DSS 유발 궤양성 대장염 마우스에서 량쉐 디황 증후의 통합 네트워크 약리학, 대사역학 및 생체 내 검증

요약

이 프로토콜은 네트워크 약리학, 비표적 대사체학, 생 체 내 검증을 통합하여 덱스트란 황산염 나트륨 유도 마우스 모델에서 량쉐 디톉 증후제의 다성분 기전을 밝히는 재현 가능한 워크플로우를 설명합니다.

초록

궤양성 대장염(UC)은 지속적인 장 염증과 대사 조절 장애를 특징으로 하는 만성 염증성 장 질환입니다. 전통 중의학(TCM) 처방은 염증성 질환 임상 실무에서 널리 사용되며; 그러나 이들의 다중 구성 요소 및 다중 표적 메커니즘을 체계적으로 실험적으로 밝히는 방법은 제한적입니다. 본 논문은 네트워크 약리학, 비표적 대사체학, 생 체 내 검증을 통합하여 덱스트란 황산염 나트륨(DSS) 유도 쥐 모델에서 량쉐 디훅 데코션(LXDHD)의 항염 효과를 조사하기 위한 재현 가능한 실험 프로토콜을 제시합니다. 워크플로우에는 한방 데코 조제, DSS 유도 대장염 모델링, 질병 활동성 평가, 조직병리학적 및 혈액학 평가, 혈청 사이토카인 측정, LC–MS 기반 대사체 프로파일링, 계산 네트워크 분석이 포함됩니다. 이 통합 접근법을 통해 DSS 유발 대장염이 성공적으로 확립되었고, LXDHD 치료는 질병 활동 지수, 대장 길이, 조직병리학적 손상, 염증성 사이토카인 수치, 대사 프로필에서 측정 가능한 개선을 가져왔습니다. 네트워크 약리학 및 대사체학 분석을 통해 이 프로토콜이 치료 개입과 관련된 주요 표적, 경로 및 대사산물을 식별할 수 있음을 추가로 입증했습니다. 이 시각화되고 표준화된 워크플로우는 염증성 장 질환에서 다성분 TCM 조제의 약리학적 기전을 연구하는 실용적인 방법론적 틀을 제공하며, 다른 한방 처방 및 질병 모델에도 적용할 수 있습니다.

서론

궤양성 대장염(UC)은 대장의 점막 염증이 지속되어 복통, 설사, 직장 출혈, 체중 감소와 같은 증상을 유발하는 만성 염증성 장 질환입니다^. UC의 발생률은 전 세계적으로 증가하고 있으며, 이는 의료 시스템에 상당한 부담을 주고 환자의 삶의 질을 크게 저하시키고 있습니다^. UC의 병인은 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 누적된 증거는 면역 반응 조절 이상, 염증성 사이토카인의 과도한 생성, 산화 스트레스, 대사 장애가 질병 발병 기전에서 중심적인 역할을 한다는 것을 시사합니다 ^4,5.

현재 UC의 치료 전략은 주로 아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 면역억제제, 그리고 염증성 사이토카인을 표적으로 하는 생물학적 제제를 포함합니다^. 이러한 치료법은 증상 완화와 관해를 유도할 수 있지만, 장기 사용 시 부작용, 높은 비용, 그리고 변동성 있는 치료 반응과 연관되어 있습니다 ^7,8,9. 더불어, 상당수의 환자가 지속적인 관해를 달성하지 못하여, 안전성과 다표적 효능이 향상된 대체 또는 보완적 치료법의 필요성을 부각시킵니다.

전통 중의학(TCM)은 수세기 동안 위장 질환 치료에 널리 사용되어 왔으며, UC¹⁰과 같은 복잡한 염증 질환에서 그 잠재적 이점으로 점점 더 인정받고 있습니다. 단일 표적 치료와 달리, 한의학 공식은 일반적으로 여러 성분이 여러 표적과 경로에 작용하여 치료 효과를 발휘하므로, UC¹¹의 다인자 특성을 더 잘 다룰 수 있습니다. 임상 및 실험 연구들은 특정 한의학 처방이 면역 반응을 조절하고 염증을 억제하며 장 장벽의 완전성을 보호하고 대사 항상성을 조절할 수 있음을 시사했습니다. 12,13,14,15.

량설 디황 진술(LXDHD)은 전통적으로 '혈액을 식히고 열을 정화'하는 고전 한의학 처방으로, 염증성 및 출혈성 질환에 임상적으로 적용되어 왔습니다¹⁶. 처방에는 Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis, Glycyrrhiza uralensis 등 다양한 허브가 포함되어 있습니다. 현대 약리학 연구들은 여러 성분 허브와 그 활성 성분이 항염증, 항산화, 면역조절 특성을 가지고 있음을 보여주었다 17,18,19. 그러나 UC에서 LXDHD의 전반적인 치료 효과와 기전은 아직 체계적으로 밝혀지지 않았습니다.

