HEK293 세포에서 분할 발광 태깅을 이용한 살아있는 세포의 mRNA 번역 역학 측정

요약

본 연구에서는 분할 발광 태깅(split luminescent tagging)을 이용하여 HEK293 세포 내에서 살아있는 상태의 mRNA 번역 역학을 측정하는 유연하고 고처리량 분석이 가능한 방법을 제시합니다. 이 다목적 분석법은 구조적 영향을 구분하고, 시험관 내 전사(in vitro transcription) 최적화를 지원하며, mRNA 치료제 개발 과정을 효율화합니다.

초록

COVID-19에 대응하기 위한 신속한 백신 개발은 메신저 RNA(mRNA) 치료제가 약물 개발을 변화시킬 수 있는 잠재력을 보여주었습니다. 성숙한 mRNA와 마찬가지로, in vitro 전사된 mRNA는 5’ 캡, 비번역 부위(UTR), 코딩 서열 및 poly(A) 꼬리를 포함한 동일한 요소들을 가지고 있습니다. 이러한 구성 요소들이 mRNA 번역에 미치는 영향을 연구한 이전 작업들은 주로 효율적인 번역과 단백질 안정성을 보이는 고도로 설계된 리포터 단백질을 활용해 왔습니다. 각 mRNA의 구조적 요소들이 번역에 서로 다르게 영향을 미치기 때문에, 관심 치료 단백질(POI)에 적합한 최적의 설계를 식별하는 것이 필수적입니다. POI 번역 특성 분석을 가능하게 하기 위해, 분할 루시페라아제 보완 시스템(split luciferase complementation system)이 사용되었습니다. POI의 어느 말단에든 융합될 수 있는 짧은 펩타이드 태그(HiBiT)는 세포 투과성 기질이 존재하는 환경에서 상보적 헤테로다이머(LgBiT)와 결합하여 효소 활성을 재구성합니다. 현재까지 분할 발광 태깅은 주로 고처리량 단백질 턴오버 연구에 사용되어 왔습니다. 우리는 이전에 상보적 헤테로다이머를 구성적으로 발현하는 HEK293 세포 내에서 in cellulo로 mRNA 번역을 시간별로 고처리량 정량화하는 데 분할 발광 태깅을 어떻게 활용할 수 있는지 입증한 바 있습니다. 본 연구에서는 이 분석법의 다재다능함을 추가로 입증하고, 비용 절감을 위해 in vitro 전사를 최적화하는 데 이 분석법을 어떻게 적용할 수 있는지 상세히 설명합니다. 이 분석 시스템은 설계되지 않은 유전자를 사용하여 코딩 서열 최적화의 효과를 강조하는 동시에 구조적 구성 요소의 변화를 독특하게 구별할 수 있습니다. 또한, in vitro 전사를 위한 5’ 캡 농도를 4배 감소시켜도 in cellulo에서 동등한 번역 결과가 나타남을 입증합니다. 이러한 발견은 분할 발광 태깅이 어떻게 mRNA 치료제 워크플로우에 쉽게 통합되어 in cellulo에서 실시간 mRNA 유도 단백질 발현 역학을 모니터링할 수 있게 하는지 보여주며, 결과적으로 mRNA 기반 치료제 발전을 위한 다각적인 방법을 제공합니다.

서론

mRNA 백신의 성공^1,2과 프로그래밍 가능한 바이오분자로서 RNA의 다재다능함에 대한 인식이 높아짐에 따라, 최근 몇 년 동안 메신저 RNA(mRNA) 치료제 및 연구 응용 분야가 빠르게 확장되었습니다. 이 분야의 핵심 과제는 다양한 맥락에서 mRNA 번역 효율을 정량적이고 동적으로 평가하는 능력입니다. 분할 발광 태깅 시스템을 활용하는 본 방법은 세포 내(in cellulo)에서 살아있는 mRNA 번역을 연구하기 위한 유연하고 확장 가능한 플랫폼을 제공합니다³. 이 방법의 전반적인 목표는 서열 특성, 화학적 변형 및 구조적 요소가 번역 역학 및 이후의 단백질 턴오버에 어떻게 영향을 미치는지 연구자가 측정할 수 있도록 하여, 치료 및 기초 과학 응용을 위한 mRNA 구조 최적화의 강력한 도구를 제공하는 것입니다.

In vitro 전사된 mRNA는 5′ 캡, 비번역 지역(UTR), 코딩 서열 및 poly(A) 꼬리를 포함하여 성숙한 전사체의 필수적인 구조를 반영하며, 면역원성을 줄이기 위해 수정된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우가 많습니다^4,5. 광범위한 연구를 통해 이러한 각 요소가 단독으로 또는 조합되어 번역 효율과 단백질 수율에 강력한 영향을 미치도록 설계될 수 있음이 밝혀졌습니다^6,7. 그러나 대부분의 이전 연구들은 Green Fluorescent Protein (GFP)⁷, NanoLuc⁸ 또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질^8,9과 같이 높은 효율로 번역되고 매우 안정적인 단백질을 생성하도록 설계된 고도로 최적화된 리포터 단백질에 의존해 왔으며, 따라서 치료적 맥락에서 직면하는 어려움을 반영하지 못합니다. 치료용 mRNA는 각각 고유한 구조적 제약과 세포 유형 특이적 조절을 받는 다양한 표적 단백질(POI)을 인코딩하므로, 이전에 보고된 바와 같이 특정 구조의 번역을 극대화하는 설계 원칙이 다른 구조에는 일반화되지 않을 수 있습니다³. 따라서 특정 치료용 POI에 대한 최적의 구성을 식별하는 것이 필수적이며, 전사체의 개별 특징이 단백질 생성에 어떻게 기여하는지를 민감하고 체계적으로 평가할 수 있는 방법이 필요합니다.

폴리솜 프로파일링(polysome profiling)과 같은 리보솜 중심의 방법들은 기울기 원심분리를 통해 번역 분획을 구분하며¹⁰, 리보솜 프로파일링(Ribo-seq)은 리보솜 점유도, 개시 부위 및 일시 정지에 대해 뉴클레오타이드 수준의 해상도를 제공합니다¹¹. Ribo-seq와 마찬가지로, 가교 면역침전 후 RNA의 고처리량 시퀀싱(HITS-CLIP) 및 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP)와 같은 다른 시퀀싱 기반 접근법들은 RNA 결합 단백질 관련 RNA 또는 리보솜 관련 RNA의 번역을 추가적으로 특성화합니다¹². 이러한 기술들은 강력하지만, 복잡한 준비 과정, 전문 장비 및 계산 전문 지식이 필요하므로 고처리량 치료용 mRNA 개발에는 적합하지 않습니다. 신생 사슬 면역침전(Nascent chain immunoprecipitation)¹³은 리보솜에서 면역침전된 FLAG-태그 단백질을 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)으로 정량하여 번역 효율을 측정합니다. 이 분석법은 치료용 mRNA에 적용 가능하지만, 노동 집약적이고 시간적 해상도가 부족하며 고처리량 응용 분야에는 적합하지 않습니다. SunTag 시스템¹⁴은 단일 mRNA 분자로부터 단백질 합성 출력 및 번역 조절을 살아있는 세포 내에서 측정할 수 있게 하며, GFP와 융합된 단일 사슬 가변 단편(scFv)과 펩타이드 에피토프의 직렬 반복 서열 간의 상호작용을 통해 작동합니다. 이 시스템은 단일 mRNA 해상도로 번역 및 국소화를 동적으로 측정할 수 있게 하며, 따라서 수많은 신생 사슬 추적 시스템 개발에 활용되어 왔습니다^15,16. 그러나 이 접근법은 처리량이 낮고 고배율 현미경의 사용이 필요합니다.

