함을 입증합니다^.

이 방법은 줄기세포를 이용한 배아포유 모델링의 기존 한계를 극복하고, 높은 배아 형성 효율(형성되는 구조의 80%가 배아이며, 그중 75%가 적절한 계통 조직과 비율을 보임)과 높은 배아 유사성을 제공합니다. 더불어, 각 배아포포 계통이 독립적으로 배양된 줄기세포 집단에서 유래하는 iGATA4-배아체의 모듈식 조립은 각 배아 구획에 직접 실험적 접근을 제공합니다. 이러한 특성 덕분에 시스템은 다중 매개변수 스크리닝 응용에 특히 적합합니다. 형태학적으로 일관된 구조와 정확한 비율의 TE, EPI, PE 계통을 대규모로 생성하기 때문에, 자연 배아로는 달성할 수 없는 통계적 검정력으로 병행 교란과 계통 특이적 반응의 정량화가 가능합니다.

원리 증명으로서, 생리학적 범위^{32, 33, 34, 35, 36, 37, 38}에서 제시된 일반적인 환경 요인들이 배아체 발달에 미치는 영향을 측정하였다. 카페인, 니코틴, 에탄올, 아미노산 변형이 공동화 속도, 형태, 적합도, 계통 비율에 미치는 영향을 농도와 시간적 처리 창에서 평가하였다. 대부분의 조건(카페인, 에탄올, 니코틴, 그리고 저단백 식단을 모방하는 것들)은 비정상적인 배반 형성과 구조적 품질 저하를 초래했습니다. 반면, 고단백 식단과 유사하게 가지쇄 아미노산의 농도를 높이면 블라스토이드 형성 효율과 품질이 향상되었습니다. 이 결과는 시험관 배양 자연 마우스 배아포세³에서 관찰된 효과를 반영하여, 이 시스템이 미묘하고 용량 의존적인 표현형을 포착하고 자연 배아로는 불가능한 확장 가능하고 다차원적인 스크리닝 파이프라인을 지원함을 보여줍니다.

배아 모델링의 더 넓은 맥락에서 이 기법은 통합 착상 후 발달을 모델링하는 데 사용되는 동일한 세포가 착상 전 모델로도 활용될 수 있음을 보여줍니다. 이 방법은 정확한 PE 형성과 견고한 계통 통합을 갖춘 배반포 유사 구조의 확장 가능한 모델링이 필요한 응용 분야에 특히 적합합니다. 그러나 다른 줄기세포 기반 마우스 배아포세 모델과 마찬가지로, iGATA4-배아세포는 숙주 마우스로 이식된 후 착상 및 추가 발달에 실패하여 배아-모체 상호작용 연구에 적합하지 않습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 포유류 배아에서 초기 세포 유형 결정을 모델링하는 고충실도 배아토이드를 생성하는 신뢰할 수 있고 접근 가능한 접근법을 제공합니다.

Protocol

이 프로토콜에 기술된 모든 절차는 확립된 세포주를 포함하며, 캘리포니아 공과대학교(California Institute of Technology)의 기관 생물안전 지침에 따라 수행되었습니다. 살아있는 동물이나 인간을 대상으로 한 실험은 이루어지지 않았습니다.

여러 ESC 및 TSC 계통이 검사되어 iGATA4-배아체 형성을 지원하는 것으로 나타났습니다. 이전 연구에서²⁸ 개의 ESC, iGATA4-ESCs, TSC가 이 프로토콜에서 설명된 모든 단계를 성공적으로 완료하는 데 사용되었습니다. 같은 저자들은 이전에 확립된 CD1(ICR) 마우스 ESC 계통에서 iGATA4-ESC를 생성하는 과정을 설명합니다.

TSC는 상업적으로 이용 가능한 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 위에 배양됩니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 화학물질, 시약, 키트, 장비 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 배아체 형성을 위한 쥐 줄기세포 배양

1. MEF 피더 플레이트 준비
   1. 6웰 배양판에 0.2% 젤라틴 1.5mL를 탈이온수(DI)에 코팅합니다. 정상 산소에서 37°C에서 최소 45분간 배양하세요.
   2. 배양 중에는 37°C로 미리 예열한 4mL의 FC 배지(표 1)를 넣은 15mL 원심분리관을 준비합니다.
   3. MEF 바이알을 물욕에서 8자 모양으로 해동하여 작은 얼음 덩어리만 남게 합니다. 내용물을 준비된 튜브로 옮긴 후, 피펫을 위아래로 움직여 완전히 섞으세요. 500 × g 에서 원심분리기를 4분간 사용하세요.
   4. 상정액을 흡인하고 펠릿을 1mL FC 배지에 재현탁합니다. 웰당 1.5mL에 160,000개의 세포를 적재할 수 있을 만큼 충분한 부피로 조정하세요.
   5. 젤라틴을 흡입하고 웰당 1.5mL의 MEF를 배지합니다. 노르락시아에서 방해받지 않고 하룻밤 동안 배양하세요.
   6. 다음 날 배지를 신선한 1.5mL 1웰당 FC 배지로 교체하세요. 매체는 48시간마다 교체하세요. 도금 후 2일에서 7일 사이에 MEF를 사용하세요. MEF는 더 오래 건강을 유지할 수 있지만, TSC 성장을 지원하는 능력은 저해될 수 있습니다.