네트워크 약리학은 다성분 한방 조제와 질병 관련 분자 표적 간의 복잡한 상호작용을 탐구하는 효과적인 접근법으로 부상했습니다²⁰. 여러 데이터베이스의 정보를 통합함으로써 네트워크 약리학은 잠재적 활성 화합물, 치료 표적, 신호 전달 경로를 예측하여 TCM 메커니즘에 대한 시스템 수준의 이해를 제공합니다²¹. 그럼에도 불구하고 네트워크 약리학은 주로 데이터베이스 예측에 의존하며 생체 내 대사 변화를 직접적으로 반영하지 않습니다.

대사체학은 전 세계 대사 변화를 프로파일링하는 강력한 도구로서 질병 병태생리와 치료 반응에 대한 상호 보완적 통찰을 제공합니다²². UC에서는 대사체 분석 결과 지질과 아미노산 대사, 그리고 산화 스트레스 관련 경로^23,24,25에 유의미한 장애가 발견되었습니다. 대사체학과 네트워크 약리학을 통합하면 예측된 분자 표적과 실제 대사 표현형 간의 간극을 메워 기전적 해석의 신뢰성을 높일 수 있습니다.

본 연구에서는 네트워크 약리학, 비표적 대사체학, 실험적 검증을 결합한 통합 전략을 사용하여 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유도 UC 마우스 모델에서 LXDHD의 항염증 효과와 잠재적 기전을 조사하였습니다(그림 1A). 이 전반적인 방법론적 설계는 실리코 내 예측과 생체 내 대사체 및 표현형 검증을 통합하여 확립된 엄격한 연구 프레임워크에 부합합니다²⁶. 네트워크 약리학 분석을 통해 활성 화합물, 잠재적 치료 표적, LXDHD 치료로 강화된 신호 전달 경로를 규명하였습니다. 비표적 대사체학을 통해 UC에 의해 유도된 대사 변화와 LXDHD에 의한 조절을 특성화하였습니다. 또한, 질병 활동성, 조직병리학적 변화, 혈액학적 매개변수, 염증성 사이토카인 수치 평가 등 생 체 내 실험을 통해 주요 발견이 검증되었습니다.

계산 예측, 대사 프로파일링, 생물학적 검증을 통합함으로써, 본 연구는 UC에서 LXDHD의 치료 효과를 근본적으로 하는 다중 성분, 다중 표적, 다중 경로 메커니즘을 포괄적으로 이해하고자 합니다. 이 연구는 LXDHD를 UC에 대한 잠재적 보완 치료제로 활용할 수 있다는 실험적 증거를 제공할 뿐만 아니라, 다른 복잡한 TCM 조제법의 메커니즘을 조사할 방법론적 틀도 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험 절차는 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 난징 중의대학 산하병원 동물윤리위원회(승인번호 #2025DW-034-01)의 승인을 받았습니다. 승인일: 2025년 3월 24일). 양설 디황 탕 조제는 중국 약전(Chinese Pharmacopoeia²⁷)에 명시된 절차에 따라 이루어졌습니다. 프로토콜에서 사용되는 시약, 화학물질 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 양설 디황 끓임(LXDHD) 조제법