신생 단백질의 태깅은 불가피하지만, 살아있는 세포 내에서 mRNA 번역을 보고하기 위해 NanoLuc luciferase에서 유래한 작은 펩타이드 태그의 잠재적 활용 가능성이 확인되었습니다. NanoLuciferase는 작은 11-아미노산(HiBiT) 서브유닛과 더 큰 158-아미노산(LgBiT) 서브유닛으로 분할되도록 설계되었으며, 이들은 빠르게 이량체화되어 기질이 있는 상태에서 기능적인 luciferase를 재구성할 수 있습니다^17,18. mRNA 역학 연구에 있어 분할 발광 태깅 시스템은 몇 가지 주요한 장점이 있습니다. 첫째, POI에 융합된 작은 서브유닛의 크기가 최소화되어, 인코딩된 구조체가 관심 단백질의 천연 상태와 최대한 가깝게 유지될 수 있습니다. 코딩 서열의 길이가 번역 비율에 직접적인 영향을 미칠 수 있으므로¹⁹, 태그 길이를 최소화하면 합성 mRNA의 번역 역학에 대한 예측력이 향상됩니다. 결정적으로, 이러한 최소 태깅 전략은 동의 코딩 서열 변이에 의해 유도되는 번역 차이의 검출을 가능하게 하여, 단백질 서열이나 안정성과 무관하게 번역 효율을 독립적으로 조사할 수 있게 합니다³. 이러한 이유로 형광 단백질이나 전장 luciferase와 같은 더 큰 태그를 사용하는 것은 최적이 아닙니다. 둘째, 본 연구에서 채택한 분할 발광 태깅 시스템은 즉각적인 신호 생성을 가능하게 합니다. 이 시스템의 빠르고 효율적인 in cellulo 보완 반응은 높은 친화도(K_D = 700 pM)를 가지는 것으로 보고되었으며, 최소 30 s 간격의 측정값을 통해 단백질 턴오버 조절을 측정하는 데 사용되었습니다¹⁸. 기존의 분할 발광 태깅 시스템은 주로 다른 분할 luciferase 시스템을 기준으로 벤치마킹되었으나^17,18, 이 맥락에서의 핵심 장점은 신호 생성이 단백질 성숙에 의해 제한되지 않는다는 점입니다. 반면, 형광 단백질은 발색단 성숙 과정이 필요하며, 이는 수 분에서 수 시간까지 소요될 수 있어²⁰ 시간적 해상도를 제한합니다. 마지막으로, 여기서 사용된 기성 분할 발광 태깅 시스템은 보완 후 일반적으로 발색단 형성이 필요한 분할 형광 단백질 시스템의 한계를 극복하여²¹, 추가적인 지연을 없애고 빠르고 역동적인 과정을 포착하는 데 더 적합합니다. 이전 연구들은 단백질 턴오버 분석 및 분해 연구에서 분할 발광 태깅의 유용성을 입증한 바 있습니다^22,23,24. 이러한 확립된 기술을 번역 kinetics로 확장하는 것은 상당한 방법론적 진보를 의미합니다. 예를 들어, 리보솜 프로파일링은 전사체 전반의 리보솜 밀도를 밝힐 수 있지만, 서로 다른 조건에서 번역 개시 또는 신장 속도의 역동적인 변화를 쉽게 포착할 수 없습니다. 이전에 설명한 바와 같이³, 이 분할 발광 태깅 시스템은 캡 구조, 5′ 비번역 지역(UTR) 구성, 코돈 최적화, 뉴클레오타이드 변형 및 poly(A) 꼬리 길이의 변경에 따른 차이를 검출할 수 있으며, 이 모든 요소는 번역 효율의 결정적인 결정 요인입니다. 이러한 광범위한 적용 가능성은 개별 mRNA 특성이 전체 단백질 산출량에 기여하는 바를 분석하는 데 있어 이 방법을 독보적으로 강력하게 만듭니다. 사용하는 장비에 따라, 이 기술을 통해 단일 세포 및 웰 전체 데이터 모두를 획득할 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 발광 기반 이미지를 획득할 수 있는 이미징 플랫폼을 활용하면 단일 세포 번역 역학을 연구하는 데 이 기술을 사용할 수 있습니다. 본 논문에서는 중간에서 높은 처리량의 특성과 데이터 분석 요구 사항이 최소화된다는 점 때문에 플레이트 리더 기반의 웰 응용 방식에 집중합니다.

이 방법을 고려하는 연구자들은 구체적인 실험 목적에 비추어 그 적합성을 평가해야 합니다. 이 분석법은 mRNA 기반 치료제 설계 파이프라인과 같이 합성 mRNA 구조체의 고처리량 스크리닝이 필요한 상황에서 특히 가치가 있습니다. 또한 비번역 지역(untranslated regions), 코돈 사용 또는 뉴클레오타이드 수정을 포함한 합성 mRNA 서열 특성의 비교 분석에 적합하며, 이를 통해 번역 효율의 미세한 차이를 검출할 수 있습니다³. 이 시스템은 무세포 번역 플랫폼, 살아있는 세포 분석 및 시점별 용해 분석과 호환되므로, 메커니즘 연구 또는 응용 연구에 맞게 실험 설계를 조정하려는 연구자에게 유연성을 제공합니다. 동시에, 이 기술의 한계를 인식하는 것이 중요합니다. 결정적으로, 분할 발광 태깅 분석은 리보솜 풋프린팅 접근법만이 가진 고유한 기능인 리보솜 점유율의 해상도를 제공하지 않으며, RNA 안정성이나 분해를 직접 측정하지 않으므로 이는 보완적인 방법을 사용하여 평가해야 할 수 있습니다. 하지만 기존의 리보솜 중심 기술의 한계로 인해, 연구자들은 번역 역동성의 대리 지표로서 시간 분해 mRNA 구동 단백질 발현을 조사하기 위해 분할 발광 시스템과 같은 태그 기반 분석법에 의존하고 있습니다. 따라서 이 시스템은 합성 mRNA 구동 단백질 발현을 모니터링하는 강력한 도구이지만, 그 적절성은 연구 질문이 정밀한 리보솜 위치 지정이나 RNA 붕괴보다는 동적인 단백질 산출물에 초점을 맞추고 있는지에 따라 달라집니다.