주의: BSL-2 기법을 사용하여 생체안전성 수준(BSL) 1 층류 캐비닛에서 모든 마우스 세포 배양을 수행합니다.

2. 마우스 배아 줄기세포(WT ESC 및 iGATA4-ESC)의 해동 및 통과
   1. 1.1.1–1.1.3 단계를 따라 해동 WT ESC 또는 iGATA4-ESC를 사용합니다. 원심분리 후, 세포를 N2B27/2i/LIF 배지 1 mL에 재현탁하고(표 1), 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 웰당 ~50,000 세포를 씨앗하며, 웰당 ~1.5 mL를 투여합니다. 노르몰시아에서 37°C에서 배양하고 48시간마다 배지를 교체합니다.
   2. 통과 전에 군락이 단단히 빽빽하고 둥글게 돌출되어 돌출이 최소화되도록 하세요. 2-3일마다 한 번씩 통과합니다.
      참고: WT ESC와 iGATA4-ESC는 독시사이클린(DOX) 유도 전까지는 형태학적으로 구별되지 않습니다.
   3. 6웰 플레이트에 1.5mL 0.2% 젤라틴을 DI 워터에 코팅하세요. 37°C에서 최소 45분간 배양하세요.
   4. 웰당 500 μL 세포 해리 시약을 추가하고 3분간 배양합니다. FC 매체 2mL를 넣고 가장자리를 부드럽게 피펫팅하세요. 현미경으로 > 90% 분리 확인. 세포가 붙어 있으면 부드럽게 피펫으로 부탁하여 부탁을 돕습니다.
   5. 세포 현탁액을 15mL 원심분리관에 옮기고 500 × g 에서 4분간 원심분리합니다.
   6. 상정액을 흡인하고 펠릿을 1mL N2B27/2i/LIF 배지에 재현탁합니다. 혈액세포계에서 10 μL을 사용해 세포 농도를 측정합니다. 부피를 조정하여 우물당 ~50,000 셀을 시딩하세요.
   7. 젤라틴을 흡인하고 세포에 씨앗을 주입하세요. 노르락시아에서 배양하세요. 다음 날부터 48시간마다 매각을 바꾸세요.
3. 생쥐 영양모세포(TSC)의 해동 및 통과
   1. TSC는 1.1.1–1.1.3 단계를 따라 해동됩니다. 원심분리 후에는 세포를 1mL의 TSF4H 배지에 재현탁하고(표 1), MEF가 코팅된 6웰 플레이트에 웰당 약 20,000개의 세포를 시딩합니다. 37°C, 5% CO₂, 5% O₂(저산소)에서 배양하고 매 24시간마다 배지를 교체합니다.
   2. 집락이 크고(>75 μm 직경) 평평한 상태로 통과 전에 반드시 확인하세요. 웰당 500 μL 세포 해리 시약을 추가하고 5분간 배양합니다. 피펫팅하면서 FC 배지 2mL를 넣으세요. > 90% 분리 확인.
   3. 세포를 원심분리관으로 옮기고 500 × g 에서 4분간 돌립니다.
   4. 1 mL TSF4H 배지에 재현탁합니다. 농도를 결정하고 우물당 ~20,000 셀로 조정합니다.
   5. MEF에 플레이트를 부착하고 저산소 상태에서 배양하세요. 매개체는 24시간마다 교체하고, 군집 합류 전 2-3일마다 배출하세요.