1. LXDHD의 표준 제형에 따라 건조 한방 재료를 준비하세요. 11가지 성분 허브의 정확한 약초 성분, 식물명, 그리고 정확한 처방 복용량은 표 1에 명시되어 있습니다.
   참고: 모든 허브 재료는 사용 전에 자격을 갖춘 약사가 진료하여 식물학적 동일성과 품질 일관성을 보장해야 합니다. 재현성을 위해 인증 기록을 유지하세요.
2. 화약 준비
   1. 모든 허브 재료는 깨끗하고 환기가 잘 되는 환경에서 실온에서 자연 건조하세요.
   2. 각 허브를 기계식 분쇄기로 개별적으로 분쇄하여 미세한 가루를 얻습니다.
   3. 정해진 비율에 따라 가루를 섞으세요.
   4. 혼합 분말을 80메시 체(내경 180 μm ± 7.6 μm)에 통과시켜 입자 크기가 균일하도록 합니다.
   5. 체로 체화된 가루를 철저히 균질화하세요.
      참고: 균일한 입자 크기는 일관된 추출 효율을 위해 필수적입니다. 불완전한 분쇄나 불균일한 혼합은 화학 조성에 변동성을 초래할 수 있습니다.
3. LXDHD 수성 추출물 제조
   1. 혼합된 허브 가루를 정확히 무게 재고 증류수를 1:10(w/v) 비율로 넣으세요.
   2. 혼합물을 끓일 때까지 가열한 후 20분간 찜찜 끓입니다.
   3. 추출물을 여과하고 여과물을 수집하세요.
   4. 잔여물에 신선한 증류수를 넣고 추가로 20분 동안 다시 적장합니다.
   5. 두 여과체를 결합하여 최종 LXDHD 수용성 추출물을 얻습니다.
      참고: 이중 절제는 수용성 성분과 적당히 용해성 성분 모두를 효율적으로 추출하는 데 필수적입니다.
4. 농축 및 저장
   1. 원하는 농도에 도달할 때까지 감압 또는 부드러운 가열로 혼합된 증액을 농축합니다.
   2. 추출물을 실온까지 식히세요.
   3. 준비된 LXDHD 추출물을 4°C에 보관하고 48시간 이내에 사용하세요.
      참고: 반복적인 냉동-해동 사이클은 생리활성 화합물을 분해하고 실험적 재현성을 저하시킬 수 있으므로 피하세요.
5. 행정
   1. 투여 전에 추출물을 실온으로 옮기세요.
   2. 실험 분류에 따라 지정된 용량으로 경구 가베지로 LXDHD의 농축 수용 흡입물을 쥐에게 투여합니다.

2. 동물 실험 설계

1. 가축과 주거 환경
   1. 인증된 실험동물 공급업체로부터 수컷 C57BL/6 마우스(6-8주, 20-25g)를 구입하세요.
   2. 표준 실험실 조건에서 12시간의 빛과 어둠 주기, 조절된 온도(22–25 °C), 상대 습도(50%–60%)를 가진 집쥐.
   3. 실험 내내 쥐들이 표준 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 하세요.
   4. 실험 전 최소 7일간 쥐가 적응할 시간을 주세요.
      참고: 이후 실험에는 정상적인 활동과 체중을 가진 건강한 쥐만 포함하세요.
2. 그룹화 및 선량 계산
   1. LXDHD의 마우스 용량을 약 리학적 실험 방법론에 따라 표준 성인 체중 70kg과 일일 임상 용량 8.4g²⁸을 기준으로 인간-동물 용량 변환 원칙에 따라 계산하세요.
   2. 마우스를 무작위로 다음 그룹으로 나누어 나누어 (n=6마리씩): 정상 대조군, DSS 유발 UC 모델 그룹, 저용량 LXDHD 그룹(1.09 g/kg), 고용량 LXDHD 그룹(2.18 g/kg), 5ASA 양성 대조군(100 mg/kg)²⁹.
      참고: 선택 편향을 최소화하기 위해 난수 표를 사용하여 무작위화를 수행하세요.
   3. UC 유도 및 약물 투여
      1. 식수에 2.5% (w/v) DSS 용액을 준비하세요.
      2. 모델, LXDHD 처리군, 5ASA 그룹의 쥐에게 7일 연속³⁰일 동안 DSS 솔루션을 자유롭게 투여함.
      3. 정상 대조군 쥐에게는 정제된 식수를 제공하세요.
      4. 실험 기간 동안 해당 용량의 경구 개비지로 LXDHD와 5ASA를 하루 한 번 투여합니다.
      5. 일반 대조군과 DSS 모델 그룹에 동일한 양의 차량 해를 투여합니다.
         참고: DSS 용액을 신선하게 준비하고 2일마다 교체하세요. DSS 배치는 대장염 유발 효능이 다양할 수 있습니다; 새로운 배치를 사용할 때 파일럿 테스트를 수행하세요. DSS 유도 UC 모델의 성공적인 확립은 점진적인 체중 감소, 혈변, 높은 DAI 점수, 그리고 뚜렷한 결장 단축이 특징입니다. 이 기준들과 쥐 실험의 방법론적 설계는 확립된 참조 기준과 일치합니다³¹.
3. 외부 대사체를 위한 블랭크 및 약물 함유 혈청 제제
   1. 건강한 수컷 C57BL/6 마우스 별도의 코호트를 사용하세요.
   2. 쥐를 무작위로 두 그룹으로 나눕니다: 블랭크 그룹과 LXDHD 그룹.
   3. LXDHD 그룹에 2.18 g/kg의 경구 개비지로 7일 연속 투여.
   4. 빈 그룹에 같은 양의 증류수를 투여합니다.
   5. 최종 투여 후 1시간 후에 혈액 샘플을 채취하세요.
   6. 3.5절에서 설명한 대로 혈청을 얻기 위해 혈액 샘플을 처리합니다.