요약하자면, 분할 발광 태깅 시스템은 mRNA 번역을 연구하기 위한 강력하고 다재다능한 방법을 제시합니다. 이 시스템의 전반적인 목표는 연구자들에게 유연하고 시스템 확장이 가능하며 고속 분석이 가능하고, 다양한 구조적 및 서열 요소가 포함된 합성 mRNA에서 발생하는 단백질 생산량의 차이를 검출할 수 있는 수단을 제공하는 것입니다³. 이 시스템 개발의 근거는 기존 기술의 한계를 극복하여 민감도, 확장성 및 시간적 분해능 측면에서 이점을 제공하는 데 있습니다. RNA 생물학 및 치료제에 관한 광범위한 문헌의 관점에서 볼 때, 이 방법은 실험적 레퍼토리에 가치 있는 추가 요소가 되며, 기초적인 통찰과 중개 연구의 진전을 모두 가능하게 합니다. 연구자들은 이 분석법의 강점과 한계를 신중하게 고려함으로써 특정 응용 분야에 대한 적합성을 판단할 수 있으며, 이를 통해 빠르게 발전하는 RNA 과학 분야에서 그 영향력을 극대화할 수 있습니다.

프로토콜

전체 프로토콜의 도식적 묘사는 그림 1에 제시되어 있습니다.

1. in vitro 전사(IVT)를 위한 템플릿 준비

참고: IVT용 DNA 템플릿을 준비하려면, 플라스미드 DNA에 RNA 폴리머레이스 프로모터(일반적으로 T7 또는 SP6), 5' 및 3' UTR, 그리고 POI의 오픈 리딩 프레임이 포함되어 있는지 확인하십시오(그림 1).

1. 3’ UTR 뒤에 단일 절단 부위가 있는 제한 효소를 사용하여 플라스미드 DNA를 선형화하고, 제조사의 지침에 따라 반응물을 준비한다. 배양 후, 스핀 컬럼 기반의 DNA 정제 키트를 사용하여 제한 효소 소화 반응물을 정제한다. 분광광도계를 사용하여 DNA 양을 정량한다.
2. 선형화를 확인하기 위해 0.1 µg/mL의 DNA 염색제 Ethidium Bromide가 포함된 1% agarose TAE 겔을 준비한다. 소화된 DNA 150 ng을 물 및 로딩 다이와 혼합한다. 시료, 절단되지 않은 플라스미드, DNA 래더를 agarose 겔에 로딩하고, 1× Tris-acetic acid-EDTA (TAE) 버퍼에서 100 V로 40분 동안 agarose 겔 전기영동을 수행한다. 겔 이미저로 시각화한다.
   주의: Ethidium bromide 용액은 강력한 돌연변이 유발 물질이므로 적절한 개인 보호 장구(PPE)를 사용하여 주의 깊게 취급해야 한다.
3. 플라스미드 DNA의 3’ UTR 바로 뒤에 poly(A) 꼬리가 없는 경우, PCR을 통해 이를 도입한다. 적절하게 설계된 프라이머와 high-fidelity polymerase를 사용하여 제조사의 지침에 따라 PCR을 완료한다. 증폭 산물에 T7 프로모터, open reading frame 및 poly(A) 꼬리가 포함되었는지 확인한다.
   참고: 캡핑 기술은 T7 프로모터에 특정 서열 요구 사항이 있을 수 있으며, 이러한 요구 사항은 적절한 정방향 프라이머 설계로 충족할 수 있다. 역방향 프라이머는 3’ UTR의 끝부분에 결합하여 poly(A) 꼬리를 도입한다 (최소 80 T의 길이 권장). GC 함량이 높은 구성물의 경우, step-up PCR 및/또는 3% DMSO 사용을 권장한다.
4. PCR 성공 여부를 확인하기 위해 Ethidium Bromide가 포함된 agarose TAE 겔을 준비한다 (단계 1.2 참조). 구성물의 길이가 ≥1 kb인 경우 1% 겔을, <1 kb인 경우 2% 겔을 각각 준비한다. PCR 반응물 5 µL를 물 및 로딩 다이와 혼합한다. 시료와 DNA 래더를 모두 agarose 겔에 로딩하고, TAE 버퍼에서 100 V로 40분 동안 전기영동을 수행한다. 겔 이미저로 시각화한다.
5. PCR 크기 확인 후, 스핀 컬럼 기반의 DNA 정제 키트를 사용하여 PCR 반응물을 정제한다. IVT에 사용할 DNA 템플릿을 농축하기 위해 15–20 µL의 용출 버퍼(보통 DNA 정제 키트에 제공됨) 또는 nuclease-free water로 용출한다. 분광광도계를 사용하여 DNA 양을 정량한다.

2. In vitro 전사

1. 시작하기 전, RNase 제거 용액으로 벤치, 장갑 및 피펫을 분무하고 닦아냅니다. 수율과 품질을 높이려면 이 과정을 멸균 후드 환경에서 수행하십시오.
2. 제조사의 지침에 따라 T7 기반 인비트로 전사(IVT) 키트의 구성 성분을 해동하고 준비합니다.
   참고: 일부 제조사는 반응 산화를 제한하고 효율을 높이기 위해 디티오트레이톨(DTT, 0.1 M)의 사용을 권장합니다. 키트와 호환되는 경우 이 단계를 수행하는 것이 좋습니다. 변형 dNTP를 사용하는 경우, 대응하는 비변형 뉴클레오타이드를 동일한 양의 변형 뉴클레오타이드로 대체하십시오. 전체 반응에서는 수율의 실질적인 향상이 관찰되지 않았으므로, 절반 반응으로 수율을 평가하십시오. 하나 이상의 mRNA를 합성할 때는 피펫팅 오류와 변동성을 줄이기 위해 마스터 믹스를 만드는 것이 권장됩니다.
3. 피펫으로 철저하고 짧게 혼합한 후, 응결을 방지하기 위해 가열 덮개를 사용하여 37 °C에서 5시간 동안 배양합니다. 필요 시 배양 시간을 하룻밤까지 연장할 수 있으며, 이는 mRNA 수율이나 무결성에 미치는 영향이 미미합니다.
4. DNase I 1 µL를 첨가하고 피펫으로 철저히 혼합합니다. 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
5. in vitro 전사(IVT) RNA 정제
   1. 제조사의 지침에 따라 컬럼 기반 RNA Cleanup 키트를 사용하여 IVT 반응물을 정제합니다(키트에 따라 회수율과 결합 용량이 다를 수 있습니다). 용출 시, nuclease-free water 60 µL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양한 후 원심분리합니다.
   2. 또는 더 저렴하고 유연한 방법인 염화리튬 침전법을 사용합니다.
      1. 반응물에 동일한 부피의 7.5 M 염화리튬을 첨가하고 혼합한 후, -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      2. 4 °C에서 18,300 × g로 20분 동안 원심분리한 후, RNA 펠릿이 손상되지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
      3. 70% 에탄올 950 µL로 세척하고 4 °C에서 18,300 × g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 실온에서 약 5분 동안 건조시킨 후, nuclease-free water에 재부유합니다(표준은 60 µL이며, 농도를 높이려면 펠릿 크기에 따라 부피를 줄이십시오).
         주의: 적절한 개인보호구(PPE)를 사용하지 않을 경우 염화리튬이 피부나 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 취급 시 장갑과 보안경을 착용하십시오. 또한, 에탄올은 인화성이 매우 높은 액체이며 눈 자극을 유발할 수 있습니다. 화기 근처에 두지 말고 보안경을 포함한 적절한 PPE를 착용하십시오.
6. 분광광도계를 사용하여 mRNA의 양을 정량합니다. mRNA의 A260/A280 비율이 ~2.0인지 확인하고, A260/A230 비율이 1.8에서 2.2 사이인지 확인합니다.
7. IVT 성공 여부를 확인하기 위해 Ethidium Bromide가 포함된 1% agarose TAE(비변성) 겔을 준비합니다. 500 ng의 mRNA를 물 및 로딩 다이와 혼합하고, RNA 래더 준비 및 변성 지침에 대해 제조사의 지침을 따릅니다. agarose 겔에 로딩하고 TAE 버퍼에서 80 V로 40분 동안 전기영동합니다. 겔 이미저로 시각화합니다.
8. mRNA 크기의 정확성을 추가로 확인하려면 샘플을 Bioanalyser로 분석합니다.
9. 동결-해동 반복을 피하기 위해 실험에 필요한 부피로 mRNA를 분주합니다. 예를 들어, 96-well 플레이트의 웰당 1.2 pmol의 mRNA를 사용하는 경우, 1.2 pmol × 반복 횟수에 해당하는 적절한 부피를 분주한 후 -80 °C에 보관합니다.