2. iGATA4-배반체 형성

1. 세포 집집을 위한 마이크로웰 응집판 준비
   1. 마이크로웰 집집 플레이트의 각 웰에 500 μL 안티밀착 세척액을 첨가합니다. 2,000 × g 에서 5분간 원심분리기로 적절한 균형을 맞추어 마이크로웰에 갇힌 공기를 제거하세요. 정상산소에서 37°C에서 최소 1시간 또는 하룻밤 동안 배양하세요.
2. 블라스토이드 준비, 0일차 — WT 및 iGATA4-ESC 준비 및 도금
   1. 37 °C까지 예열 N2B27/2i/LIF, FC, FCYL 배지(FC + 10 ng/mL 마우스 재조합 LIF(mLIF) + 2 μM ROCK 억제제 Y27632)를 37 °C까지 가열했습니다. 0.2% 젤라틴을 DI수에 준비하고 세포 해리 시약을 준비하세요.
   2. 웰 바닥에 닿지 않고 흡입 방지 접착제를 흡입하세요. 1 mL PBS 매체로 두 번, 1 mL FCYL 배지로 한 번 세척하세요. 마이크로웰을 손상시키지 않도록 벽을 따라 피펫을 사용하세요.
   3. 세포 통과를 위해 젤라틴 코팅된 6-웰 플레이트(≥45분 배양)를 준비합니다.
   4. 배지를 흡입하고 웰당 500 μL 세포 해리 시약을 첨가하여 WT 및 iGATA4-ESC를 수확합니다. 37°C에서 3분간 배큐하세요. FC 배지 2mL를 넣고 부드럽게 피펫을 사용하세요. 현미경으로 완전히 분리된 것을 확인하세요. 15mL 튜브에 옮겨 500 × g에서 원심분리기를 4분간 보관하세요.
   5. 1 mL FCYL 배지에 재현탁합니다. 혈액세포계에서 10 μL을 사용해 세포 농도를 측정합니다. 500,000–700,000 세포/mL로 조정하세요. 마이크로웰당 5 WT ESC와 5 iGATA4-ESC의 부피(6,000 셀)를 계산합니다.
      참고: 필요하다면 다른 ESC 라인을 최적화하세요. 시작 범위는 마이크로웰당 4–7개의 ESC이며, ESC와 iGATA4-ESC의 비율은 1:1입니다.
   6. 웰당 500 μL 세포 현탁액을 준비합니다. 1000 μL 피펫을 사용해 마이크로웰 집집판에 드롭 방향으로 첨가합니다. 100 × g 에서 3분간 원심분리기로 돌려 고르게 분포하는지 확인하세요. 6시간 동안 배양하여 응집체가 형성됩니다.
   7. 1.2절에 설명된 남은 ESC의 통로.
3. 블라스토이드 준비, 0일차 — TX 배지 준비
   1. DMEM/F12를 사용하여 ~20 mL TX 기저 배지를 준비합니다(표 2). 각 실험을 위해 신선하게 준비하세요.
      1. 200 μL 200 mM L-알라닐-L-글루타민 보충제(최종 2 mM)를 추가합니다. 재고는 4°C에서 보관하세요.
      2. 페니실린/스트렙토마이신 200 μL 10,000 U/mL(각각 100 U/mL)를 추가합니다. −20 °C에서 보관하세요.
      3. 40 μL 32 mg/mL L-아스코르브산 (최종 64 μg/mL)를 추가합니다. DI물에 준비하고 여과하여 멸균한 후 −20 °C에서 보관하세요.
      4. 20 μL 셀레나이트 나트륨(최종 14 ng/mL)을 추가합니다. −20 °C에서 준비 및 보관하세요.
      5. 240 μL NaHCO₃(최종 543 μg/mL)을 추가합니다. 해동 후에는 충분히 섞으세요.
      6. 홀로-트랜스페린 20 μL (최종 10.7 μg/mL)을 추가합니다. 해동 후에 섞으세요.
      7. 추가로 ~37.5 μL 인슐린(최종 19.4 μg/mL; 배치에 따라 다름). 4°C에서 보관하세요.
   2. 사용 직전에는 Y27632를 최종 농도인 20 μM, CHIR99021 3 μM, IL-11에서 30 ng/mL, FGF4를 25 ng/mL, 헤파린을 1 μg/mL, mLIF를 10 ng/mL, TGFβ를 15 ng/mL, 8Br-cAMP를 25 μM에 첨가합니다.
4. 블라스토이드 준비, 0일차 — TSC 준비 및 도금
   1. TSF4H, FC(표 1), TX 미디어(2.3절)를 미리 워밍하는 것. MEF 소모를 위해 젤라틴 코팅 플레이트(≥45분)를 준비합니다.
   2. 각 웰당 500 μL 세포 해리 시약을 추가하고 저산소 상태에서 5분간 배양하여 TSC를 수확합니다. FC 배지 2mL를 넣고 부드럽게 피펫을 사용하세요. 분리 확인. 튜브에 옮기고 원심분리기를 500 × g에서 4분간 가열하세요.
      참고: TSC는 >4일 배양 시 최대 10분간 세포 해리 시약을 사용해야 할 수 있습니다.
   3. 1 mL TSF4H 배지에 재현탁한 후 도금에 적합한 부피로 1:2 분할 비율로 조정하세요.
   4. MEF 고갈을 위해 젤라틴 코팅된 웰에 플레이트를 부착합니다. 저산소증 상태에서 ~45분 정도 잠복하세요. MEF는 대부분 부착되지 않은 상태로 유지되도록 하세요.
   5. 마이크로웰 집집 플레이트 웰의 900 μL 매질을 500 μL TX 매질로 대체합니다. 저산소증으로 복귀하세요.
   6. TSC가 포함된 상청액을 부착된 MEF를 교란하지 않고 튜브로 옮길 수 있습니다. 농도를 결정합니다(목표 500,000–700,000 세포/mL).
   7. 마이크로웰당 12 TSC의 부피(14,400 셀)를 계산합니다. 추가 농축이 필요하면 원심분리기를 사용하세요.
      참고: 다른 TSC 라인(마이크로웰당 권장 10–15 셀)을 최적화하세요.
   8. 각 웰당 500 μL 셀 현탁액을 드롭 단위로 추가합니다. 원심분리기 100 g × 3분간 사용하세요. 분포를 확인하고 저산소 상태에서 24시간 배양하세요.
   9. 필요에 따라 남은 TSC를 통과합니다(1.3절).
5. 블라스토이드 준비, 1일차 — 유도
   1. TSC 첨가 후 약 24시간 후, 각 웰당 5 mM 8Br-cAMP 20 μL 및 1 μg/mL DOX 1 μL 추가. 저산소 상태에서 48–72시간 동안 인큐베이팅.
6. 블라스토이드 준비, 3일차 — 고정
   1. 절단된 1000 μL 피펫 팁을 사용해 골재를 재현탁합니다. 2mL 튜브로 옮기고 5분간 침전을 두세요.
   2. 상정액을 제거하고 4% 파라포름알데히드(PFA) 250 μL을 추가합니다. 부드럽게 재현수하세요.
      주의: PFA는 적절한 개인 보호 장비와 함께 연기함에서 다루세요.
   3. 15분간 인큐베이팅하고, 5분마다 튕기세요.
   4. PFA를 제거하고 300 μL PBST(PBS + 0.1% Tween-20)를 추가합니다. 부드럽게 섞으세요. 4°C에서 <1주일 동안 보관한 후 착색하세요.
7. 배아체의 면역형광
   1. 샘플당 150 μL을 96웰 U-바닥판에 전달합니다.
   2. 100 μL 투과성 버퍼를 추가하고 20분간 배양합니다. 1차 항체 용액으로 교체하고 4°C에서 하룻밤 배큐합니다.
   3. PBST와 함께 3× 세척(각각 5분씩). 2차 항체를 추가하세요.
   4. 어두운 실온에서 2시간 부양하세요.
   5. 3× 세척 후 영상 접시로 옮깁니다.
   6. 공초점 현미경을 이용한 영상 (대≥25×, NA ≥0.8).