3. 질병 활동 평가

1. 실험 중에는 체중, 대변 농도, 대변 출혈 현황을 매일 모니터링하세요.
2. 체중 감소, 대변 농도, 대변 출혈을 바탕으로 질병 활동 지수(DAI)를 계산하세요. 구체적인 점수 체계는 표 3에 자세히 나와 있습니다. 계산
   최종 DAI 점수는 이 세 가지 매개변수의 평균(또는 합)으로³².
3. 8일차 종료 시점에 각 그룹의 쥐에게 1% 펜토바르비탈나트륨(30 mg/kg)으로 마취합니다. 각 마우스의 후안와 정맥신경총에서 약 400 μL의 혈액을 채취합니다. 그 후, 미국 수의학회(AVMA)의 동물 안락사 지침(그림 1B)에 엄격히 따라 자궁경부 탈구로 동물을 안락사하여 사망을 보장한다.
   참고: 뒷발의 발가락과 족저면을 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인; 금단 반응이 없다면 충분한 마취 깊이를 나타냅니다.
4. 대장 조직을 채취하고 질병 심각도를 판단하기 위해 대장 길이를 측정하세요.
   참고: 대장 길이 단축은 DSS 유발 대장염 중증도의 특징으로 간주됩니다.³³.
5. 혈청 채취
   1. 채취한 혈액 샘플 일부를 실온에서 1시간 동안 응고시키세요.
   2. 1,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리기를 샘플링하여 혈청을 얻습니다.
   3. 인터루킨(IL)-1β, IL-6, IL-17, 종양괴사 인자-알파(TNF-α), IL-10의 혈청 농도를 정량화합니다.
   4. 조직병리학적 분석을 위해 대장 조직 샘플을 채취하세요.
   5. 남은 혈액 샘플을 말초혈액 분석에 사용하세요.
   6. 대사체 분석을 위해 추가 혈청 샘플을 비워두세요.

4. 헤마톡실린-이오신(H&E) 염색

1. 대장 조직을 4% 파라포름알데히드에 최소 24시간 이상 고정하세요.
2. 등급별 에탄올 시리즈를 통해 조직을 탈수합니다.
3. 자일렌으로 된 투명 조직과 파라핀에 박혀 있습니다.
4. 미세토임을 사용해 조직 절편(두께 3–5 μm)을 절단합니다.
5. 절면은 자일렌으로 탈파라핀화합니다.
6. 등급 에탄올로 부위를 재수화하세요.
7. 핵 시각화를 위한 헤마톡실린으로 염색 절편을 합니다.
8. 세포질 염색을 위해 에오신으로 반염색 부위를 사용하세요.
9. 광학 현미경으로 조직병리학적 변화를 관찰하고, 관련 영상 소프트웨어를 사용해 대표적인 이미지를 촬영합니다.
10. 염증의 심각도, 손상 깊이, 지하 손상을 기반으로 조직학적 점수(HCS)를 평가합니다.
11. 상세한 조직학적 평가 기준은 표 4 를 참조하십시오.
    참고: 조직 삽입, 절편 절단, 염색 등의 대표적인 이미지를 촬영하여 프로토콜 시각화를 향상시킵니다.

5. 말초 혈액 분석

1. 말초혈 샘플을 EDTA-K2 항응고제 튜브(혈액 1mL당 1.5 mg EDTA)에 채취하세요.
2. 튜브를 8–10번 부드럽게 뒤집어 섞어 적절히 섞으세요.
3. 종별 보정을 적용한 3부분 수의 혈액학 분석기(Mindray BC-2600vet)를 사용해 혈액 세포 수를 분석합니다.
4. 샘플은 4°C에서 운반하세요.
5. 샘플은 채취 후 4시간 이내에 분석하세요.
   참고: 용혈이나 응고가 있는 샘플은 분석에서 제외합니다.

6. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

참고: IL-6, IL-17, IL-1β, TNF-α는 주요 항염증 사이토카인이며, IL-10은 주요 항염증 사이토카인입니다. 이 사이토카인은 염증 반응의 존재와 심각도를 반영합니다³⁴.
이 사이토카인의 측정은 염증 과정을 이해하고 항염증 치료의 효과를 평가하는 데 매우 중요합니다.

1. 후안와 정맥신경총에서 혈액 샘플을 채취하세요.
2. 샘플을 실온에서 1시간 동안 응고시키세요.
3. 1,000 × g 원심분리기를 4°C에서 15분간 샘플링하여 혈청을 얻습니다.
4. 상업용 ELISA 키트를 사용하여 IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α, IL-10의 혈청 농도를 측정합니다.
5. 표준 데이터 수집 소프트웨어가 장착된 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도를 측정합니다.
6. 표준 곡선을 기준으로 사이토카인 농도를 계산하세요.
   참고: 모든 샘플과 표준을 복제하여 분석하여 기술적 변동성을 줄입니다.