3. HEK293 역형질전환

참고: 시간적 측정을 수행하려면 상보적인 루시페라아제 조각을 상시 발현하는 세포주가 필요합니다. 이는 필요한 루시페라아제 조각을 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션하고 이후 클론 선택을 통해 안정적인 세포주를 구축함으로써 가능합니다. 이를 통해 사용자는 원하는 모든 세포 배경에서 시간별로 분해된 mRNA 번역 역학을 측정할 수 있습니다. 또는, 필요한 루시페라아제 조각을 발현하는 세포주를 구매하여 사용할 수도 있습니다. 본 실험은 상보적인 헤테로다이머를 상시 발현하는 HEK293 세포를 사용하여 수행되었습니다.

1. 시작 전, 분해를 방지하기 위해 mRNA를 얼음 위에서 해동합니다.
2. 형질전환 복합체를 준비합니다. 96-well 플레이트의 경우, well당 1.2 pmol의 mRNA가 필요합니다. duplicate로 실험하는 경우, 피펫팅 오차를 고려하여 2.5배 분량을 준비합니다. 따라서 3 pmol의 mRNA를 Opti-MEM Reduced Serum Medium과 혼합하여 최종 부피를 50 µL (well당 20 µL)로 맞춥니다.
3. 양이온 지질 기반 형질전환 시약 0.5 µL (well당 0.2 µL)를 첨가하고, 피펫팅으로 섞은 후 실온에서 배양합니다. 5분간 배양 후, 다시 피펫팅으로 섞고 96-well white flat-bottom microplate의 well당 20 µL씩 첨가합니다. 이때 형질전환 well은 플레이트 중앙에 배치하고 가장자리 well은 비워두는 것을 권장합니다.
4. 배지를 제거하고 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 2 mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 HEK293 세포를 준비합니다. 세척액을 제거하고 500 µL의 Trypsin-EDTA를 첨가한 후, 37 °C에서 3분간 배양합니다.
5. 세포 해리 과정 동안, 세포 배양 중 배지 증발을 줄이기 위해 96-well 플레이트의 가장자리 well을 PBS로 채웁니다. 모든 well이 필요한 경우에는 well 사이 공간을 PBS로 가득 채울 수 있습니다.
6. 1× L-glutamine과 10% fetal bovine serum (FBS)가 보충된 4.5 mL의 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 첨가하여 세포를 수집합니다. 혈구계수기(hemocytometer) 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다.
7. 필요한 양의 세포(well당 1 x 10⁵ cells가 분주될 수 있는 양)에 3개 well 분량(피펫팅 오차 대비)을 추가하여 새 튜브로 옮긴 후, 500 × g에서 2분간 원심분리합니다.
8. 상층액을 제거하고 10% FBS와 Endurazine Live Cell Substrate (1:200)가 보충된 필요한 부피의 Leibovitz’s L-15 medium (phenol free)에 세포를 재현탁하여 최종 농도가 1 × 10⁶ cells/mL가 되도록 합니다. Endurazine이 충분히 섞이도록 세롤로지컬 피펫으로 혼합합니다. 재현탁된 세포 100 µL (1 × 10⁵ cells)를 well당 분주합니다.
   참고: 72시간 동안 진행되는 시계열 실험을 수행하는 경우, 증발을 방지하기 위해 부피를 200 µL로 늘립니다.
9. 형질전환 직후, 37 °C로 설정된 플레이트 리더(luminometer)에 세포를 넣습니다. 적분 시간 1 s로 일정 간격마다 기록합니다. 시스템의 효율적인 상보성 덕분에 수분 내에 신호를 검출할 수 있습니다. 따라서 정확한 기저선(baseline) 값을 얻으려면 이 단계를 신속하게 수행해야 합니다. 측정 간격은 실험 및 기기에 따라 다르지만, 본 실험에서는 18시간 시계열 실험의 경우 12분마다, 72시간 실험의 경우 48분마다 측정하는 것이 최적인 것으로 나타났습니다. 발광 측정에는 필터가 필요하지 않으나, 530–540 nm 필터를 사용할 때 더 나은 신호 대 잡음비가 관찰되었습니다.
   참고: split-luciferase-tagged eGFP에서 Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) 신호가 생성되므로, 530–540 nm 필터는 발광 및 형광 신호를 모두 캡처합니다. BRET 캡처를 피하려면 460–480 nm 필터를 사용하거나, 대안으로 MYL3와 같은 비형광 단백질을 대조군으로 사용하십시오.

4. 데이터 분석

1. 어세이 시작 시점의 신호가 배경 수준이므로, 각 조건의 신호를 첫 번째 시점(t0, 기술적 반복 시료의 평균으로 정규화)으로 정규화하여 상대 발광 단위(RLUs)의 배수 변화(fold changes)를 생성합니다.
2. 대조군 조건으로 정규화하여 생물학적 반복 시료 간의 변동성을 줄입니다.
3. 연구 질문에 따라 단일 시점 또는 곡선 아래 면적(AUC) 중 적절한 통계 분석 방법을 선택합니다.
   1. 단일 시점의 경우, 정점 발현이 일어나는 시점(POI에 따라 다름)과 종료 시점을 사용합니다. 특정 시점(예: 240 min)에서 단계 4.1에서 계산된 RLU를 도식화하고 적절한 통계 테스트를 사용하여 분석합니다.
   2. 특정 시간 범위(즉, t0에서 240 min까지) 또는 전체 어세이 기간(즉, t0에서 종료 시점까지)에 대한 AUC를 계산하여 단백질 번역 및 분해의 역동성을 측정합니다. 각 생물학적 반복 시료의 AUC 값을 기준 mRNA의 평균으로 정규화하여, 적절한 통계 테스트로 분석 가능한 AUC 배수 변화 측정값을 산출합니다.