3. iGATA4-블라스토이드 모델을 사용한 고처리량 스크리닝

1. iGATA4-배스토이드 준비 및 환경 요인 시험
   1. 2.1절에 설명된 마이크로웰 집적 플레이트를 준비하고, 2.2–2.4절에 따라 iGATA4-블라스토이드를 생성합니다. 적절한 통제를 포함한 충분한 유정을 준비하세요. 빈 대조군(표준 프로토콜을 사용해 조제한 블라스토이드), 운반체 대조군, 그리고 하나 이상의 실험 조건을 포함합니다.
   2. 배아체는 저산소 상태에서 하룻밤 배양하세요. TSC 파종 약 24시간 후, 8Br-cAMP, 독시사이클린(DOX), 관심 화합물(또는 운반체 대제)을 보충한 TX 배지를 준비합니다. 다음 조건들이 시험되었습니다:
      1. 카페인: 3.5 mg/L, 초순수 비료에서 희석.
      2. 니코틴: 330 ng/L, 100% 에탄올(EtOH) 재고에서 희석됨.
      3. 에탄올: 17 mM, 절대 EtOH에서 희석됨.
      4. 고분쇄 아미노산(BCAA): 기준 농도에 비해 +5%, +25%, +50%(0.45 mM L-류신, 0.45 mM L-발린, 0.42 mM L-이솔류신)로, 초순수수 농축 재고에서 제조됨.
      5. 저메티오닌 및 류신: 기준 농도에 비해 −5%, −25%, −50%, −100% (0.12 mM L-메티오닌, 0.45 mM L-류신), Met-/Leu-free DMEM/F12로 제조됨. Met/Leu 프리 DMEM(LM-DMEM)은 사용 전에 Ham's F-12 영양 혼합물 1개로 보충됩니다.
         주의: 적절한 개인 보호 장비(PPE, 장갑, 실험복, 안구 보호구)를 사용하여 농축된 카페인과 니코틴 재고를 연기함에서 준비하고 처리하세요. 에탄올은 가연성이 있어 열원에서 멀리 떨어뜨려야 합니다.
   3. 각 웰에서 배지를 흡입하고 화합물 TX 배지 1mL를 추가하세요. 건조를 피하기 위해 한 번에 한 번에 한 번에 잘 처리하세요. 플레이트를 저산소 인큐베이터에 다시 넣고 3일째까지 배양하세요.
   4. 3일차에 투과성 광현미경을 사용해 대표적인 밝방야 이미지를 촬영하세요. 구조를 고정하고 2.6 절과 2.7절에 설명된 면역형광 검사를 수행합니다.
      참고: 실험 목적에 따라 처리 창을 조정하세요. 치료는 초기 응집(1일차)이나 후기 단계(예: 충치 확장)에 적용할 수 있습니다. 예시 창은 1–3일, 1–2일(그 뒤에 미디어 교체), 2–3일차가 있습니다.
2. 다중 매개변수 iGATA4-블라스토이드 분석
   1. 밝은 영역 이미지를 사용하여 공동화된 구조물(즉, 명확히 정의된 중앙 공동을 가진 구조물)를 포함하는 우물의 비율을 정량화하고, 블라스토이드 직경을 측정합니다.
      1. 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지를 엽니다.
      2. 직선 도구를 사용해 각 구조물을 가로지르는 선을 그려보세요.
      3. Analyze > Measure를 사용해 직경을 측정하세요.
   2. 대표적인 면역염색 샘플(생물학적 복제당 20–40개의 구조, 조건당 최소 3개의 생물학적 복제)과 2.7절에 설명된 이미지(대표성 침착 샘플)를 선택한다.
   3. 면역형광 마커를 사용하여 총 세포 수와 계통 구성을 정량화합니다: TE(CDX2 양성), EPI(SOX2 양성 및 SOX17 음성), PE(SOX17 양성).
   4. PE 세포가 내부 세포 덩어리(ICM) 내에서 EPI 세포와 공간적으로 분리되어 있는지 판단하여 구조적 조직과 형태를 평가합니다(이진 분류: 예/아니오).
   5. 형태를 좋음(명확한 배반낭 유사 구조에 뚜렷한 공동과 잘 조직된 TE, EPI, PE 구획), 평범함(불규칙한 형태나 부분적으로 형성된 공동과 같은 경미한 이상), 또는 나쁨(공동이 없거나 체계적이거나 분류되지 않은 계통과 같은 주요 이상)로 분류하세요.
   6. 필요한 경우 공동 크기나 부피 등 추가 매개변수를 정량화하세요. 생물정보학 도구나 다른 도면 및 통계 분석용 도구를 사용하고, 세포 세기 및/또는 디스플레이용 이미지 준비를 위한 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하세요.