7. 량쉐 디황 탕제 LC–MS 분석

1. 샘플 준비
   1. LXDHD 혼합 생 허브 가루 10g을 정확히 측정했습니다.
   2. 가루를 30mL의 뜨거운 물에 녹입니다.
   3. 30분간 초음파 추출을 하세요.
   4. 추출물 100 μL과 메탄올 400 μL을 혼합합니다.
   5. 10분간 소용돌이.
   6. 원심분리기 14,000 × g 에서 10분간 돌립니다.
   7. 상정액을 시험용으로 채취하세요.
2. LC–MS 조건
   1. Q 질량 분석기와 결합된 LC 시스템을 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행합니다.
   2. C18 컬럼(150 × 2.1 mm, 1.8 μm)을 사용하세요.
   3. 이동상은 다음과 같이 설정합니다: 용매 A, 0.1% 개미산을 물에 넣고; 용매 B, 메탄올.
   4. 유량을 0.30 mL/min로 설정하세요.
   5. 컬럼 온도를 35°C로 설정하세요.
   6. 주입 용량을 5 μL로 설정하세요.
   7. 다음과 같은 그라디언트 용출 프로그램을 적용하세요:
      0–2분, 5% B;
      2–15분, 5–95% B;
      15–18분, 95% B;
      18–18.1분, 95–5% B;
      18.1–22분, 5% B.
   8. 질량분석법 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 시스 가스 유량 35 arb; 보조 가스 유량 10 Arb; 분무 전압, 3.5 kV(양극)와 2.8 kV(음극); 모세혈관 온도 320 °C; 보조 가스 히터 온도, 350 °C.
   9. 양성 및 음의 이온 모드에서 MS 데이터를 m/z 100–1500(해상도: 70,000)의 전체 MS 스캔 범위로 획득할 수 있습니다.
   10. 데이터 의존 MS2(dd-MS2) 스캔을 17,500 해상도로 수행합니다.
   11. mzCloud 데이터베이스를 사용하여 원시 데이터를 처리하고 화합물을 식별할 수 있습니다.

8. 혈청 비표적 대사체 분석

1. 혈청 샘플 준비 및 품질 관리(QC)
   1. 혈청 샘플을 얼음 위에 해동하세요.
   2. 50 μL 혈청을 1.5 mL 원심분리관에 옮깁니다.
   3. 200 μL 차가운 메탄올/아세토니트릴(1:1, v/v)을 추가합니다.
   4. 단백질을 침전시키기 위해 1분간 소용돌이를 사용하세요.
   5. 얼음 위에 15분간 부양하세요.
   6. 원심분리기 14,000 × g 온도에서 4 °C에서 15분간 가열.
   7. 상정액을 새 튜브로 옮기세요.
   8. 진공 농축기를 사용해 추출물을 건조하세요.
   9. 100 μL 아세토니트릴/물(1:1, v/v)에서 재구성합니다.
   10. 완전히 소용돌이.
   11. 다시 14,000 × g에서 4 °C에서 15분간 원심분리기를 사용했습니다.
   12. LC-MS 분석을 위해 상청액을 채취하세요.
   13. 각 샘플에서 10 μL 알리코트를 모아 QC 샘플을 준비합니다.
   14. 8–10개의 실험 샘플마다 1개의 QC 샘플을 주입하여 기기의 안정성과 반복성을 모니터링합니다.
2. LC-MS 획득 설정
   1. C18 컬럼(150 × 2.1 mm, 1.8 μm)을 사용하는 LC 시스템을 사용하여 크로마토그래피 분리를 수행합니다.
   2. 컬럼 온도를 35°C로 설정하세요.
   3. 유량을 0.30 mL/min로 설정하세요.
   4. 주입 부피를 2 μL(양극 모드) 또는 5 μL(음수 모드)로 설정하세요.
   5. 용매 A(물에 0.1% 개미산)와 용매 B(아세토니트릴, 0.1% 개미산)를 사용하세요.
   6. 선형 구배 용출 프로그램을 적용하세요.
   7. 질량분석기를 양성 및 음의 HESI 모드로 작동시키세요.
   8. 질량 스캔 범위를 m/z 100–1500으로 설정하세요.
   9. 분사 전압을 3.5 kV(양극)와 2.8 kV(음극)로 설정하세요.
   10. 모세관 온도를 320 °C로 설정하세요.
3. 데이터 처리 및 차별 대사물 식별
   1. 원시 LC-MS 데이터(.raw 파일)를 소프트웨어로 가져오세요.
   2. 피크 정렬, 피크 피킹, 기준선 보정을 수행합니다.
   3. 추출한 피크 면적 특징을 전체 이온 강도로 정규화합니다.
   4. mzCloud 및 ChemSpider 데이터베이스와 대조하여 정확한 질량(질량 허용성 < 5 ppm)과 MS/MS 분절 패턴을 대조하여 대사산물을 식별합니다.
   5. 다변량 통계 분석(PCA 및 OPLS-DA/PLS-DA)을 수행합니다.
   6. 다음 임계값을 기준으로 차별대사산물을 정의합니다: VIP > 1.0 및 p < 0.05(학생 t-검정).