결과

본 프로토콜의 비용 효율성을 최적화할 수 있는 몇 가지 방법이 있습니다. 예를 들어, IVT 반응을 제조사 권장 부피의 절반으로 소형화하였으며, 그 결과 얻은 수율이 in cellulo 실험에 필요한 양을 충족한다는 것을 확인했습니다. 서열의 길이와 복잡성이 IVT 수율에 영향을 미치므로, 성공적인 프로토콜 최적화를 통해 IVT 반응당 최소 50 µg의 mRNA를 얻어야 한다는 점에 유의해야 합니다. IVT 반응 키트와 마찬가지로, capping 시약 또한 비용이 많이 드는 경우가 많습니다. mRNA 분자당 하나의 cap만 필요하다는 점을 고려하여, 우리는 IVT 반응 시 생성되는 mRNA 분자 수에 비해 과량의 cap 분자가 포함되어 있을 것이라고 가설을 세웠습니다. 따라서 IVT 반응에 첨가하는 capping 시약의 양을 적정하여 프로토콜을 추가로 최적화할 수 있는지 조사하였으며, 그 결과는 그림 2에 나타나 있습니다. 100% (최종 10 mM cap), 50%, 25% 또는 0% (uncapped)의 capping 시약을 10 µL IVT 반응에 첨가하였고, 생성된 eGFP mRNA를 상보적 heterodimer를 지속적으로 발현하는 HEK293 세포에 형질전환 시켰습니다. 정규화 대조군으로 MYL3 (100% capped) 또한 형질전환 시켰는데, 근육 풍부 구조 단백질을 인코딩하는 이 내인성 유전자는 eGFP와 유사한 번역 역학을 보이지만 신호는 다른 내인성 유전자와 더 유사하기 때문입니다³. 이전 데이터³와 일치하게, uncapped eGFP mRNA는 mock 대조군과 유사하게 번역이 일어나지 않았습니다 (그림 2A). 권장 capping 시약의 25% 또는 50%로 합성된 eGFP mRNA는 100%일 때와 유사한 발현 수준을 보였으며 (그림 2A), 18 h 시간 경과에 따른 곡선 아래 면적 (AUC) 값에서 차이가 없었습니다 (그림 2B). 이러한 결과는 이 조건에서 capping 시약이 과량으로 존재하며, 농도를 줄여도 충분한 cap 결합이 이루어져 번역 출력에 영향을 주지 않음을 나타냅니다. 그림 2에 제시된 결과는 사용된 capping 시약의 브랜드에 특이적이므로, 다른 시약을 사용할 때는 최적화 과정이 필요합니다.

캡(cap) 기술의 발전과 변형 뉴클레오타이드의 도입으로 mRNA 발현이 향상되었으나, mRNA 설계 알고리즘의 개발은 발현을 더욱 개선하였습니다. 이러한 알고리즘은 각각 최소 자유 에너지(MFE)와 코돈 적응 지수(CAI)를 개선함으로써 mRNA 안정성과 코돈 사용을 최적화하는 데 중점을 둡니다. 최적화가 mRNA 발현에 미치는 영향을 테스트하기 위해 LinearDesign⁹을 활용하였습니다. 이 알고리즘은 람다(lambda) 값의 입력에 의존하는데, 이는 최적화 공식에서 알고리즘이 MFE 또는 CAI를 얼마나 강력하게 선호하는지를 결정하는 스케일링 파라미터입니다. 동일한 최적화 설정(즉, 동일한 람다 값)을 네 가지 전사 인자인 HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5에 적용하였습니다. 그림 3에서는 최적화가 번역 속도에 미치는 영향을 탐구합니다. 최적화는 모든 전사 인자에 대해 MFE와 CAI 값 모두를 개선하였으며, 특히 MEF2C에서 두 파라미터 모두 가장 큰 변화를 보였습니다(그림 3A). 각 컨스트럭트의 C-말단에 GS 링커에 이어 분할 발광 태그(split luminescent tag)를 융합하였고, 최적화되지 않은 형태와 최적화된 형태 모두에 대해 네 가지 전사 인자의 mRNA를 합성하였습니다. 각 mRNA가 번역되어 예상 분자량의 단백질을 생성할 수 있는지 확인하기 위해 토끼 망상적혈구 용해물 무세포 번역 시스템(rabbit reticulocyte lysate cell-free translation system)³을 이용하였습니다. 생성된 단백질은 분할 루시페레이스 단백질의 효소 서브유닛과 적절한 기질을 사용하여 분할 발광 태그를 검출하는 웨스턴 블롯으로 분석하였습니다. 웨스턴 블롯팅 결과, 최적화 후에도 예상 분자량과 일치하는 단백질이 생성됨을 확인하였습니다(그림 3B). HEK293 세포에 각 전사 인자의 최적화되지 않은 형태 또는 최적화된 형태를 형질전환하고, 18시간 동안 생세포 기록을 수행하였습니다. 모든 18시간 실험에서 세 개의 생물학적 반복구로부터 측정값을 얻었으며, 각 반복 실험에서 샘플당 세 개의 기술적 반복구를 사용하였습니다. HAND2(그림 3C)와 GATA4(그림 3D)의 최적화는 (비쌍체 두 샘플 t-검정으로 결정했을 때) 발현에 영향을 미치지 않았으며, 최적화되지 않은 대조군과 비교하여 각각 1.07배 증가 및 1.25배 감소하였습니다. 반면, MEF2C(그림 3E)와 TBX5(그림 3F)의 최적화는 발현의 통계적으로 유의미한 증가를 유도하였으며, 각각의 최적화되지 않은 버전에 비해 AUC가 2.25배(P = 0.0486, n = 3, 비쌍체 두 샘플 t-검정) 및 1.72배(P = 0.0379, n = 3, 비쌍체 두 샘플 t-검정) 상승하였습니다. 이와 일치하게, 최종점 발현뿐만 아니라 발현 곡선의 형태와 속도에서도 차이가 관찰되었으며, 이는 본 분석법이 시간에 따른 번역 역학의 변화를 분해하여 보여줄 수 있음을 나타냅니다. 이러한 발현 증가가 더 오랜 기간 유지되는지 확인하기 위해, HEK293 세포에 MEF2C mRNA를 형질전환하고 72시간 동안 기록하였습니다(그림 3G). 18시간 실험과 마찬가지로, 세 개의 생물학적 반복구에서 측정값을 얻었으며, 각 반복 실험에서 샘플당 세 개의 기술적 반복구를 사용하였습니다. 18시간 후의 관찰 결과와 유사하게, 최적화된 MEF2C는 최적화되지 않은 버전에 비해 AUC가 2.5배(P = 0.0061, n = 3, 비쌍체 두 샘플 t-검정) 개선되어 발현을 유의미하게 증가시켰습니다. 최적화를 통해 발현이 상당히 증가하였음에도 불구하고, 이러한 결과는 이 사례에서 최적화가 72시간 동안의 분해를 막지는 못함을 보여주며, 두 MEF2C 형태 모두 24시간 이후부터 유사한 기울기를 보였습니다. 이러한 분해는 선형 mRNA 분해 및/또는 세포 분할로 인한 것으로 보입니다. 종합적으로, 이러한 결과는 mRNA 발현을 개선하기 위한 mRNA 설계 알고리즘의 잠재력을 입증하지만, 최적화가 POI(관심 단백질) 의존적인 방식으로 수행되어야 함을 강조합니다.