Results

적절한 배양 조건 하에서 ESC와 iGATA4-ESC(노름락시아) 및 TSC(저산소증)를 유지하는 것은 성공적인 배아 생성에 필수적입니다. 설명한 대로 배양하면 ESC와 iGATA4-ESC는 거의 구별이 불가능하며, 3일 후 중간 크기의 둥근 뚜렷한 집단을 형성합니다. 평평한 군집이나 돌출된 가장자리가 나타나면 초기 분화를 나타내며, 이러한 배양은 배아토이드 형성에 사용해서는 안 됩니다. TSC는 약간 돌출된 가장자리와 평평한 중심을 가진 평평한 상피 군집을 형성해야 합니다. TSC 군락이 과도하게 자라거나 합쳐지면(보통 배양 >3일 후) 종종 배아 결과가 좋지 않다(그림 1).

iGATA4-블라스토이드 조립 과정에서 여러 초기 특징들이 프로토콜 성공을 나타냅니다(그림 2A, B). ESC 및 iGATA4-ESC 응집 후 약 6시간 후, 마이크로웰 바닥에 촘촘한 세포 집합체가 보여야 합니다. 뭉친 응집체는 과도한 세포 해리 시약 노출을 시사하며, 이는 세포 간 부착력을 감소시킵니다. 다음 단계로의 진행 (TSC 추가; 2.4절)은 조밀한 집합체가 관찰된 후에만 발생해야 합니다(그림 2B, D0.5 시점). 이 단계에서 면역염색을 하면 균일한 SOX2⁺ 및 GATA4⁻ 응집체가 나타나야 합니다(그림 2B, D0.5 시점).

TSC 첨가 및 하룻밤 배양 후에는 CDX2⁺ 세포로 둘러싸인 단일 응집된 집합체가 나타나야 합니다(그림 2B). 집합체 표면에 크고 집집되지 않은 세포가 존재하는 것은 종종 잔류 MEF를 나타냅니다. MEF 오염은 블라스토이드 형성 효율을 저하시킬 수 있으며; 따라서 집단 전에 주로 TSC 개체군을 확보하려면 충분한 MEF 고갈이 매우 중요합니다. 40 μm 셀 스트레이너를 사용해 잔류 MEF를 제거할 수 있으나, 이는 TSC 수율을 감소시킬 수 있습니다. 불완전하거나 과도한 CDX2⁺ 커버리는 마이크로웰당 추가된 TSC 수를 조정하여 보정할 수 있습니다(권장 범위: 10–15).

DOX와 8Br-cAMP 첨가 후에는 보통 2일째에 충치가 관찰되며 3일째까지 지속될 수 있습니다. 밝은 필드 현미경에서는 공동이 배강체 내에 명확하고 빈 공간으로 나타납니다(그림 2B, C; 흰색 점선). GATA4⁺ 세포는 DOX 유도 직후 나타나 점차 ICM 유사 구획 표면으로 분류됩니다(그림 2B). 성공적인 블라스토이드 형성은 높은 공동화 효율(일반적으로 마이크로웰 집집 플레이트당 구조의 약 80%; 그림 2D), 단층 CDX2⁺ TE 유사 외상피, 블라스토콜 유사 공동, 그리고 GATA4⁺ PE 유사 세포가 겹쳐진 SOX2⁺ EPI 유사 세포가 포함된 둥근 ICM 유사 구획(그림 2C–E).

일반적인 최적이지 않은 결과로는 비공동화된 구조, 여러 공동이나 ICM과 유사한 구획을 가진 불규칙한 형태의 배상체, 그리고 구조나 세포 잔해가 적은 우물이 있습니다. 약 20%의 비정상 구조가 예상되지만(그림 2C), 높은 비율은 잘못된 TX 배지 준비, 낮은 시작 세포 품질, 1일째에 DOX 또는 8Br-cAMP 첨가 실패, 배지 교환 시 구조 치위 등의 문제를 나타낼 수 있습니다.

고처리량 스크리닝 응용의 경우, 처리되지 않은 및 차량 제어 우물은 양성 통제 조건과 유사한 배상체를 생산해야 합니다(그림 3A,B). 실험적 처리는 배반체 크기(그림 3C), 공동 효율, 총 및 계통별 세포 수(그림 3D), PE 분류, 전체 형태(그림 3E) 등 여러 품질 지표에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 배아체 형성 중 카페인, 니코틴, 에탄올 처리는 구조가 작아지고 공동 형성 효율이 감소하며, 총 또는 ICM 세포 수가 감소하고, PE 분류가 손상되며, 형태가 저하되었습니다. 반면, 가지쇄 아미노산 농도가 증가할수록 세포 수가 증가하고 형태가 개선된 더 크고 공동화된 배반체가 생성되었습니다(그림 3C–E). 실험 간 생물학적 변동성이 예상되어, 각 실험에 빈 대조군과 운반체 대조군을 모두 포함하는 것이 중요함을 강조합니다.