9. 네트워크 약리학 분석

참고: 네트워크 약리학을 활용해 UC^35,36에서 LXDHD의 활성 성분과 주요 표적을 예측하였습니다. 방법론에는 데이터베이스 마이닝, 화학 정보 처리, 생체 활성 데이터 수집, 단백질 표적 추출, 유전자 발현 프로파일링, 상호작용 네트워크 구축, 경로 농축 분석 등이 포함됩니다^37,38.

1. 능동 화합물 선별
   1. OB ≥ 30%와 ≥DL 0.18을 사용하여 전통 중의학 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석(TCMSP) 데이터베이스(2025년 12월 10일 접속)에서 활성 화합물을 검색하세요.
   2. 보충제는 PubMed와 Web of Science (2025년 12월 10–15일)에서 문헌 검색을 통해 이루어졌습니다.
   3. UniProt 데이터베이스를 사용하여 표적을 표준화하세요 (2025년 12월 15일 접속).
2. 질병 표적 식별
   1. GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank 데이터베이스에서 UC 관련 표적을 수집하세요 (2025년 12월 15일 접속).
3. 네트워크 구축 및 분석
   1. R 소프트웨어의 VennDiagram 패키지를 사용하여 교차하는 타겟을 식별합니다.
   2. Cytoscape 소프트웨어를 사용해 네트워크를 구축하세요.
   3. NetworkAnalyzer 플러그인과 CytoNCA 플러그인을 사용하여 토폴로지를 분석하세요.
4. PPI 네트워크 및 핵심 목표 식별
   1. 교차하는 타겟을 STRING 데이터베이스에 가져오세요.
   2. 종을 호모 사피엔스로 제한하세요.
   3. 고립된 노드를 제거하세요.
   4. PPI 점수 기준을 0.9> 적용하세요.
   5. 데이터를 내보내고 소프트웨어에서 분석하세요.
   6. DC, BC, EC, CC, NC, LAC를 계산하세요.
   7. 중앙값 기반 필터링을 수행하여 서브네트워크를 생성하고 핵심 타겟을 식별합니다³⁹.
5. GO와 KEGG 농축 분석
   1. R 및 바이오컨덕터 패키지를 사용하여 GO 및 KEGG 농축을 수행합니다.
   2. org를 포함한 R 패키지를 사용하세요. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi, ggplot2.
   3. 유의성 임계값을 p = 0.05, q = 0.05로 설정하세요.
   4. MF, BP, CC 카테고리에 대한 GO 분석을 수행하세요.
   5. KEGG 경로 농축 및 분류⁴⁰을 수행하세요.
6. 분자 도킹
   1. TCMSP에서 SDF 형식으로 복합물 구조를 다운로드하세요.
   2. AlphaFold에서 단백질 구조를 PDB 형식으로 다운로드하세요.
   3. CB-DOCK2 웹 서버(CADD Lab, 쓰촨 대학교, 청두, 중국)를 사용하여 도킹을 수행합니다.
   4. 수용체와 리간드 파일을 그에 맞게 정의하세요.
   5. 최적의 결합 자세와 결합 에너지를 기록하세요.
      참고: 도킹은 유전 알고리즘⁴¹을 사용해 수행되었습니다. 결과는 결합 에너지에 따라 순위가 매겨졌습니다.

10. 통계 분석

1. GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
2. 정량적 데이터를 표준편차(SD)± 평균 단위로 표현합니다.
3. 샤피로-윌크 검정을 이용해 정규성을 검정합니다.
4. 분산의 균질 여부를 브라운-포사이스 검정을 사용해 검정합니다.
5. 정규분포 데이터에 대해 Tukey의 사후 검정으로 일방향 ANOVA를 수행하세요.
6. 비모수 데이터에 대해 던의 검정으로 크루스칼-월리스 검정을 수행하세요.
7. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하라.
   참고: p-값이 작을수록 그룹 간 통계적 차이가 더 크다는 뜻입니다.