그림 1: HEK293 세포에서의 mRNA 합성 및 분할 발광 태그 분석 워크플로우. 분할 발광 태그 분석을 위한 IVT를 수행하려면, 플라스미드에 RNA 중합효소 프로모터(T7 또는 SP6), 5’ 및 3’ UTR, 그리고 짧은 루시퍼레이스 서브유닛 HB(HiBiT)가 융합된 표적 단백질의 코딩 서열이 포함되어 있는지 확인하십시오. 플라스미드는 단일 부위 절단 제한 효소로 선형화되어 Poly T PCR의 템플릿을 제공하며, 이는 이후 IVT의 템플릿으로 사용됩니다. mRNA가 합성되면 리포좀과 복합체를 형성하고, 더 큰 루시퍼레이스 서브유닛(LB)을 상시 발현하는 HEK293 세포로 역전달(reverse-transfection)됩니다. 이후 즉시 플레이트 리더에 넣어 라이브 기록을 측정할 수 있습니다. 실험 완료 후, 정규화 및 후속 통계 분석을 위한 데이터 분석이 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 캡핑 시약 농도를 4배 낮추어도 전체 농도를 사용했을 때와 유사한 eGFP 발현이 나타난다. (A) 다양한 농도의 캡핑 시약, MYL3 또는 Mock이 포함된 eGFP mRNA를 transfection한 HEK293 세포에서의 생세포 키네틱 분석 결과이며, 데이터는 t₀ 기준으로 정규화되었다; 점은 각 시점당 최소 3회 이상의 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. (B) 최소 3회 이상의 생물학적 반복 실험에 대해 18시간 동안 측정된 곡선의 AUC 배수 변화를 기준 샘플인 MYL3로 정규화하여 얻었으며, Tukey의 다중 비교 검정을 포함한 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 비교하였다. 데이터는 평균 ± 평균 표준 오차(SEM)로 표시되었으며, 각 점은 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. ***P < 0.001. (eGFP – enhanced green fluorescent protein; AUC – 곡선 아래 면적; RLU-상대 발광 단위) 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 3: 서열 최적화는 POI 의존적 방식으로 mRNA 번역을 개선한다. (A) 각 전사 인자에 대해 LinearDesign mRNA 서열 최적화를 수행한 결과, 최소 자유 에너지(MFE)는 감소하고 코돈 적응 지수(CAI) 값은 증가하였다. (B) 최적화되지 않은 HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 또는 RNA가 없는 조건의 mRNA를 사용하여 120분 동안 RRL 반응을 수행하였다. 생성된 단백질은 웨스턴 블롯팅으로 처리되었으며, 분할 루시페라제 시스템의 효소 서브유닛 및 적절한 기질을 사용하여 막을 배양함으로써 화학 발광으로 검출하였다. 최적화되지 않거나 최적화된 HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E) 또는 TBX5 (F)를 MYL3 및 Mock과 함께 transfection한 HEK293 세포에서의 살아있는 세포 키네틱 분석. 데이터는 t₀로 정규화하였으며, 점은 각 시점당 세 번의 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. 세 번의 생물학적 반복 실험에 대한 18시간 시간 경과 곡선의 AUC 배수 변화는 참조 샘플인 MYL3로 정규화하여 얻었으며, Welch 교정이 적용된 unpaired t-test로 비교하였다. 데이터는 mean ± SEM으로 표시되었으며, 각 점은 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. *P < 0.05. (G) 최적화되지 않거나 최적화된 MEF2C, MYL3 및 Mock을 transfection한 HEK293 세포에서의 살아있는 세포 키네틱 분석 데이터는 t₀로 정규화하였으며, 점은 각 시점당 세 번의 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. 세 번의 생물학적 반복 실험에 대한 72시간 시간 경과 곡선의 AUC 배수 변화는 참조 샘플인 MYL3로 정규화하여 얻었으며, Welch 교정이 적용된 unpaired t-test로 비교하였다. 데이터는 mean ± SEM 으로 표시되었으며, 각 점은 생물학적 반복 실험의 평균을 나타낸다. **P < 0.01. (MFE – 최소 자유 에너지; CAI – 코돈 적응 지수; RRL – 토끼 망상적혈구 용해물; AUC – 곡선 아래 면적, RLU – 상대 발광 단위) 여기를 클릭하여 이 그림의 확대 버전을 확인하십시오.

토론

최근 몇 년 동안 mRNA 치료제 분야가 급격히 확장되면서, 개발 파이프라인의 핵심 단계로서 서열 설계 및 최적화의 중요성이 강조되고 있습니다. 특히 서열 최적화에 많은 관심이 쏠리면서, 가장 효과적인 RNA 구조와 조성을 예측하기 위한 컴퓨터 기반 도구를 구축하는 데 상당한 노력이 집중되었습니다^8,9. 이러한 도구들이 강력한 성능을 발휘하지만, 설계된 서열에 대한 실험적 검증은 여전히 파이프라인의 필수적인 부분입니다. 그러나 이러한 검증은 주로 GFP⁷, NanoLuc⁸, SARS-CoV-2 스파이크 단백질⁹ 과 같이 이미 매우 안정적이고 번역 효율이 높은 리포터 단백질에 크게 의존해 왔습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, HEK293 세포에서 in vitro 전사된 mRNA의 번역 역학을 연구하고 시간적 해상도를 확보할 수 있도록 스플릿 루시페라제 시스템을 파이프라인에 통합하였으며³, 이를 통해 mRNA 엔지니어링에 따른 번역 변화를 감지하는 데 있어 리포터 단백질 사용이 갖는 한계를 입증하였습니다. 본 방법론 논문에서는 이 분석을 수행하는 데 필요한 단계들을 설명하고, IVT 반응의 소형화가 가능하며 5’ 캡 농도를 낮추어도 번역에 영향을 주지 않아 비용을 절감할 수 있음을 보여줍니다. 이전의 관찰 결과를 바탕으로, 우리는 발현량을 증가시키기 위해서는 POI 의존적인 mRNA 서열 최적화 접근 방식이 필요함을 강조합니다.