그림 1: 품질 좋은 WT 및 저품질 WT ESC, iGATA4-ESC, TSC의 예시. W2B27/2i/LIF(ESC) 또는 TSF4H(TSCs) 배양 후 2–3일 배양 후 예상되는 군락 형태를 보여주는 WT ESC, iGATA4-ESC, TSC의 밝은 필드 현미사진. "WT ESCs – 나쁜 품질"이라는 패널은 가장자리가 돌출된 납작한 군집(빨간 화살촉)을 포함한 덜 좋은 형태를 가진 세포들을 보여줍니다. "TSC overgrown"이라는 패널은 4일간의 배양 후 합쳐지고 확장된 TSC 군락을 보여줍니다. 스케일 바: 모든 패널에 대해 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: iGATA4-블라스토이드의 도식과 예상 형태. Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S 외, 환경 연구를 위한 효율적인 줄기세포 유래 마우스 배아 모델, pp. 193–207.e6에서 재인쇄, 저작권 (2025)³, Elsevier 허가 하에. (A) 자연 마우스 배반낭 발달의 도식적 표현(상단) 및 WT ESC, iGATA4-ESC, TSC를 이용한 줄기세포 기반 배반포 모델링.
(B) 프로토콜의 여러 단계에서 예상되는 형태와 마커 발현을 보여주는 현미사진. 최대 강도 투사(MIP); 점선이 그 공동을 구분합니다. 스케일 바: 20 μm. (C) 3일째 iGATA4-블라스토이드의 밝은 시야 이미지. 스케일 바: 100 μm.
(d) 정상산소 또는 저산소 상태에서 사전 배양된 TSC를 이용해 생성된 iGATA4-블라스토이드의 공동 생성률; 집합체는 저산소 조건에서 배양되었다. n ≥ 4; 오차 막대는 평균의 표준오차를 나타냅니다. (E) E4.5 배반포와 3일째 iGATA4-배반체의 계통 표지자(CDX2, 청산판; 10월 4일, 빨간색; GATA4, 초록). 최대 강도 투사(MIP); 표시된 곳에 단일 Z-평면이 표시되어 있습니다. 스케일 바: 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3. 환경적 요인이 배아체 형성과 품질에 미치는 영향. (A) 환경 요인(카페인, 니코틴, 에탄올, 고단백 및 저단백 식단을 모방한 조건)으로 처리된 iGATA4-블라스토이드의 대표적인 면역형광 3D 이미지(위)와 IMARIS 표면 재구성(아래). 스케일 바: 모든 이미지에 대해 25 μm. (B) 실험 작업 흐름의 도식. (C) 다양한 처리 조건에서의 블라스토이드 직경. 이 범위는 10백분위수에서 90백분위수까지 해당하며; 박스는 사분위 간 범위를 나타냅니다; 이 선은 중앙 분리대를 나타냅니다. 통계 분석은 다중 비교를 포함한 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. (D) 대조군 및 처리된 배반세포에서 총 (회색), 영양배엽(청록색), 에피브라스트(빨간색), 원시 내배엽(녹색) 세포 수의 정량화. 막대는 평균을 나타내며; 오차 막대는 표준편차를 나타냅니다. 통계 분석은 다중 비교를 포함한 일원 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. (E) 통제 및 치료 조건 하에서 "좋음"(형태학적 이상이 최소화된 적절한 계통 분류), "보통"(형태학이 대체로 올바른 데 경미한 이상, EPI–PE 분류 불완전한 포함), "나쁨"(계통 조직이 붕괴된 심각한 비정상 형태)으로 분류되는 배아체 비율을 정량화합니다. 통계 분석은 대조군 조건에 대해 양측 ANOVA를 사용하여 수행되었습니다. 모든 패널에 대해 n ≥ 3. 통계적 유의성은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

미디어	시약	최종 집중
FC
	DMEM	N.A.
	열에 의해 비활성화된 FBS(iFBS)	15%
	글루타맥스	2 mM
	2-머캅토에탄올 (2-ME)	0.1 mM
	비필수 아미노산 (NEAA)	1회
	나 피루베이트	1회
	페니실린-스트렙토마이신	1회
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	신경기저A	50%
	B27 보충제	1회
	N2 보충제	0.5배
	2-ME	100 μM
	페니실린-스트렙토마이신	1%
	글루타맥스	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	마우스 재조합 LIF	10 ng/mL
TSF4H
	메가셀 RPMI-1640 미디엄	N.A.
	iFBS	20%
	글루타맥스	2 mM
	나 피루베이트	1회
	페니실린-스트렙토마이신	1회
	FGF4	25 ng/mL
	헤파린	1 μg/mL

표 1: FC, N2B27/2i/LIF, TSF4H의 미디어 레시피. FC 매체, N2B27/2i/LIF 배지, TSF4H 배지를 최종 농축 시 준비하는 레시피.