결과

UC에서 LXDHD의 네트워크 약리학 분석

네트워크 약리학을 적용하여 UC에서 LXDHD의 잠재적 치료 표적과 분자 기전을 예측하였습니다. TCMSP 데이터베이스에서 우호적인 약동학적 특성을 가진 화합물은 총 211종을 선별했으며, 이 중 36종은 Scutellaria baicalensis, 37종은 Phellodendron chinense, 10종은 Rehmannia glutinosa, 11종은 Paeonia suffruticosa, 29종은 Paeonia veitchii, 5종은 탄화된 Sanguisorba officinalis, 22종은 탄화된 Platycladus orientalis, 18종은 Saposhnikovia divaricata, 5종은 C...

토론

이 방법은 네트워크 약리학, 비표적 대사체학, 생 체 내 검증을 통합한 시각화되고 재현 가능한 실험 워크플로우를 제시하여 DSS 유도 UC 마우스 모델에서 TCM 포뮬러의 항염증 효과를 조사합니다. 기존의 약리학 연구들이 주로 고립된 기전적 결론에 집중하는 것과 달리, 이 프로토콜은 방법론적 틀 자체의 견고함을 강조하면서 중요한 생물학적 통찰을 드러냅니다. 이 통합 워크플로우의 주요 장점은 고립된 분석 방법의 내재적 한계를 극복할 수 있다는 점입니다. 전통적인 네트워크 약리학은 정적인 순수 인실리코 데이터베이스에 크게 의존하며, 이는 높은 위양성률을 자주 발생시키고 생체 내 생체 변형을 제대로 반영하지 못합니다. 계산 예측과 외인성 대사체학 및 생체 내 표현형 검증을 체계적으로 연결함으로써, 이 프로토콜은 예측된 분자 표적을 확정된 약물 유래 순환 대사산물과 직접 연결하고, 생물학적 접근 불가능한 화합물을 걸러내며, 다성...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5-아미노살리실산 (5-ASA)	시그마-올드리치	A3537	궤양성 대장염에 대한 양성 대조 약물; 경구 개비지로 100 mg/kg으로 투여됨.
아세토니트릴 (LC-MS 등급)	머크	100030	대사체학 샘플 준비와 LC-MS 이동상에 사용됩니다.
알파폴드 단백질 구조 데이터베이스	EMBL– 유럽 생물정보학 연구소	https://alphafold.ebi.ac.uk/	표적 단백질의 예측된 3차원 구조를 얻는 데 사용되는 데이터베이스입니다.
안젤리카 시넨시스 (당귀)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 1.6g).
CB-독2	CADD 실험실	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	분자 도킹 및 리간드&ndash 예측에 사용되는 웹 기반 플랫폼; 단백질 결합 방식.
시트러스 아우란티움 (지커)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.5 g).
화합물 발견자 소프트웨어	써모피셔 사이언티브	버전 3.3	LC&ndash 데이터 처리 및 화합물 식별에 사용됩니다.
CTAn 소프트웨어	브루커	버전 1.17	Micro-CT 3D 영상 재구성 및 골 침식 분석에 사용됩니다.
사이토스케이프	사이토스케이프 컨소시엄	버전 3.8.0	네트워크 구축 및 시각화에 사용되는 소프트웨어입니다.
덱트론 황산나트륨 (DSS)	MP 생의학	160110	분자량 36,000– 50,000 Da; 쥐의 궤양성 대장염을 유도하는 데 사용되었습니다.
EDTA-K2 항응고제 튜브	시노팜 화학 시약 주식회사	해당 없음	말초 혈액 채취에 사용됩니다.
이오산 염색 솔루션	바이오샤프	해당 없음	H&에서 세포질 대염색에 사용됨 E 염색입니다.
에탄올	청두 쾰른 케미컬 주식회사	64-17-5	조직 탈수에 사용됩니다.
개미산 (LC-MS 등급)	머크	5.33002	LC-MS 이동상 준비에 사용됨.
글리시리자 우랄렌시스 (간차오)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.5 g).
그래프패드 프리즘	그래프패드 소프트웨어	버전 9.0	통계 분석 및 그래픽 표현에 사용됩니다.
혈액학 분석기	마인드레이	BC-2600vet	혈액 루틴 분석을 위한 3단계 수의학 혈액학 분석기입니다.
헤마톡실린 염색 용액	바이오샤프	BL700B	Used for H& 대장 조직 절편의 E 염색.
고속 원심분리기	히타치	CT15E/CT15RE	세럼 및 샘플 준비에 사용됩니다.
IL-10 ELISA 키트 (마우스)	메이미안	MM-0176M2	혈청 IL-10 수치를 평가하는 데 사용됨.