여기에서 설명한 바와 같이, 분할 발광 태그 분석법은 mRNA 번역을 중간 처리량(medium-throughput)으로 측정할 수 있게 하는 비교적 간단한 파이프라인으로, 사용자가 관심 단백질(POI)의 시간적 발현을 실시간으로 조사할 수 있도록 합니다. 하지만 견고한 결과를 얻기 위해서는 여러 가지 중요한 단계와 고려 사항이 필요합니다. 첫째, 모든 다운스트림 결과는 mRNA의 품질에 따라 달라지며, 이는 IVT와 이에 사용되는 장비의 오염 제거부터 시작됩니다. 합성 후 mRNA 보관이 핵심인데, 용출 후에는 얼음 위에 보관하고, mRNA 크기를 확인한 후에는 동결-융해를 방지하기 위해 mRNA를 작업 부피별로 분주하여 -80°C에 보관해야 합니다. 둘째, 사용하는 96-well 플레이트가 매우 중요하며 실험 간에 일관성을 유지해야 합니다. 본 프로토콜에서는 전체가 흰색인 96-well 플레이트를 사용하십시오. 세포 형태 관찰이 필요한 경우 바닥이 투명하고 벽면이 흰색인 플레이트를 사용할 수 있으나, 이 경우 신호가 훨씬 낮게 나타나므로 두 종류의 플레이트를 혼용해서는 안 됩니다. 동일한 mRNA의 번역을 바닥이 투명하고 벽면이 흰색인 플레이트에서 측정했을 때, 결과 발광 신호가 전체 흰색 벽면 플레이트와 병행 측정했을 때보다 5배 더 낮게 관찰되었습니다. 이러한 기술적 사항은 번역 역학이 비효율적인 유전자를 평가할 때 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 데이터에 불일치를 초래하는 것 외에도, 신호의 감소는 mRNA 서열이나 구조적 섭동으로 인해 유도된 미세한 차이의 검출을 방해할 수 있습니다. 셋째, L-15 배지의 사용이 이 분석의 핵심인데, 이는 CO₂ 보충이 없는 환경에서도 세포 생존력을 유지하게 하여²⁵ 사용하는 루미노미터(luminometer)의 선택에 유연성을 제공합니다. 또한, 페놀이 없는 L-15를 사용하면 발광 측정 시 배경 신호를 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 37°C(또는 관심 세포 유형의 배양 조건)에서 배양하고 발광을 측정하십시오. 이 실험을 상온에서 수행하면 번역 신장 속도가 감소하여²⁶ 정상적인 역학이 관찰되지 않으므로 결과가 크게 달라질 것입니다.

in vitro 전사된 mRNA 설계의 다재다능함은 수많은 수정을 가능하게 하는 합성 과정으로 전이될 수 있습니다. 관찰된 바와 같이, 5’ 캡의 농도를 4배까지 줄여도 여전히 유사한 발현을 달성할 수 있어 연구자들이 비용을 절감할 수 있습니다. IVT 후 캡핑 효율을 직접 측정하지는 않았으나, IVT 풀 내에서 캡이 씌워지지 않은 mRNA의 비율이 증가하면 캡 없는 mRNA에서 입증된 것처럼 신호가 감소하게 되는데, 본 실험에서는 이러한 현상이 관찰되지 않았습니다. 또한, eGFP가 27 kDa에 불과한 비교적 작은 단백질임을 고려할 때, 이러한 캡 농도 조절은 IVT 후 캡핑해야 할 전사체의 수가 더 적을 것이므로 더 큰 유전자에도 쉽게 적용될 수 있을 것입니다. 메틸화 수정이 서로 다른 여러 캡 유사체가 존재하며, 이는 면역원성³과 단백질 발현²⁷에 영향을 미칩니다. 또한, 캡핑 과정은 공-전사 방식(여기서 입증된 방식) 또는 Vaccinia 바이러스를 이용한 전사 후 방식으로 수행될 수 있으며, 후자의 경우 캡핑 효율은 100%²⁸에 달하지만 추가적인 정제 단계가 필요합니다. 실험실 규모의 mRNA 생산에는 정제 컬럼이 빠르고 효율적이기 때문에 흔히 사용되지만 비용이 많이 듭니다. 더 저렴하고 다재다능한 접근 방식은 염화 리튬 침전법으로, 시간이 더 많이 소요되지만 사용자가 mRNA를 농축할 수 있고 수율이 컬럼 결합 용량에 제한되지 않으므로 스케일업에 적합합니다. 정제 컬럼과 마찬가지로, 이 방법은 면역원성을 유발하는²⁹ 이중 가닥 RNA와 절단된 RNA 단편을 완전히 제거하지 못합니다. 5’ 캡과 마찬가지로, poly(A) 꼬리의 도입은 여기서 설명한 것 외에 다른 방법으로도 가능합니다. PCR을 통한 꼬리 도입과 유사하게, 플라스미드 DNA가 poly(A) 꼬리를 포함하도록 설계될 수 있습니다. 하지만 이러한 긴 구간은 재조합을 일으켜 불균일하고 짧아진 poly(A) 서열을 초래할 수 있습니다. 그러나 poly(A) 분절화, 즉 이종 뉴클레오티드 스페이서의 삽입을 통해 이러한 효과를 최소화할 수 있습니다^30,31. 대안적으로, 템플릿 독립적 poly(A) 중합효소를 사용하여 poly(A) 꼬리를 생성할 수 있으며, 이는 더 긴 poly(A) 꼬리 생성 가능하게 하지만³² 불균일성으로 인해 규제 요건에 영향을 미칠 위험이 있습니다³³.

설명된 분할 발광 태그 분석법은 외인성으로 전달된 mRNA의 단백질 발현을 측정하는 데 매우 효과적이지만, 연구 질문에 따라 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 분할 루시퍼레이즈의 절반을 상시 발현하는 세포주를 제작해야 할 필요가 있습니다. 기성 제품으로 구매할 수 있기는 하지만, 현재는 HEK293 세포로만 제한되어 있습니다. 관심 있는 세포 유형에서 안정적인 세포주를 구축하는 것이 어려운 경우, HEK293, 인간 배아줄기세포 및 분화된 심근세포 사이에서 동일한 결과가 나타남을 확인한 용해 분석법(lytic assay)이 존재합니다³. 다만, 이전에 발표된 연구³에서 용해 분석법을 위해 선택한 시점은 생세포 HEK293 데이터에 의해 결정되었습니다. 둘째, 이 분석법은 생세포 시간 분해능을 제공하지만, 일부 연구자들에게 중요할 수 있는 생세포 공간 분해능은 제공하지 못합니다. 그러나 본 실험에 사용된 짧은 루시퍼레이즈 펩타이드 태그에 대해 형광 면역세포화학 염색에 잘 작동하는 1차 항체가 있어, 번역된 POI의 공간적 조사가 가능합니다. 또한, 발광 이미징이 가능한 현미경을 사용하면 단일 세포 분해능 데이터를 얻을 수 있습니다. 시공간적 정보를 제공하는 접근 방식으로는 SunTag가 있으며, 이는 펩타이드 에피토프에 결합하는 GFP 태그 scFv 간의 상호작용을 통한 생세포 이미징을 사용하여 활성 번역 및 국소화를 측정합니다^14,34. 하지만 이러한 에피토프의 24회 탠덤 반복이 필요하여 잠재적으로 번역을 왜곡시킬 수 있으며, 워크플로우의 처리량이 상대적으로 낮습니다. 셋째, 분할 발광 태그를 통해 mRNA 양을 측정할 수 있지만, 생세포 내에서는 불가능합니다. 이전 연구³에서는 외인성으로 전달된 전사체에 특이적인 프라이머를 사용하여 추출된 RNA에 대해 qRT-PCR을 수행하였으며, 이를 통해 컨스트럭트 간의 transfection 효율에 따른 mRNA 수준과 시점 간의 분해를 확인했습니다. 또 다른 접근 방식으로 mRNA 안정성을 측정하기 위해 Northern blotting을 사용한 사례가 있습니다³⁵. 그러나 두 방법 모두 노동 집약적이며 연속적인 측정을 제공할 수 없습니다. 현재 생세포 내에서 mRNA 번역과 양을 동시에 측정할 수 있는 방법은 존재하지 않으며, 이는 이 분야의 분석법 개발을 진전시킬 수 있는 잠재적인 경로가 될 것입니다.