구성 요소	최종 집중	가축 농도	용매 및 저장	용량 ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, -20 °C에서 저장	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, -20 °C에서 저장	6 μL
DMEM/F12	해당 없음	해당 없음	4°C에서 보관	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	PBS에 0.1% BSA, -20 °C에서 저장	5 μL
L-알라닐-L-글루타민 보충제	2 mM	200 mM	4°C에서 보관	200 μL
헤파린	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, -20 °C에서 저장	20 μL
홀로-트랜스페린	10.7 μg/mL	10.7 mg/mL	이산화수(DI)를 -20°C에서 보관하세요	20 μL
인간 TGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0.1% BSA, -20 °C에서 저장	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	PBS에 0.1% BSA, -20 °C에서 저장	24 μL
인슐린	19.4 μg/mL	9.5 - 11.5 mg/mL	농도는 배치에 따라 다르며, 4 °C에서 보관합니다	33.7–40.8 μL, 재고 농도에 따라 부피를 조절하세요.
L-아스코르브산-2-인산염 마그네슘	64 μg/mL	32 mg/mL	이산화수(DI)를 -20°C에서 보관하세요	40 μL
마우스 재조합 LIF	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0.1% BSA, -20 °C에서 보관	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45.25 mg/mL	이산화수(DI)를 -20°C에서 보관하세요	240 μL
페니실린/스트렙토마이신	1회	100배	-20 °C에서 보관	200 μL
셀레나이트 나트륨	14 ng/mL	14 μg/mL	이산화수(DI)를 -20°C에서 보관하세요	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, -20 °C에서 저장	20 μL

표 2: TX용 미디어 레시피. TX 매체 제조 레시피, 소분자 및 기타 시약의 제조 및 저장 방법, 최종 농도에 대한 세부 내용이 포함되어 있습니다.

Discussion

iGATA4-배반체는 시험관 배양 내 세 가지 세포 유형인 ESC, 유도성 GATA4-ESC(iGATA4-ESC), 저산소증 배양 TSCs를 자가 조직화하여 매우 효율적인 배아 유사 줄기세포 기반 마우스 배반낭 모델을 제공합니다. 이 구조들은 적절한 계통 비율과 전사 동일성 등 E4.5 배아포의 주요 특징을 재현하며, 배반포 단계 발달 결함을 신뢰성 있게 반영하는 다중 매개변수 환경 스크리닝에 활용될 수 있습니다^. 최근 연구는 기저 배지 내 ESC, iGATA4-ESC, TSC의 집합이 고효율 배아 형성을 가능하게 하며, 실험실^{과 배양} 조건 전반에 걸쳐 이 접근법의 견고성과 적응성을 강조합니다. iGATA4-ESC는 이전에 이식 후 줄기세포 기반 배아 모델(28,29,30,31)에서 VE 세포의 기능을 재현하는 것으로 나타났습니다. 이 결과들은 iGATA4-ESC가 줄기세포 기반 배아 모델링에서 PE/VE 세포를 유연하고 신뢰할 수 있게 대체할 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜의 여러 단계는 고품질 블라스토이드를 달성하기 위해 매우 중요합니다. 여기에는 시작 세포 집단의 질, 특히 저산소 배양 TSCs(그림 1); 0일차에 신선하게 준비해야 하는 TX 미디엄 준비(표 2; 제2.3조); 그리고 집단 후 판을 신중하게 다루는 것. 프로토콜 성공의 주요 지표로는 공동 생성 효율(일반적으로 ~80%), 적절한 형태(블라스토콜 유사 공동을 가진 ~100 μm 직경 구조, CDX2⁺ TE 유사 외층, 그리고 약 3 TE:1 EPI:1 PE 비율의 정렬된 SOX2⁺ 및 GATA4⁺ 내부 세포 질량), 그리고 적절히 분류된 GATA4⁺ PE 유사층의 존재가 포함됩니다. 이들은 1^{, 2, 4, 5 분야에서 흔}히 사용되는 지표입니다. 공동화된 배아체 중 약 75%의 구조가 이러한 모든 특징을 보입니다. 이 지표들은 문제 해결의 초기 지표로 활용될 수 있습니다. 최적의 세포 품질은 일반적으로 비정상적인 군집 형태로 나타나 부적절한 집단 또는 비공동화 구조를 초래합니다. 부적절한 배지 준비는 불완전한 응집이나 계통 결함을 초래할 수 있으며, 거친 취급은 마이크로웰이나 빈 우물에 여러 개의 응집체를 초래할 수 있습니다.

추가 최적화에는 시드 셀 수 조정(권장 시작 범위: 4–7 ESC 및 iGATA4-ESC, 마이크로웰당 10–15 TSC), MEF 고갈 방법 정제(예: 40 μm 셀 스트레이너를 통한 여과), TX 배지 조성 변경이 포함될 수 있습니다. 예를 들어, FGF4와 헤파린을 제거해도 효율적인 배아체 형성을 지원하면서도 보다 벽 형태의 TE와 같은 정체성을 촉진할 수 있습니다. iGATA4-블라스토이드는 배양 내에서 최대 6일간 유지할 수 있습니다; 하지만 4일째에서 6일째 구조물은 배아낭포와 유사한 비율을 유지하면서 크기가 커지는 경우가 많습니다. 프로토콜은 생물학적 복제 간에 일관된 결과를 제공하지만, 각 실험에는 적절한 대조군이 포함되어야 합니다.