IL-17 ELISA 키트 (마우스)	아클론	RK00039	혈청 IL-17 수치를 측정하는 데 사용됨.
IL-1&베타; 엘리사 키트 (마우스)	아클론	RK00006	혈청 IL-1과 베타 검출에 사용됨; 레벨.
IL-6 ELISA 키트 (마우스)	아클론	RK00008	혈청 IL-6 수치를 정량화하는 데 사용됨.
ImageJ (피지) 소프트웨어	국립보건원(NIH)	버전 1.53c	이미지 처리 및 정량화에 사용되는 오픈 소스 소프트웨어입니다.
라이카 애플리케이션 스위트 X (LAS X)	라이카 마이크로시스템즈	버전 3.7	조직병리학적 슬라이드를 캡처하는 데 사용되는 영상 소프트웨어입니다.
메탄올 (LC-MS 등급)	머크	106035	대사체학 샘플 준비와 LC-MS 이동상에 사용됩니다.
마우스 (수컷 C57BL/6)	안노강 바이오테크놀로지 주식회사	해당 없음	실험동물 (6세 및 대쉬; 8주, 20주와 대시; 25g) DSS 유발 UC 모델에 사용되었습니다.
mzCloud 데이터베이스	써모피셔 사이언티브	https://www.mzcloud.org/	MS/MS 스펙트럼 매칭에 사용되는 데이터베이스입니다.
광학 현미경	라이카	DM500	조직병리학적 관찰에 사용됩니다.
Paeonia lactiflora (치 샤오)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.6g).
피질 피질(Paeonia suffruticosa cortex) (Mu Dan Pi)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.5 g).
파라포름알데히드 (4%)	시노팜 화학 시약 주식회사	해당 없음	대장 조직 고정에 사용됩니다.
병리학적 미세절기	라이카	RM2016	파라핀 조직 절편 준비에 사용됩니다.
펠로덴드론 치넨세 (황보)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.5 g).
동부석 (Ce Bai Ye Tan)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.7 g).
Q 능동 고해상도 질량분석기	써모피셔 사이언티브	Q 익스액티브	LC&ndash 분석을 위한 Orbitrap 기반 질량분석기.
R 소프트웨어	R 통계 컴퓨팅 재단	버전 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	GO 및 KEGG 농축 분석에 사용되는 소프트웨어입니다.
글루티노사 레만니아 (성디황)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 2.1g).
상귀소르바 오피시날리스 (디유탄)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.6g).
사포슈니코비아 디바리카타 (팡 펑)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.3 g).
스쿠텔라리아 바이칼렌시스 (황친)	장쑤성 중의학병원	배치: 2409001	LXDHD의 성분 허브 (용량: 0.5 g).
펜토바르비탈 나트륨 (1%)	시그마-올드리치	P3761	샘플 채취 전 동물 마취에 사용됩니다.
소프트맥스 프로 소프트웨어	분자 장치	버전 7.1	ELISA용 마이크로플레이트 리더와 함께 사용되는 데이터 수집 및 분석 소프트웨어.
STRING 데이터베이스	스트링 컨소시엄	https://string-db.org/	단백질 및 ndash에 사용되는 데이터베이스; 단백질 상호작용 분석.
TCMSP 데이터베이스	TCMSP 플랫폼	https://tcmsp-e.com/	활성 화합물을 선별하고 약물 표적을 예측하는 데 사용되는 데이터베이스입니다.
TNF-&α; 엘리사 키트 (마우스)	아클론	RK00027	혈청 TNF-&α 판정에 사용; 집중도.
얼티밋 3000 RS LC 시스템	써모피셔 사이언티브	얼티밋 3000 RS	UHPLC 시스템이 질량분석과 결합된 것입니다.
초음파 세척기	쿤산 초음파 기기 주식회사	KQ3200E	LXDHD의 초음파 추출에 사용됩니다.
UniProt 데이터베이스	유니프로트 컨소시엄	https://www.uniprot.org/	유전자 및 단백질 이름 표준화에 사용되는 데이터베이스입니다.
보텍스 믹서	베이징 파워스타 테크놀로지 유한회사	LC-소용돌이-P1	샘플 믹싱에 사용됩니다.
웰치 AQ-C18 컬럼 (150 & 배; 2.1 mm, 1.8 & mu; m)	웰치 재료	AQ-18-15021	대사산물과 한방 성분 분리에 사용되는 컬럼.
자일렌	청두 쾰른 케미컬 주식회사	1330-20-7	조직학적 처리 중 조직 정리에 사용됩니다.