분할 루시퍼레이즈 시스템은 초기에 단백질 역학을 연구하는 데 적용되었으나, 본 연구를 통해 이 분석법이 다른 연구 분야에서도 중요한 시사점을 가진다는 것이 분명해졌습니다. mRNA 치료제가 새로운 유전자 치료 접근법의 최전선에 있는 상황에서, 이 분석법은 연구자가 잠재적 치료제의 발현 특성을 규명하고 발현 증강을 위해 이를 최적화하는 데 매우 적합합니다. 앞서 언급한 바와 같이, 여러 도구들의 개발과 함께 코돈 최적화는 mRNA 설계의 강력한 새로운 도구가 되었습니다^8,9,36. 네 가지 전사 인자에 균일한 서열 최적화 접근법을 적용했을 때, 모든 유전자의 MFE와 CAI가 모두 개선되었음에도 불구하고 MEF2C와 TBX5만이 발현 증가를 나타냈습니다. 특히, 동의 코딩 서열 변이만으로 발생하는 발현 차이의 검출을 가능하게 함으로써, 이 접근법은 살아있는 세포 내에서 높은 시간 분해능으로 번역 효율을 조사할 수 있는 독특한 플랫폼을 제공합니다. 이러한 결과는 발현 증강을 달성하기 위해 서열 최적화 시 POI에 따라 초기 GC 함량, 코돈 사용 및 RNA 2차 구조를 반드시 고려해야 함을 보여줍니다. 더 많은 컨스트럭트를 테스트해야 할 수도 있지만, 분할 발광 태그 분석법은 POI에 대한 최적의 후보군을 식별하기 위한 고속 대량 분석(high-throughput analysis) 가능성을 가지고 있습니다. 또한, 이전 연구에서 보여준 바와 같이³, 이 분석법은 mRNA의 모든 서열 또는 구조적 구성 요소의 섭동 효과를 측정할 수 있어 그 응용 범위를 더욱 확장합니다. mRNA 변형 조사 외에도, 분할 발광 태그 분석법은 전달 및 제형 연구에 활용될 수 있습니다. 5' 캡의 개선과 변형 뉴클레오타이드의 사용에도 불구하고, 외인성으로 전달되는 mRNA는 분해를 방지하고 세포 섭취를 돕기 위한 패키징 시스템이 필요합니다³⁷. 지질 나노입자³⁸, 세포 외 소포체³⁹, 생체 모방체⁴⁰가 mRNA 전달의 최전선에 있지만, 여전히 추가적인 개발이 필요합니다. 이러한 운반체 중 어느 하나에 분할 발광 태그가 부착된 mRNA를 캡슐화하면 전달 효율의 특성 규명이 가능하며, 연구자가 수정된 운반체들을 중고속 대량 분석 방식으로 테스트할 수 있게 됩니다. 번역 중심의 연구 외에도, 분할 발광 태그 분석법은 기초 생물학 연구에 쉽게 활용될 수 있습니다. mRNA 번역에 대한 서열 및 구조적 요소 섭동의 영향을 평가하거나, 번역 장치의 기능 방해, 또는 프로테아좀 조사 등에서 분할 발광 태깅 시스템은 매력적인 대안을 제공합니다.

전반적으로, 여기서 설명한 분할 발광 태그 시스템은 번역 역학의 판독값으로서 합성 mRNA에 의한 단백질 발현을 시간적으로 모니터링할 수 있는 유연하고 강력한 분석법을 제공합니다. 살아있는 세포 분석법을 구현함으로써 mRNA 번역 분야의 기존 제약 사항들을 많이 극복할 수 있었으며, 단백질 합성 및 POI 분해의 역학에 관한 중요한 정보를 밝혀낼 수 있었습니다. 전사체마다 서로 다른 조절 및 발현 프로필을 가지고 있으므로, 치료용 POI의 특성을 규명하는 것이 필수적이며, 이를 통해 mRNA 치료제가 지속적으로 발전하여 임상에 적용될 수 있을 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283	TAE 버퍼 성분
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	겔 전기영동용
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939B	mRNA 품질 관리에 사용되는 Bioanalyser
CLARIOstar Plus Luminometer	BMG Labtech	430-501S-F	발광 측정을 위해 사용되는 플레이트 리더/루미노미터
CleanCap AG	Trilink Biotechnologies	N-7113	IVT에 사용되는 5' 캡
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	41966029	HEK293-LgBiT 세포 배양에 사용되는 배지
DNase I	New England Biolabs	M0303	IVT 반응 후 DNA 템플릿 분해용
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	세포 세척 및 증발 방지를 위한 플레이트 첨가용
EDTA, pH 8.0, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9260	TAE 버퍼 성분
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E1510	겔 전기영동용 염색제
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524	DMEM에 첨가되는 보충제
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit	New England Biolabs	E2040	인비트로 전사(IVT) 키트
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	21083027	발광 측정 중 HEK293-LgBiT 배양에 사용되는 배지
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030-024	DMEM에 첨가되는 보충제
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778150	지질 기반 transfection 시약
Lithium Chloride Precipitation Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9480	IVT 후 mRNA 정제를 위한 대체 방법
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1130	플라스미드 선형화 후 정제 키트
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	DNA 및 mRNA 농도 정량에 사용되는 분광광도계
Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate	Promega	N2570	L-15 배지에 첨가되는 발광 필요 기질
NucleoSpin RNA Cleanup Kit	Macherey-Nagel	12708612	IVT 반응 후 mRNA 정제용
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Fisher Scientific	136101	HEK293-LgBiT 플레이팅 및 후속 측정에 사용되는 플레이트
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection 반응에 사용되는 배지
Phusion High-Fidelity PCR Kit	New England Biolabs	E0553	PCR 키트
RiboRuler High Range RNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	11883993	겔 전기영동용 RNA 래더
RNaseZap	Thermo Fisher Scientific	R2020	RNase 오염 제거 스프레이
TRIZMA Base	Sigma-Aldrich	T6066	TAE 버퍼 성분
Trypsin-EDTA Solution	Sigma-Aldrich	T4174	세포 해리 시약
UltraPure DNase/RNase free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977035	템플릿 준비 및 IVT용