시작 세포 집단과 배양 조건이 다양한 다른 쥐 배아 시스템과 비교할 때, 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , iGATA4-블라스토이드는 높은 조직 형성 효율과 정확한 계통 표현을 모두 달성합니다. 많은 기존 프로토콜이 공동화된 구조를 생성하고 특정 생물학적 응용에 유용하지만, 종종 불완전한 PE 형성, 이질적이거나 정의되지 않은 세포 정체성, 또는 잘못된 계통 비율을 보입니다. 세 개의 계통 지향 줄기세포 집단을 단계적으로 결합함으로써 iGATA4-블라스토이드는 이러한 한계를 극복하고 재현 가능하고 모듈화되며 실험적으로 접근 가능한 시스템을 제공합니다.

이러한 장점에도 불구하고 몇 가지 한계가 남아 있습니다. TX 배지에서 4–6일 이상 장기간 시험 관 배양을 하면 혈통 비율이 배반포와 유사하더라도 과증식이 발생합니다. 약 12.5%의 iGATA4-배반체는 시험관 내에서 착상 주위 형태로 전환되며, 이는 양수 전구를 둘러싼 컵 모양의 유사층상 상모세포, 근위 상반 인근의 확장된 배아 외배엽 유사 구획, 그리고 외부 내장 내배엽 유사층이 특징이다. 그러나 iGATA4-블라스토이드는 숙주 마우스로 이식된 후 착상하지 못하고 추가 발달을 하지 못합니다. 따라서 iGATA4-블라스토이드와 더 넓은 범위의 플라스토이드는 착상 또는 배아-모체 상호작용 연구에 적합하지 않습니다.

블라스토이드가 착상하지 못한 분자적 기초는 아직 명확하지 않으나, 현재의 증거는 불완전한 영양배엽 모델링이 원인일 수 있음을 시사한다. iGATA4-배반체의 TE 유사 세포는 지나치게 극성적인 분자 정체성을 보입니다. 향후 벽화 TE 세포와 더 유사한 TSC를 설계하거나, 착상 적합성을 더 잘 재현하는 대체 세포주를 도입하는 시도는 이러한 한계를 극복할 유망한 방향을 제시합니다. iGATA4-블라스토이드의 모듈식 특성은 TE 특이적 변형을 EPI와 PE 형성과 독립적으로 독립적으로 구현할 수 있기 때문에, 이 시스템은 이러한 개발에 특히 적합합니다.

종합적으로 iGATA4-배아체 프로토콜은 포유류 배아의 계통 명세와 초기 발달 과정을 연구할 수 있는 견고하고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다. 재현성과 적응성 덕분에 고처리량 환경, 약리학, 유전자 스크리닝 응용 분야에 적합합니다. 따라서 iGATA4-블라스토이드는 초기 발달 메커니즘을 조사하고 다양한 교란이 착상 전 발달에 미치는 영향을 평가하는 강력한 시스템을 제공합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	일반 배지 준비에 사용
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	TX 배지 준비 및 블라스토이드 공동화에 사용
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	마이크로웰 응집 플레이트; 블라스토이드 준비에 사용
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	블라스토이드 준비에 사용
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	면역염색 중 블라스토이드 이동을 위한 와이드 보어 피펫 팁.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	배지 준비에 사용
Caffeine	Sigma	58-08-2	iGATA4-블라스토이드에서 환경 요인으로 테스트에 사용
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	면역형광에 사용, 1:200에서 사용
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	다른 브랜드/모델도 작동할 수 있습니다.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	배지 준비에 사용
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	일반 조직 배양 목적에 사용
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	면역형광에 사용, 1:500-1:1,000에서 사용
DMEM	Gibco	11995040	FC 배지 준비에 사용
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	N2B27 및 TX 배지 준비에 사용
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	DMEM-LM를 Ham's F-12 Nutrient Mix 분말로 최종 1x 농도로 보충하여 Met- 및 Leu-free DMEM/F12를 얻습니다.
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	면역형광에 사용, 1:500-1:1,000에서 사용
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	면역형광에 사용, 1:500-1:1,000에서 사용
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	면역형광에 사용, 1:500-1:1,000에서 사용
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	면역형광에 사용, 1:500-1:1,000에서 사용
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	면역형광에 사용. 4°C에서 해동하고, -20°C에서 분리 저장합니다.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	블라스토이드 준비 중 iGATA4 유도에 대한
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	우리 실험실에서 사용되었으며, 다른 것도 작동합니다. 튜브 및 플레이트 어댑터가 필요합니다.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	면역형광에 사용
FGF4	R&D Systems	5846-F4	배지 준비에 사용
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	이미지 분석에 사용
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	면역형광에 사용, 1:500에서 사용
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	일반 조직 배양 목적에 사용
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	면역형광 및 이미징에 사용
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-alanyl-L-glutamine 보충제; 배지 준비에 사용
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	저단백질 식이 조건에서 DMEM-LM 보충제로 사용.
Heparin	Sigma	H3149	배지 준비에 사용
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	다른 브랜드/모델도 작동할 수 있습니다.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	TX 배지 준비에 사용.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	TX 배지 준비에 사용.
IL-11	PeproTech	200-11	TX 배지 준비에 사용.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	이미지 분석 및 이미지 준비에 사용.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	배지 준비에 사용
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Zernicke-Goetz 연구소에서 요청 시 사용 가능한 세포주
Insulin	Sigma	I9278	TX 배지 준비에 사용.
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